FG 라 검색 술 Cancro (IG 2016Id.18842) 당 예술 슈퍼컵, Cariplo 재단 (그랜트 2014-0655), 그리고 피코 가정과 라 검색 Biomedica (FRRB) 당에 의해 지원 됩니다. 어제는 NIH 그랜트 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 그랜트, 하버드 의료 학교 밀 튼 발견 CCFA 수석 연구 상 (412708), 엘 레 노어, 마일 해안 지원 50 주년 친목 프로그램, 및 Cariplo 재단 ( 2014-0859).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 승인 되었고 어린이 동물 자원의 부의 감독 아래 운영 병원 (아치) 보스턴 아동 병원에서 또는 이탈리아에 의해 승인 되었다 보건 기관 동물 관리 위원회 밀라노-Bicocca의 대학에서 수행 하는 고.
1. C. albicans 준비
<ol><li>문화 C. albicans, 스트레인 CAF3-113, 25 ° c.에 uridine (50 mg/L) 보충 풍부한 매체 (효 모 추출 물 펩 포도 당 (YEPD), 1% (w/v) 효 모 추출 물, Bacto 펩, 포도 당 2% (w/v)의 2% (w/v))를 포함 하는 튜브에 이러한 조건에서 C. albicans 는 효 모로 자 랍니다. 참고: 다른 C. albicans 변종 사용할 수 있습니다, 같은 임상 분리 C. albicans 스트레인 SC531413. 이후 우리는 최근 궤 양성 과정은 타고 난 면역 계통14, 이론적으로 세포 벽 구성 요소와 구조를 유지 하는 모든 C. albicans 스트레인의 활성화에 의해 유도 된 증명 하고있다 뿐만 아니라 hyphal 계획을 시작 하는 기능을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>셀 카운터 분석기를 사용 하 여 세포 농도 계산 하 여 문화를 모니터링 합니다.</li>
	<li>약 8 x 106 셀/mL의 농도 도달 하면 문화를 수확. 또는, OD600을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 참고: 일반적으로, OD600 의 값 = 1 ml/3 x 107 세포, 효 모 농도에 해당 하지만 적정 권장.</li>
	<li>HEPES (50 m m, pH 7.5)를 사용 하 여 버퍼 에이전트로 YEPD uridine 매체에 문화를 resuspend 하 고 균의 형성을 유발 하는 37 ° C에서 문화를 품 어. 100 배 확대에 현미경 hyphal 형성을 확인 하십시오. 37 ° C에서 배양 후 hyphal 형성은 보이는 5 h 그러나, 사용 하 여 셀을 16 h 37 ° C에 외피 후 hyphal 비율 총 문화의 거의 95%에 도달 하면.</li>
	<li>더 풍요롭게 hyphal 농도에서 준비, 5 분을 위한 3300 x g에서 문화 원심 분리기 aliquots 삭제는 상쾌한 고을 1 x 108 균/mL의 농도에서 살 균 PBS에 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>2. 깊은 피부 주입
<ol><li>24 시간 사전 감염 절차 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐를 anesthetize 하 고 전기 클리퍼를 사용 하 여 마우스의 측면을 면도. 참고: 후 마 취를 포함 하는 모든 프로시저를 놓습니다 난방 램프 아래 쥐 그들은 효율적으로 복구 될 때까지.</li>
	<li>24 h 쉐이 빙 과정 어떤 염증 방지를 위한 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>면도 수술 후 24 h anesthetize 케 타 민 (80-100 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주사와 쥐.</li>
	<li>쥐 취 깊이 되도록 발 반사를 확인 하십시오. 단단히 발을 곤란 하 게 하 여 발 반사를 평가 합니다. 마 취를 달성 하는 경우 동물 통증을 느끼지 않습니다 하 고 이동 하지 않습니다.</li>
	<li>C. albicans 균 50 µ L/주입, 해당 5 x 106 균/주입 하의 마지막 볼륨에 30 G x 8 m m 바늘으로 0.3 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 깊은 더 마에 주사.<ol>
<li>면도 측면의 피부를 당겨 긴장 된 손가락 두 개를 사용 하 여 깊은 더 마에서 직접 볼륨을 주입 합니다. 향하도록 하는 바늘의 경사와 10-15 °의 각도와 바늘을 삽입 합니다.</li>
		<li>이 각도와 약 300-500 µ m의 깊이와 병원 체를 주입 됩니다. 주사는 잘 수행 되도록 확인 주입 된 볼륨은 범프 형성 흡수 몇 분 주사 후. 참고: 범프 형성 후 주사 약 1 c m2의 있을 것입니다. 이것은 분자 또는 조직학 분석을 위해 지정 된 시간 지점에서 제거 될 것 이다 지역입니다.</li>
		<li>범프는 사출 형성 후 흡수, 몇 분 동안 지속 되 고 있기 때문에, 시간 점이 24 시간 보다는 더 적은 (권장)의 마커 펜으로 감염의 영역을 표시 합니다. 24 시간 이상의 시간 포인트, 위 궤 양 또는 낭종은 명확 하 게 볼 수 있기 때문에이 단계, 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 수집 및 조직학 얼룩을 위한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사</li>
	<li>수술 용 집게를 사용 하 여 이전 마커 펜으로 표시 된 삽입 된 사이트의 테두리에서 피부를 당겨. 수술가 위를 사용 하 여 표시 된 라인을 따라 피부를 절단 하 여 감염 된 사이트를 삭제할. 참고: 라운드 팁이 위를 사용 하 여 복 막에서 피부를 분리 하는 주의 해야 합니다.</li>
	<li>일회용 기본 몰드 향하도록 피부의 내부 측면으로 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물, 가득한 피부에 젖어. 화합물 흰색 될 때까지 액체 질소에 샘플을 동결. 이 샘플을 손상 것으로 완전히 고정 하기 전에 샘플을 커버 하는 액체 질소 하 게 하지 마십시오 . 참고: 주의! 3.3 단계 동안 액체 질소에서 보호를 위해 얼굴 방패를 착용.</li>
	<li>샘플 슬라이드 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우 빠르게-80 ° c.에 저장 참고: 샘플을 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한.</li>
</ol>4입니다. 슬라이드의 준비
<ol><li>샘플 샘플의 센터에서 출발 하는 조직학에 대 한 슬라이스를 준비 하는 반으로 잘라.</li>
	<li>잘라 5 µ m는 cryostat와 두꺼운 조각. 참고: 피부 샘플는 cryostat의 온도 하지 보다 클 수-25 ° c. 더 높은 온도 H-10 월의 부분적인 녹는 원인과 따라서 샘플 것 유지 되지 않을 올바른 위치에 절단 절차 동안.</li>
	<li>충전 된 현미경 슬라이드를 사용 하 여 슬라이스를 수집.</li>
	<li>준비 후 곧 수집 된 분할 영역을 사용 하지 않는 경우-20 ° c.에서 그들을 저장합니다 이 시점에서, 조각은 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.</li>
</ol>5. 되며 & 오신 얼룩
<ol><li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 4 분 세척에 대 한 길의 hematoxylin에 침수에 의해 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>1 분에 오신 Y 솔루션에 집중 하 여 슬라이드 실행 5 분 린스에 대 한 수돗물 사용 하 여 슬라이드에 슬라이드 세척 얼룩 프로토콜을 계속 하기 전에 증류수.</li>
	<li>순차적으로 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 80%, 95%, 100%)의 농도 증가에 침수에 의해 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 각 에탄올 솔루션에서 s.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>40 X 확대 현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>6. 정기 산 Schiff (PA) 얼룩
<ol><li>1 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드 1 분 세척에 대 한 실 온에서 ≥99.5% 아세톤과 슬라이드를 수정 합니다.</li>
	<li>얼룩 슬라이드 주기 산 솔루션 (1 g/dL)에 침수에 의해 5 분 세척에 대 한 증류수 3 변경에서 슬라이드.</li>
	<li>5 분 동안 수돗물을 실행에 슬라이드에 Schiff의 시 약 15 분 세척에 대 한 침수로 슬라이드를 얼룩.</li>
	<li>5 분 씻어 30 수돗물 실행에 슬라이드에 슬라이드 길의 hematoxylin에 침수에 의해 얼룩 s.</li>
	<li>100% 에탄올의 3 변화에 집중 하 여 슬라이드를 탈수. 15에 대 한 슬라이드를 담가 s 각 시간.</li>
	<li>조직학 개간 에이전트에 침수에 의해 적어도 2 분 동안 슬라이드를 선택을 취소 합니다.</li>
	<li>장착 매체와 커버 전표를 사용 하 여 슬라이드를 탑재 합니다.</li>
	<li>현미경 슬라이드 스캐너와 슬라이드의 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>7. 샘플 수집 및 RNA 추출에 대 한 준비
<ol><li>제도적 절차에 따라 마우스를 안락사 3.2 단계에서 피부 샘플을 제거 합니다.</li>
	<li>산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 시 약의 1 mL 2 mL 스냅 캡 튜브에 샘플을 담가. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플-80 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>약 0.2 c m2 외과 집게를 사용 하 여 조각으로 샘플을 잘라. 참고: 주의! RNA 분리 시 약의 대부분은 독성 및 돌연변이. 증기 두건에서 수행 되어야 7.3 및 7.4 단계 해야 합니다 .</li>
	<li>또는 20 분에 대 한 20 진동/s의 속도로 비드 밀와 함께 샘플을 부 술, 기계적 포터를 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플의 효과적인 균질 피부 그대로의 존재를 찾아 확인 합니다. 샘플은 완전 하 게 균질 하지 경우이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>원심에서 16000 x g 1 분 유지에 대 한 샘플 RNA 추출 supernatants 고 펠 릿을 삭제. 이 단계는 머리와 추출 열을 차단할 수 있는 파편을 제거 하기 위해 수행 됩니다.</li>
	<li>RNA 추출 RNA 정화 열14를 사용 하 여 계속 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 RNA 정화 및 농도 평가. RNA 추출 cDNA 준비를 위해 즉시 사용 하지 않는 경우-80 ° c.에 샘플 저장</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Candida+infections.">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li><li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice.">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li><li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -. Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li><li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response.">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li><li>Leoni, G., Neumann, P. -. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans.">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li><li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems.">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li><li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+Skin+Abscess+in+a+Heart+Transplant+Recipient.">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li><li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+danger+theory:+20+years+later.">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287 (2012).</li><li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+play+in+four+acts:+Staphylococcus+aureus+abscess+formation.">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 C. albicans 감염 깊은 더 마에 곰 팡이 입구를 따라 시작 된 염증 과정을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
피부 농 양 형성 C. albicans 감염15시 상대적으로 드문 경우 이지만, 직접 깊은 더 마에에서 곰 팡이의 주입 수 선 구동 농 양 형성의 연구 뿐만 아니라 특정 면역의 분석 곰 팡이 확산을 포함에 참여 하는 셀입니다. 여기에 설명 된 방법으로 그것은 기계적 손상이 나 상처에 어떤 선 동적인 응답을 피하 면 서 곰 팡이 확산을 제어 하는 중요 한 면역 세포의 채용 뿐 아니라 면역 세포, 사이 상호 작용을 공부 하 형성입니다. 실제로, 상피 구조를 그대로 유지 가능성은 마모와 같은 기계적 자극에 의해 발생 하는 염증 성 환경 개발을 피하기 위해 중요 하다. 199416폴 리 Matzinger에 의해 처음으로 이론로 손상 신호 수 있습니다, 그리고 사실, 면역 반응을 활성화 하 고, 따라서 potently elicited 병원 체에 의해 면역 반응에 영향을 미칠.
피해 관련 된 분자 패턴 (DAMPs) 죽은 세포에서 발생 한 수 있습니다 하지만 그들은 또한 스트레스 조건 하에서 발표 하실 수 있습니다. 조직 손상의 상황에서 이러한 신호를 생성할 수 있다, 이후 상처의 감염의 맥락도 전에 선 동적인 하이퍼 환경을 발생할 것 이다. 우리가 설명 하는 방법을 DAMPs의 릴리스를 제한 하 고 따라서 요소를 혼동의 존재를 감소 시킨다.
또한, 깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주입은 곰 팡이 감염에 대 한 뿐만 아니라 세균도 전에 대 한 사용할 수 있는 방법입니다. 또 다른 병원 체의 피부 모두의 경우 높은 번호에 대 한 책임 그리고 혈 류 감염 포도 상 구 균4. 우리는 최근에 어떻게이 프로토콜은 또한 S. 구 균 감염14를 공부 하는 중요 한 도구입니다 나타났습니다. 특히, S. 구 균 신체17의 여러 지역 농 양 형성 하는 기능에 대 한 클리닉에서 알려져 있다. S. 구 균 주사 깊은 더 마에 농 양, S. 구 균 에 의해 구동 하는 매우 초기 이벤트의 연구는 치유 하는 면역 반응의 참여 뿐만 아니라 발생 하는 동시에 활성화의 형성에 이르게 단계입니다.
마지막으로, 여기에 설명 된 방법론의 또 다른 중요 한 특징은 상피 구조는 유지 면역 세포의 지역화 될 수 있는 다른 통로의 활성화에 조직학 분석을 가능성을 제공 합니다. 공간 들 에게만. 이러한 실험 조건 하에서 사실, 피부의 다른 해 부 구조는 변경 되지 않습니다 하 고 면역 세포와 염증 성 중재자는 정확한 위치에 구상 될 수 있다.
면역 세포의 공간 배급을 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 따라서 곰 팡이 및 세균성 피부 감염 시 각 세포 유형의 역할 이해 하기 이상적입니다.

인체는 미생물의 매우 높은 숫자를으로 덮여 있다. 피부 표면1평방 센티미터 당 거의 1 백만 박테리아의 서식 지입니다. 그러나,이 숫자 colonizes 피부 미생물의 전체 다양성을 반영 하지 않습니다. 박테리아, 뿐만 아니라 인간의 신체는 모두는 점 막과 피부 레벨2에서 살아남을 수 한 C. albicans를 포함 하 여 많은 곰 팡이 종에 의해 식민지 이다.
최근 몇 년 동안, 균 감염으로 진단 하는 사람의 비율이 엄청나게 증가 했다. 이것은 주로 immunocompromised 명, 즉, HIV 양성 환자와 환자 화학 요법 또는 면역 억제 약을 통해 이식3후 간 높은 수 있습니다. 미국에서 수행 하는 감시 연구, Wisplinghoff 그 외 여러분 병원내 혈 류 감염의 9.5 %Candida 종4에 의해 발생 했다 보여주었다. 증가 발생 곰 팡이 감염, 그리고 특히 칸디 다 종의 혈 류 감염 시 발견의 높은 비율 때문에, 때문에 매우은이 병원 체는 면역 시스템의 제어를 탈출 하는 어떻게 이해 중요 한.
C. albicans 동종이 형 균 류 효 모, blastospores, pseudohyphae,5환경 조건 따라 균 등 다른 형태학 형태로 성장 하는. Hyphal 형태의 C. albicans 높은 침해 용량을 보여줍니다 하 고 상피6을 관통 하는 기능이 있다.
C. albicans 감염 여러 가지 실험 방법을 사용 하 여 연구 되었습니다. 감염의 가장 일반적인 모델은 C. albicans 효 모7의 정 맥 주입. 그러나,이 모델 받지 않는다 고려 사항으로 모든 프로세스는 일이 혈 류로 확산 하는 곰 팡이 관리 하기 전에. 또 다른 모델은 상피를 침입 하는 C. albicans 의 기능을 활용 합니다. 이 방법, 일컬어 모래 종이 모델8, Gaspari 외. 19989에 의해 개발 되었다 그리고 C. albicans를 적용 하기 전에 따라서 지층 corneum 를 제거 피부를 침식을 모래 종이 사용 하 여 구성 됩니다. 이 절차에 따라서이 병원 체의 침입 능력의 분석을 사용 하는 상피 세포를 침투 하는 곰 팡이 수 있습니다. 마지막으로, 위장10 및 호흡기 책자11 를 위한 감염의 다른 모델 다른 연구에 사용 되었습니다.
(모래 종이 모델)로 상처의 형성 등 면역 세포 모집 활성화,12치유 과정 촉진 하기 위하여 여러 경로의 활성화를 하면 됩니다. 이 중 하나 변경 하거나 결과 혼동 하는 병원 체에 대해 특별히 elicited 면역 응답 마스크 수 있습니다.
여기 피부 감염을 초기 상처 형성을 방지 하는 방법 및 기저 선 동적인 환경 유도 설명 합니다. 그대로 상피 구조를 유지 하려면 우리는 직접 깊은 derma에 hyphal 형태로 C. albicans 주사. 염증의 금액 제한 및 제한 단일 주입 가벼운 염증 유도 수 있습니다, 비록 모래 종이 모델에서 열린 상처의 형성에 비해. 우리가 여기에 설명 하는 방법 곰 팡이 감염을 피하 면 서 기계적 손상으로 인 한 과도 하 고 기존의 염증 성 환경 확산 면역 반응의 연구를 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4053L</td>
			<td>warm in 37 &#176;C bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-OCT compound</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gill&#39;s Hematoxilyn</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-178-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y solution, alcoholic</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>09-209-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>scharlau</td>
			<td>ET00232500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citro-HISTOCLEAR</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>R0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt, mounting medium</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAS staining system</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>395B-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>8451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Applichem PanReac</td>
			<td>A1070,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes 2 mL</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30121597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Wear eye protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter-Particle Count</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5415 R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC 3000 Microtome Cryostat</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLiser</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base mould disposable</td>
			<td>histo-line laboratories</td>
			<td>2781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged bio microscope slides</td>
			<td>bio-optica</td>
			<td>09-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips 24 x 50 mm</td>
			<td>thermo scientific</td>
			<td>11911998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep dermal injection as a model of candida albicans skin infection for histological analyses

피부는 신체의 매우 확장 된 기관이 고,이 큰 표면 때문에 미생물을 지속적으로 노출 되. 피부 손상을 쉽게 혈 류로 병원 균의 보급에 차례 차례로 귀 착될 수 있다, 진 피에 감염 될 수 있습니다. 어떻게 면역 체계 싸움 감염 초기 단계와 어떻게 호스트 병원 체를 제거할 수 있습니다 이해 미래 치료 개입에 대 한 설정 하는 중요 한 단계입니다. 우리가 Candida albicans 감염 병원 체 면역 반응 elicited C. albicans에 의해로 서 상피 장벽을 통과 하는 때를 포함 하 여, 감염 동안 일찍 발생 하는 프로세스를 시각화 수 있는 모델을 설명 하는 여기 내 습. 우리는 피부 뿐 아니라 존재 및 병원 체의 지역화에 침투 하는 면역 세포를 표시 하는 조직학 분석을 수행 하기 위해이 감염 모델을 사용. 샘플 수집 후 감염 RNA 추출 처리 될 수 있습니다.

깊은 더 마에서 직접 병원 체의 주사를 통해 조직 구조 형태는 그대로 (그림 1A)를 남아 있습니다.
피부 구조 무결성의 유지 관리는 면역 세포의 탐지 및 감염의 사이트에 그들의 지 방화를 허용 한다. 그림 1B 에서 표시 하는 높은 배율이 보여준다 농 양 감염의 사이트에 그것의 감 금으로 병원 체의 확산을 포함 하는 polymorphonuclear 백혈구 (PMCs)의 주로 구성 되어있다. PMCs, 호 중구, 등 모집 조직14내 곰 팡이의 확산 따라서 피하 농 양 형성을 허용 한다. 높은 배율 (그림 1 c, D) 농 양의 주변 지역 또한 PMCs에 농축 방법을 보여줍니다.
구조적 무결성을 유지 하 여 감염 동안 병원 체의 지역화를 확인할 수 있습니다. C. albicans, 병원 체의 식별의 세포 벽 다 당 류의 높은 콘텐츠의 활용 수행 되었다 우선권 얼룩, 사용 하는 곰 팡이 게 보라색-마젠타 색상. 그림 2A같이 우선권 얼룩이 명확 하 게 병원 체 granulocytes14의 채용에 의해 형성 된 농 양 안에 국한 됩니다 보여 줍니다. C. albicans (그림 2B), 더 높은 확대에 명확 하 게 표시 되 고 괴 사 성 및 면역 세포에 의해 포위 될 것.
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 시간이 지남에 따른 염증과 감염 과정을 다음 수 있습니다. 매우 시작, 면역 세포에서 모집 (그림 1A 및 그림 3A)는 농 양 형성으로 이어집니다. 피부 조직의 분석까지 연장 했다 때 48-72 h, 피부 구조의 파괴, 흉터의 형성을 가시화 했다 (그림 3B, C). 이 구조 형성은 병원 체14의 퇴 학에 나오는 치유 단계 때문입니다.
궤 양 형성에 이르게 하는 프로세스는 감염 후 몇 일 동안 다음 수 있습니다. 그림 4A같이 야생-타입 마우스 C57BL/6 시간이 지남에 따라 증가 하는 궤 양성 프로세스를 표시 합니다. 약 70-80%는 쥐의 감염 후 궤 양이 72 h의 형성 표시. 실험적인 다양성으로 인해 적어도 8 쥐 모든 실험에 사용 되어야 한다. 통계 분석을 위해 다른 genotypes 또는 치료를 비교 하는 경우 각 궤 점수에 대 한 8-10 쥐의 최소 사용 하는 것이 좋습니다. 이 경우에 작은 차이 표시 되어야 합니다. 궤 양성 과정의 설명을 그림 그림 4B에 표시 됩니다. 특정 치료 또는 유전자 결함, 궤 양 형성 감소 될 수 있다/또는14폐지. 경우에 따라 궤 양, 대신 낭종 형성 된다, 그림 4C에서 볼 수 있듯이.
되며 & 오신 및 우선권 얼룩, 슬라이드 얼룩이 질 수 있다 어느 특정 세포 마커 또는 다른 immunohistochemical stainings 더 나은 시각화와: 콜라겐 섬유; cytokine/발산 위치 조직; 면역 세포 정체성 그리고 공간 배급입니다.
조직학 준비 뿐만 아니라 샘플 분자 분석에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 전체 주입 사이트 excised 조직학 준비에 관해서는 하 고 RNA 추출에 대 한 처리 수 있습니다. 조직에서 RNA 추출 연구 및 병원 체와 감염 하는 동안 그 유전자 upregulated의 식별 수 있습니다. 분자 분석에 대 한 샘플을 처리 하는 데 가능성은 조직학 분석을 하기 위해서는 더 나은는 중요 한 도구를 특성화 elicited 병원 체와 초기와 후반 단계 동안에 그것의 규칙에 대 한 면역 반응의 종류 후에 도전14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig1.jpg"> 그림 1: 피부 형태학 및 세포질 지 방화의 유지 보수. (A) 모든 레이어가 유지 됩니다. 상피, adipocytes, 및 근육 세포를 쉽게 인식할 수 있습니다. (화살표가 강조) (B) Polymorphonuclear 백혈구 농 양 내에서 확인할 수 있습니다. (C, D) 높은 배율 농 양 주변 지역에서 polymorphonuclear 백혈구 (화살표)의 존재를 보여줍니다. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig2.jpg"> C. albicans의 그림 2: 식별. (A) C. albicans 파스 얼룩과 조직 내에서 검출 될 수 있다. 더 나은 자주색, 얼룩 곰 팡이 시각화 (B) 높은 확대 농 양 안에 국한. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig3.jpg"> 그림 3: 염증 과정의 후속. (A) C. albicans 주입 하 여 elicited 염증 과정의 처음에서 granulocytes 병원 체를 제한 하려면 농 양을 형성 하기 위하여 모집. (B, C) 궤 양이 형성은 곰 팡이의 퇴 학에 대 한 필요 합니다. 치유 조직 그리고 피부 구조 무결성에 변경 특징은 흉터의 형성으로 이어질 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57574/57574fig4.jpg"> 그림 4: 궤의 활동. (A) 궤 양성 과정 감염 후 첫 번째 일 동안 증가의 추세는 다음과 같습니다. 감염 후 72 h, 쥐의 70-80%는 감염의 사이트에 궤 양이 보여 줍니다. 16 C57BL/6 야생 타입 동물 사용 되었다. (B) 궤 양 감염 후 48 h 개발의 설명 사진. (C) 감염 후 낭종 형성의 설명 사진. <a href="/files/ftp_upload/57574/57574fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

깊은 피부 주입으로는 모델 조직학 분석 Candida albicans 피부 감염의

여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

10.7K 조회수.  University of Milano-Bicocca. 여기는 Candida albicans 피부 주입 후 피부 샘플의 조직학 및 분자 분석을 허용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜 피부의 구조적 무결성을 유지 하 고 병원 체 분포 및 조직 상주 또는 새로 채용 면역 세포의 지역화에 대 한 수 있습니다.

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

모니터링 형성과 Antifungal 자화율 테스트를위한 96 자 Microtiter 플레이트 기반 방법 캔디다 albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

열 등 한 베 나 정 맥의 협 착 증: 깊은 정 맥 혈전 증의 Murine 모델

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of experimental models needs to be as rigorous as that applied for human samples. Indeed, drawing reliable and accurate conclusions is critically influenced by the quality of tissue section preparation. Here, we describe a protocol for histopathological analysis of murine tissues that implements several automated steps during the procedure, from the initial preparation to the paraffin embedding of the murine samples. The reduction of methodological variables through rigorous protocol standardization from automated procedures contributes to increased overall reliability of murine pathological analysis. Specifically, this protocol describes the utilization of automated processing and embedding robotic systems, routinely used for the tissue processing and paraffin embedding of human samples, to process murine specimens of intestinal inflammation. We conclude that the reliability of histopathological examination of murine tissues is significantly increased upon introduction of standardized and automated techniques.

Lack of standardization for murine tissue processing reduces the quality of murine histopathological analysis as compared to human specimens. Here, we present a protocol to perform histopathological examination of murine inflamed and uninflamed colonic tissues to show the feasibility of robotic systems routinely used for processing and embedding&#160;human samples.

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic growth of C. albicans SN425, the inoculums grew on Yeast Nitrogen Base media. For biofilm formation, RPMI 1640 media, which have high concentrations of amino acids, were applied to help biofilm growth. Biofilms of 48 h were treated twice a day for a period of 1 min with a non-coherent light device (red light; wavelength = 635 nm; energy density = 87.6 J&#183;cm-2). As a positive control (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) was applied, and as a negative control (NC), 0.89% NaCl was applied to the biofilms. Colony forming units (CFU), dry-weight, soluble and insoluble exopolysaccharides were quantified after treatments. Briefly, the protocol presented here is simple, reproducible and provides answers regarding viability, dry-weight and extracellular polysaccharide amounts after red light treatment.

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Here, we present a protocol to assess the outcome of red light application on the growth of Candida albicans biofilm. A non-coherent red light device with the wavelength of 635 nm and energy density of 87.6 J&#183;cm-2 was applied throughout the growth of Candida albicans biofilms for 48 h.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...