이 작품은 도이치 가운데 SFB688 (ag는)에 의해 지원 되었다.

마우스 사육 Regierung 인 운터 프랑 켄에 의해 승인 되었다 그리고 모든 분석 모든 독일과 유럽 연합 해당 법률 및 규정 관리 및 실험 동물의 사용에 따라 실시 했다.
1. 결정의 코팅 전 Utero Allantois Explant 문화에 대 한 α4β1 Integrin와 플레이트
<ol><li>멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 200 µ g/mL에서 동결 건조 된 murine α4β1 integrin reconstitute 미리 데워 진된 (37 ° C) PBS에에서 10 µ g/mL의 최종 농도에 희석. 피 펫 20 µ L/결정 플레이트 (1 allantois/잘)의 우물의 필요한 수에 희석된 α4β1 integrin 솔루션의 음. 참고: 결정 접시의 우물을 코팅 할 때 기포의 형성을 피하십시오.</li>
	<li>습도 조직 문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 37 ° C에서 60 분에 대 한 결정 번호판을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 발음 한 피 펫과 상쾌한. 부드러운 흡입을 사용 하 고 경사 접시 피 펫 팁 잘 하단을 만지지 마십시오. 두 번 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체와 같은 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)의 50 µ L을 추가 하 여 우물을 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>중요 한 단계: 블록 무료 50 µ L / 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 음을 추가 하 여 사이트 바인딩 / DMEM 습도 조직 문화 인큐베이터에서 결정 접시를 두어서 ≥ 37 ° C에서 30 분 품 어 및. 참고: Allantois explants는 혈 청의 다양 한 표면에 첨부할 수 있습니다. 일반적인 바인딩 사이트를 차단 하는 것이 필수적 이므로, 코팅 후 웰 스 integrin, 그리고 대 한 해 부 allantois를 추가 하기 전에 포함 하는 혈 청에서 문화 explant 중간 (단계 4.4 참조).</li>
	<li>4.4 단계에서 필요할 때까지 37 ° C에서 차단 솔루션에 코팅된 우물을 유지.</li>
</ol>2. 자 궁 해 부 Dpc 8에서 임신 마우스에서
참고: 체중 증가 차별15거짓 양성 임신 율을 줄일 수 있습니다.
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 희생. 70% (v/v) 에탄올을 분사 하 여 복 부 지역에 코트를 소독. 참고: 마우스를 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다. 마 취약 없이 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 allantois allantois 첨부 파일을 방해할 수 있는의 화학 오염을 방지 합니다.</li>
	<li>가 위는 중간에 작은 절 개를 하 여 복 부 피부를 엽니다. 피부 절 개, 위아래를 gloved 손가락을 사용 하 고 가슴과 마우스의 꼬리 쪽으로 떨어져 피부를 당겨.</li>
	<li>집게와 복을 파악. 다른 한편으로는, 만들어 앞쪽에서 V 자형 절 개 후부 쪽으로 위를 사용 하 여와 이동 멀리 복 부 구멍을 노출 하는 조직. 집게를 사용 하 여 자 궁에 액세스 내장 한쪽으로 밀어.</li>
	<li>두 개의 자 궁 뿔을 찾습니다. 집게와 자 궁 경부 (꼬리 세그먼트)를 누른 괜 찮 아 요가 위 인 대를 잘라. 그런 다음가 위는 oviducts severing 모두 자 궁 뿔 분리 합니다.</li>
	<li>실내 온도 (RT) PBS 살 균, 멸 균 10cm 요리 포함으로 궁 전송 집게를 사용 합니다. 지방 조직, 혈관, 신경 주변 미세 집게 /가 위 (그림 1A)와 자 궁 뿔을 제거 합니다.</li>
</ol>3. 태아의 해 부
참고: 8:1 확대/축소 범위를 갖춘 stereomicroscope에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>가 위는 배아 이식 사이트 사이 절단 하 여 구분 합니다. 집게와 자 궁 싹의 근육 자 궁 안 대기를 잡고 고 (그림 1B) decidua 노출 떨어져 그것을 끌어.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 전송 궁 싹 살 균, 포함 된 새로운 10 cm 접시에 RT PBS.</li>
	<li>태아 주위 decidua 집게의 끝을 함께 해결.</li>
	<li>절 개는 decidua의 안티-mesometrial에 좋은 집게 (그림 1C)와 고 껍질에 decidua 멀리 배아 (그림 1D)를 노출 하는 집게와. 참고:는 decidua의 mesometrial 극 높은 나가도록 하 고 태아를 포함 하 고 더 창백한 나타납니다 안티-mesometrial 부분 보다 그것의 기초에 넓은 수 있습니다.</li>
	<li>집게 (그림 1E, F)와 태아를 해 부.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여, 살 균 3.5 cm 접시에 포함 된 메 마른 PBS의 한 방울으로 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여 동일한 3.5 cm 접시에 PBS의 신선한 방울에 배아를 전송 하 고 집게 (그림 1G, H)를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 태아를 해 부.</li>
	<li>필요에 따라 필요한 경우 (예를 들어, 연쇄 반응에 의해 유전형), 전송 노른자위 낭 무 균 튜브에와 그것을 발음 하 여 ~ 큰 구멍 200 µ L 피 펫 팁으로 5 µ L PBS. -20 ° c.에 게 참고: 노 른 자 삭 준비를 오염 시킬 수 있는 모성 조직 (즉, 정수 리 른 sac Reichert의 막과 ectoplacental 콘 포함) 잘못 된 유전형 결과 발생할 수 있습니다. 이러한 직물의 제거는 노른자위 낭에서 태아 해 부 전에 더 쉽습니다.</li>
</ol>4. allantois 해 부 및 고정된 α4β1 Integrin에 전 Utero 문화
<ol><li>좋은 집게 (그림 1 H)를 사용 하 여 태아의 뒤 끝에는 기저 삽입 사이트에서는 allantois를 잘라.</li>
	<li>필요에 따라 발달 준비 해야 하는 경우에 somite 쌍 태아의 검사 단계 대조 광학 및 5 ×, 10 × 목표와 현미경을 사용 하 여 계산. 참고: 태아 somite 계산을 촉진 하기 위하여 집게로 확장할 수 있습니다. Chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전 ≥ 6 somite 쌍 태아에서 E 8.0과 9.0 E 간에 발생합니다. 도 6-8 somite 쌍 태아에서 시작 된다.</li>
	<li>피펫은 40 µ L / 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청, L-글루타민, 항생제 미리 코팅된 결정 플레이트 웰 스 (섹션 1을 참조)의 필요한 수에 보충 DMEM의 음.</li>
	<li>그것을 발음 하 여 부동 allantois 수집 ~ 200 µ L 피 펫 팁의 큰 구멍으로 5 µ L PBS. 전송 1 allantois/잘.</li>
	<li>예를 들어에 대 한 습도 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에서 결정 플레이트를 배치 하 여는 allantoides를 품 어 6, 12, 및 24 시간. Allantois 부착을 가진 방해를 방지 하기 위해이 시간 포인트 사이 결정 접시를 이동 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시간 점에서 점수 allantois 첨부 파일 (예를 들어, 없음 첨부 파일/부동 allantois; 부분적으로 또는 완전 하 게 연결 된 allantois; 완전히 확산 allantois) 갖춘 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 광학 현미경을 사용 하 고 5 × 또는 10 × 목표 (그림 2). 참고: 갓 격리 하 고 완벽 하 게 연결 된 allantoides의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다. Utero ex, wildtype C57BL/6J 쥐에서 분리 된 allantoides의 원심 끝에 4-6 h (이 라고 하는 allantois의 부분 첨부), 내 연결 및 전체 allantois의 전체 첨부 파일 내에서 이루어집니다 ~ 문화 12 h. 18-24 h는 explant 평평 있으며 CD31-양성 혈관 총9,16원형 (완전히 확산 allantois 함) 가정.</li>
</ol>5. 확실 한 내 피 세포 마커 CD31 위한 Explanted Allantois의 얼룩
<ol><li>완전히 확산 explants의 문화 매체를 발음 하 고 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 셀을 해결. 참고: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑 및 피부와 눈 접촉을 피하기 위해 안전 고글을 착용 합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 incubate 다음은 상쾌한 발음. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>세포를 permeabilize 40 µ L/잘 PBS의 추가 의해 두 번의 0.1% (v/v) 트리톤 X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) 정상 염소 혈 청 PBS에서 실시간 세척에서 30 분 동안 40 µ L/잘 추가 하 여 비 특정 바인딩 사이트를 차단 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 하룻밤이 시점에서.</li>
	<li>밤새 4 ° c.에 셀 기본 안티-CD31 항 체의 20 µ L/잘 희석 0.1% (w/v) BSA/PBS에에서 1시 50분을 추가 하 여 얼룩 PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 붙일 레이블 보조 염소 반대로 쥐 항 체 희석된 1: 200의 0.1% (w/v) BSA/PBS 배치 하거나 알루미늄 호 일에 포장 하 여 빛에서 실시간 보호 결정 접시에서 1 시간에 대 한 어두운 챔버에 추가 하 여 바운드 기본 항 체를 감지 합니다. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 장착 매체의 추가 하 여 셀을 포함 합니다. 에 품 어 ~ RT 설치 매체에는 경화 될 때까지에 1 시간. 빛 으로부터 보호 4 ° C, 또는 RT에서 결정 접시를 저장.</li>
	<li>이미지는 allantois의 혈관 총 explants는 5 × 또는 10 × 목표와 적합 한 형광 필터 형광 현미경. 참고: 완전 확산 allantois의 CD31-양성 혈관 총의 대표 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 항 체와 같은 혈관 신경 총에 대 한 다른 마커 Flk-1, Flt에 대 한 감독 잘16넥타이 또는 넥타이-2을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

저자는 공개 없다.

혈 청, fibronectin 같은 프로 접착제 기질 분자의 풍부한 소스는 존재 allantois explants는 다양 한 플라스틱, 유리, 또는 필터 표면9,16에 쉽게 연결 됩니다. 따라서, 수행된 분석 결과의 목표는 구체적으로 유전자 조작의 효과 조사 하는 경우 allantois 첨부 파일에 다른 치료 움직일 α4β1, 그것은 비 특정 바인딩 사이트 (예를 들어, 소 혈 청을 차단 하는 중요 한 알 부 민) 포함 하는 혈 청으로 잠복기 전에 integrin와 표면 코팅 후 미디어.
고정된 α4β1 integrin allantois explants의 초기 첨부 파일은 매우 민감한 운동, 그리고 조직 문화 접시 따라서 맡겨야 한다 그대로 미리 정해진된 기간 동안 (예를 들어, 12 h) allantois 득점 이전 첨부 합니다. Note는 안정적인 접촉에 필요한 시간은 기판 형성 따라 달라질 수 있습니다 분석된 마우스 스트레인 또는 고정된 α4β1 integrin의 농도.
세포 VCAM-1/α4β1-상호 작용의 성공적인 chorioallantoic 퓨전에 대 한 확고 하 게 설립된11,,1213입니다. 또한, fibronectin, collagens, 관심의 다른 분자와 세포 외 기질 분자 수 또한 움직일 수 있고 "chorio 모방" 기판으로 사용.
Chorioallantoic 첨부 파일 VCAM-1와 그것의 바인딩 파트너 integrin α4β1 작성 상호 작용에 따라 달라 집니다. Utero에서, chorioallantoic 첨부 파일 및 후속 퓨전만 발생는 allantois 있도록 충분히 확장은 chorion와 접촉. 특정 발달 단계에서 allantois 크기에 생리 적 변화를 감안할 때, chorioallantoic 첨부와 퓨전 사이 열릴 언젠가 E 8.0과 9.0 E (범위, 전자 7.5 E 9.25)14,16. Allantois 첨부 chorionic 접시에는 utero에 살아있는 마우스의 과도 과정에서 쉽게 사용할 수 있습니다 구체적으로 연구 하는 방법을 제공 합니다. 오히려, 분석 주로 예의 조직학 평가 의해 chorioallantoic 퓨전의 힘든 결정에 초점을, allantoic는 chorion의 표면에 단일에서 미로 레이어의 개발 확산, 미리 결정 시간11,12,13,16포인트. 이 끝점 분석을 장애인된의 첨부 파일은 allantois chorion chorion 종속 효과를 구체적으로 배아 발달 단계에서 내재 된 가변성에 의해 제한 하 고 allantoic 결함 사이 차별 수 없습니다. 크기입니다. 대표 결과에서 설명 했 듯이, allantois 크기에 생리 적 변화 chorioallantoic 융합에 상대적 지연 될 수 있습니다 ~ C57BL/6J wildtype 배아의 26%. 통계적으로 말하면, 거의 7 2 임신 쥐 되었을 것입니다 따라서 희생된 너무 일찍 (61 배아에서 7 개 새끼, 평균 담가 크기 8.7)는 상당한 대규모 연구에 대 한 초과 사육의 필요성으로 변환. 흥미롭게도, microsurgical 실험 그는 chorion 이미 1 somite 쌍 단계는 allantois와 융합 하는 능력이 고는 allantois 최대한 퓨전 용량 3-5 somite 쌍14배아에서 전시를 계시 했다. 따라서, chorioadhesive 세포는 allantois의 형성 되며 기능적으로 실제 chorioallantoic 첨부 파일 비보전에 관할. 고정된 ligands allantois 첨부의 utero 전 분석으로 여기, 따라서 상대적으로 독립적입니다 주어진된 allantois 크기의. 따라서,이 방법의 장점 중 하나입니다 그것 allantois 신장에 결함을 무시 하 고 태 반 형성, 즉, chorioallantois 첨부 파일에서 다음 단계에 초점을 맞추고 있다. 이 방법은 따라서 allantois 신장에 결함과 유전 마우스 돌연변이 첨부 파일 chorioallantois 구별 하 사용할 수 있습니다.
16입 피 펫 사용 하 여 태아를 첨부 지점에서 allantois 포부의 전통적인 방법, 달리 현재 프로토콜 수동 절단 방식을 사용 하 고는 allantois 이후에 큰 오리 피스 피 펫 팁을 사용 하 여 처리 . Allantois 포부의 중요 한 이점은이 방법을 직접 조직 처리 방지 이다. 절단 하 고는 allantois 조작 allantoic mesothelium의 외부 칼 집에서 chorioadhesive 셀 손상 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 집게는 allantois 절단 성공적으로 사용 되었습니다 전에 pre-placental 조직17, 문화 ex vivo에서 에서 그리고 allantoic explant 첨부의 활동 및 문화는 explant의 형태학에 설명 되어 있는 현재 연구는 포부16allantois 절연에 따라 게시 된 데이터와 비슷합니다. CD31-긍정적인 endothelia의 형성에 의해 표시 된 대로 이러한 결과 chorioadhesive 셀 allantois, 수동 절단 시 충분히 잘 보존 그리고 그 explant 차별화 조잡 한 불안정 하지 좋습니다. 직접 해 부만 상단 3 분의 2는 allantois VCAM-113, 표현 하는 가능성을 제공 합니다 또한는 allantois의 절단 그리고 노른자위 sac 파생 셀의 기지에서 트림 수 있을 수 있는 오염 보장 합니다 allantois 포부18후 allantois입니다.
전 utero의 분석 움직일 allantoic explant 접착 력, 재조합 α4β1 integrin 제공 chorioallantoic 퓨전, 즉, 세포 상호 작용에 필요한 하나의 중요 하 고, 초기 단계의 질적 판독 VCAM-1 사이 allantois, 표현 그리고 α4β1 integrin 지역화 chorionic mesothelium extraembryonic mesoderm에서 파생 되는. 그럼에도 불구 하 고, 비록이 두 접착 분자 chorioallantoic 융합에서 원리 선수로 인정 받고 있습니다 ~ VCAM-1 또는 α4 integrin에 녹아웃 homozygous 돌연변이와 배아의 50 %chorioallantoic 퓨전 vivo 에서11 를 받아야 할 ,1213. 이 불완전 한 penetrance, 때문에 비보 전 설명 하는 방법을 현재 프로토콜에는 chorioallantoic 융합의 실패와 유전자 모델에이 두 접착 분자에 대 한 요구를 배제 하는 충분 한 않을 수 있습니다.
생리 적인 조건 하에서 α4β1 integrins chorionic trophoblasts의 원형질 막에 포함 하 고 셀 셀 (및 세포-매트릭스) 접착 규제 협력 구조 및 신호 단백질의 복잡 한 네트워크에 통합 19.로 서는 대부분 reductionist 접근 체 외에서 chorionic VCAM 1 바인딩 인터페이스의 복잡성만 매우 제한 된 범위 내에 고정된 α4β1 integrin 여. 이 시스템에 그대로 chorion에서 파생 된 다른 중요 한 구조 또는 신호 입력의 잠재적인 부족, 게다가 그것은 엄밀 하 고, 2 차원 표면에 움직일 integrins의 일부 분 일 뿐인, 활성에 가능성이 바인딩 관할, "열기" 나 란입니다.
제시 방법 초기 첨부 파일 및 확산 단계는 allantois chorion에 근접 하 고 선박 대형9의 분석과 결합 될 때 allantoic 혈관 총의 개발에 대 한 보고서를 또한 수 있습니다. 그러나, 현재 접근 신생 allantoic 내 피 세포에 의해 중재를 돋 아 여는 chorion의 침공을 모델링 하지 않는 않습니다 그것은 chorioallantoic 퓨전을 위한 필수 과정 이다 chorion에 의해 분기 morphogenesis을 반영 하 고 placental 미로10의 후속 개발.
이미지 분석 자동화 단계 대조 또는 미분 간섭 현미경 검사 법 (semi-) 결합을 사용 하 여, 제시 방법 지연 또는 실패 한 allantoic 첨부 파일 체 외의 초기 분석에 대 한 대규모 스크린에 적용할 수 있습니다. 마우스 돌연변이의 분석 뿐만 아니라 메서드 allantoic 첨부 파일에 마약, 병원 체, 대사 산물, 또는 환경 대리인의 효과 화면에 관심이 있을 수 있습니다.
수많은 마우스 돌연변이, chorioallantoic 첨부 파일 발생, 일반적으로 발전 하는 allantois와는 chorion 표시 실패 합니다. 또한, 일반적으로 chorioallantoic 첨부 파일 결함을 보여주는 돌연변이 불완전 penetrance1,,210을 표시 합니다. 그것은 일반적인 분자 경로 및 세포질 과정이 기능적으로 분명히 매우 다른 유전자 영향 여부를 조사 하는 중요 한 것입니다. 마우스 돌연변이에서 파생 된 allantois explants의 라이브 영상 같은 메커니즘을 명료 하 게 가능성이 있다. 예를 들어 셀의 해 부 allantois 외부 칼 집에 분류 될 수 (DiI 또는 디오 닥터지 carbocyanine 추적기16,18) 등 중요 한 형광 염료와 이미지를 접착 및 이벤트, 확산 또는 셀을 추적 하려면 실시간에서 마이그레이션입니다. 또한, 골격 또는 접착 단백질을 시각화 형광 기자 유익을 증명할 수 있습니다.
최근에 비보 전 공동 문화 시스템 사전 첨부 murine allantoides 및 chorions에 대 한 설명 하고있다, 그리고이 접근 했다 성공적으로 chorioallantoic 첨부, 미로 레이어 후 발생 하는 이벤트를 조사 하는 데 사용 됩니다. 대형17. 다양 한 (예를 들어, 유전자 변형)에서 절연 고정된 chorions에 allantois 첨부 효율성 분석 마우스 모델 분자 선수와의 개발 초기 단계에 적용 되는 경로에 대 한 새로운 통찰력을 얻을 수는 murine 태 반입니다.

태 미 발달 성장과 자 궁 환경에서 개발을 위한 불가결 하지 않습니다. 그것은 내 분 비 및 면역 기관으로 산소, 대사 산물, 및 태아 및 산 순환, 그리고 또한 기능 간의 영양 교환을 위한 인터페이스를 구성합니다. Placental 발달을 손상 하는 내 인 성 또는 외 인 모욕 자궁내 성장 지체, 태아 손실, 또는 임신 합병증, 생쥐와 인간1에서 발생할 수 있습니다. 비정상적인 태 반 생리학 시키는 대상된 마우스 돌연변이의 수 증가2, 219 genotypes 현재 마우스 게놈 정보 과학 (MGI) 웹사이트에 나열 된 계속 되는 동안 (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), 기계 론 적인 관점에서 잘 이해 되지 않습니다 많은이 고기. 이외에 유전 변경, 작은 분자 약물, 단일 클론 항 체, 독 소, 병원 체, 과잉 대사 또는 다양 한 환경 요원 영향을 미칠 수 태 반 개발 및 기능3,,45 , 6 , 7. 아직, 간단한 체 외에서 태 반 개발에서 모델 중요 한 단계는 부족 한 분석 실험.
(탯의 발달 전조) allantois chorion8쪽으로 성장 하는 새싹으로 태아의 뒤 끝에서 나올 때 murine placental 개발 초기 midgestation에서 시작 됩니다. Allantoic 새싹의 외부 층에서 Chorioadhesive 셀 중재 첨부 파일 그리고 allantois chorion (chorioallantoic "퓨전")의 표면에의 확산. chorion 이후에 villi는 미로, 영양분과 산소 juxtaposed 밀접 하 게 모성 혈액 사인 및 배아 용기9 사이 교환 되 안 태 반 층을 형성 하는 allantois의 맥 관 구조 성장에 주름 ,10.
allantois의 첨부는 chorion 미로 형성에 중요 한 초기 단계 이며,이 과정에서 결함에 있는 미 발달 치 사 율의 가장 일반적인 원인 중 midgestation1. 어디 chorioallantoic 첨부 파일10, 발생을 실패 하 고 MGI 데이터베이스 현재 나열을 비정상적인 chorioallantoic 퓨전 (http:// 특징으로하는 108 마우스 돌연변이 마우스 돌연변이의 숫자는 설명 www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), 세포 상호 작용은 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm 표현) α4β1 integrin (chorionic mesothelium는에 표현 extraembryonic mesoderm에서 파생 된) chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전11,,1213불가결 것 같다. 약 배아 날 (E) 7.5 VCAM-1 allantoic 줄기의 원심 2/3 내 표현 된다 나타났습니다 Immunohistochemical 전체 산 야생-타입 배아의 얼룩13 (1-4 somite 단계), 그리고의 식을 여전히 높은 동안에 chorioallantoic 첨부 파일 및-퓨전11,12. chorion에 allantoic 첨부 파일의 오류는 일반적으로 자 궁 싹의 조직학 분석에 의해 감지 됩니다. 그러나, allantois 크기 사이와 같은 발달 단계14의 새끼 내 에서도 순수 높은 변수 이며는 allantois만 연결할 수 있는 chorion 신체 접촉 수 있도록 충분 한 크기에 도달 하는 때. 이 자연적인 변화를 반영, chorioallantoic 첨부 파일 일어난다 언젠가 사이 ~ E 8.0과 9.0 E에서 utero에서, 그리고 조직학이이 과정의 통계적으로 신뢰할 수 있는 평가의 많은 수의 분석에 의존 이므로 적절 한 발달 단계에서 충분 한 표본을 conceptuses.
여기, 우리 allantoic 첨부 파일 utero ex allantois 크기에 덜 의존 하는 평가 하는 방법을 설명 합니다. 우리 임신 쥐의 uteri에서 마우스 배아와 그들의 allantoides의 해 부를 입증 ~ 8 일 coitum 게시 (dpc; dpc 0.5 지정 질 플러그 감지), 그리고 allantois의 후속 문화 explants 고정된 α4β1에 integrins입니다. 이 메서드는 첨부 파일 및 여러 allantois explants 병렬에서 및 다른 연속 시간 점에서 확산의 급속 한, 기능 평가 수 있습니다. 프로토콜을 사용할 수 있습니다 allantois 첨부 비보 전에 대상된 돌연변이, 약물, 또는 다양 한 환경 요인의 영향에 대 한 화면으로.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1607">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:319px;">C57BL/6J wildtype mice</td>
			<td style="width:256px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">Stock No:&#160;000664</td>
			<td style="width:915px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 % (v/v) Ethanol</td>
			<td style="width:256px;">VWR International</td>
			<td>930031006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard pattern forceps</td>
			<td style="width:256px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td style="width:915px;">Forceps used to open the abdominal cavity.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Micro dissecting forceps</td>
			<td style="width:256px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Fine scissors&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight blades.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spring scissors&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15012-12</td>
			<td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microspoon</td>
			<td style="width:256px;">Carl Roth</td>
			<td>AT18.1</td>
			<td>5 mm Spoon diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Microtiter plates</td>
			<td style="width:256px;">ibidi</td>
			<td style="width:119px;">81501</td>
			<td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &#181;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10 cm dish</td>
			<td style="width:256px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">150350</td>
			<td>Sterile tissue culture dishes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">3.5 cm dish</td>
			<td style="width:256px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td>Sterile tissue culture dishes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large orifice pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">VT0140X</td>
			<td>Low binding pipette tips, 200 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">a4b1 integrin</td>
			<td style="width:256px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">6054-A4</td>
			<td>Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:319px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td>Without Ca2+ and Mg2+.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:319px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:256px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-03600</td>
			<td style="width:915px;">The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:319px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:256px;">Gibco (ThermoFisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &#181;g/mL streptomycin) stock solution.&#160;Prepare and store aliquots at -20 &#176;C to avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:256px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-80100</td>
			<td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &#176;C to avoid freeze/thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">S 0115</td>
			<td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &#176;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7030</td>
			<td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &#181;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">para-Formaldehyde</td>
			<td style="width:256px;">Carl Roth</td>
			<td>0335.2</td>
			<td style="width:915px;">To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &#176;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &#176;C for approximately four weeks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">a-CD31 Antibodies</td>
			<td style="width:256px;">BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary goat anti-rat antibodies</td>
			<td style="width:256px;">Thermo Fisher</td>
			<td>A-11006</td>
			<td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:256px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>81381</td>
			<td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Labovert&#160;</td>
			<td style="width:256px;">Leitz</td>
			<td style="width:119px;">Labovert&#160;</td>
			<td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">M80</td>
			<td style="width:256px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">DM4000B</td>
			<td style="width:256px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DM4000B</td>
			<td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Digital camera</td>
			<td style="width:256px;">JVC</td>
			<td style="width:119px;">KY-F75U</td>
			<td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:319px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:256px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">SP5</td>
			<td style="width:915px;">Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

태 반 포유류 배아의 개발과 성장을 위해 필수적 이다. 이러한 이유로 수많은 유전 변경 및 태 반 개발 또는 기능을 방해 하는 가능성이 또한 환경 모욕 쥐와 인간에서 이른 임신 손실을 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 태 반 형성에 미치는 잠재적 영향에 대 한 화면 분석 간단한 체 외에 부족 합니다. 여기, 우리는 allantois의 첨부는 chorion 이루어져 있는 태 반 형성에 중요 한 첫 번째 단계를 모델링에 초점. 빠르게 움직이지 α4β1 integrin chorio 모방 기판 역할에 allantoic explants의 첨부 파일을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 생체 외에서 이렇게 하면 첨부 파일 및 확산 다른 연속 시간 포인트에서 여러 allantois explants의 동작의 질적 평가 수 있습니다. 타겟된 마우스 돌연변이, 약물, 또는 임신 합병증 이나 allantois 첨부 ex vivo에태아 손실에 연결 된 다양 한 환경 요인의 효과 조사 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 murine allantoides ex vivo, explant를 격리 하는 방법을 설명 하 고 chorioallantoic 융합 vivo에서 동안 α4β1 integrin allantois 첨부, 중요 한 프로세스의 질적 평가 자세히 설명. 그림 1A-H 에서 대표적인 결과 allantois 격리 임신 자 궁에서 시작의 연속 단계를 보여 줍니다. 자 궁 뿔, 지방 조직 등 선박 (그림 1A)를 둘러싸고 모성 조직 제거 되 고 태아는 자 궁 근육 레이어 (그림 1B-개방 후 단계별 방식에서 endometrium에서 해 부 E). 그 후, 정수 리 른 sac 및 ectoplacental 콘 같은 다른 모성 조직 제거 됩니다 (그림 1E, F). 그림 1G - H 기술은 노 른 골목, 다른 extraembryonic 및 매우 vascularized 조직에서 extraembryonic allantois의 해 부 구성 보여줍니다. 따라서,이 프로토콜에 따라 고립 된 allantoides는 크게 무료는 allantois 이외의 모성 또는 (추가) 배아 조직 오염입니다.
그림 2 는 하나의 단일 쓰레기에 갓 해 부 배아에서 allantoides의 형태와 크기 다를 수 있습니다 상당히14보여 줍니다. 그림 2 및 그림 1 H와 같이 C57BL/6J wildtype 배아에서 E 8.5 해 부의 allantoides의 경우 (61 분석 된 배아의 45), 74%에서는 길쭉한 형태를 했다. 그러나, 15%에서에서 (9/61)는 배아는 allantoides 했다 현저 하 게 더 작은 더 둥근 (참조14참조) 11% (7/61) 배아의 했다 아직 형성 되지 표시 allantois 해 부의 때에. 유형이 다른 모양 및 크기 allantois의 시작 시간 지점에도 불구 하 고 문화 (그림 2, 패널은 은-h), allantois 첨부 explant 및 모든 12 h 이내 관찰 되었다 고정된 α4β1 integrin에 전체 확산 54 갓 격리 된 allantoides의 7 개의 새끼의 배아에서 해 부. 그럼에도 불구 하 고, 모양 및 크기의 문화 12 h 후 explants의 했다 다소 이질적인 (그림 2), 분석 결과의 시작 지점에서 다른 allantoic 형태학을 반영.
그림 3 은 explant 문화는 explants 예상9 이 시간 포인트, 혈관 총 정교 했다 확인 24 h 후 완전히 연결 된 allantoides에 CD31-긍정적인 내 피 세포에 대 한 얼룩이 지는 immunocytochemical , 16. 같은 부착 allantois 문화 체 외에서혈관 형성9공부를 사용할 수 있습니다. 따라서, 이전에 동의 쉽게 경작 비보 전, 될 수 있는 방법론을 제시 수익률 allantois explants 실험 연구9,16게시.
프로토콜 allantois 첨부의 현미경-기반 평가 프레임 워크 정해진된 시간 포인트에서와 같은 후 12 h 또는 설정 explant 문화의 24 시간 합니다. 결과 (부분/전체 첨부 파일 또는 전체 확산 주어진된 시간에-예/아니오) 질적으로 평가할 수 있습니다. 이후 같은 explant를 반복적으로 시각화 하 고 득점 될 수,이 분석 개별 allantois의 특성 시간별 문화 explant 반영 한다. 또한, 고정 및 스테인드 explants에 혈관 총의 형성 수 있습니다 (그림 3)를 평가.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig1.jpg"> 그림 1: 대표 allantois 절 개 단계. 격리 된 자 궁 경적의 (A) 상세 보기. 자 궁 싹 배아를 포함 하는 별; 표시 됩니다. 왼쪽 지방 조직과 자 궁 경적을 둘러싼 혈관까지 볼 수 있습니다. (B)는 자 궁의 근육 층의 제거 후 decidua (endometrium) 보기 매우 vascularized는 decidua의 mesometrial 장 대는 왼쪽에, 오른쪽에 안티 mesometrial 부품 (별 표시)는 배아를 포함 하는. (C) 측 decidua (별 표시)의 해 부 안티-mesometrial 장 대의 볼. 화살표는 태아의 위치를 나타냅니다. (D) 주변 decidua의 부분 제거 후 정수 리 른 골목으로 둘러싸인 conceptus (화살표)의 최고 볼 수 있습니다. (E, F) 이후 단계에서 배아 (화살표)의 해 부의 대표 전망. 화살촉은 노른자위 sac를 나타냅니다. (E), ectoplacental 콘 (epc) 오른쪽에 표시 됩니다. (G) 노른자위 sac (화살촉)에서 배아 (화살표)의 부분 절 개. allantois 빨간색 별 표시 됩니다. (H) 고립 된 배아 (화살표) allantois (레드 스타)와 함께. 어디는 allantois 삭감 될 것 이다 그것의 기저 삽입 사이트에서 태아의 뒤 끝에 위치 빨간색 끊어진된 선으로 표시 됩니다. 이미지는 8:1 줌 범위 stereomicroscope에 촬영 했다. 모든 스케일 바는 1 m m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig2.jpg"> 그림 2: 유형이 다른 모양 및 크기의 allantoides. 8 allantoides (h는-) 한 하나의 쓰레기의 배아에서 분리 했다. 왼쪽 패널, 해 부 (0 h) 후 즉시 allantoides. 오른쪽 패널, explant 문화 12 h 후 같은 allantoides. explants는 단단히 연결 하 고 중간 엽 세포 확산. explants는 explant 크기를 시각화에 동그라미. 이미지는 현미경 단계 대조 광학 및 5 × (왼쪽된 패널) 또는 10 × 목표 (오른쪽 창)에서 찍은. 모든 스케일 바는 500 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig3.jpg"> 그림 3: 혈관 신경 얼 기 형성 allantois explant 문화에서. Allantoides 해 부 되었고 explanted 고정된 α4β1 integrin 현재 프로토콜에 설명 된 대로에. Explants 24 h에 대 한 교양 했다 그리고 내 피 세포는 혈관 총에 안티 CD31 1 차 항 체를 사용 하 고 2 차 항 체 붙일 스테인드 했다. 내 피 세포는 녹색으로 표시 됩니다. 상단 이미지는 대표 allantois explant의 중앙 지역에 있는 전체 혈관 총을 보여 줍니다. 이미지는 5 × 목표와 형광 광학 현미경에서 촬영 됐다. 스케일 바, 500 µ m입니다. 두 낮은 패널은 다른 allantois explant 해 부와 동일한 조건 하에서 경작의 더 높은 확대 이미지입니다. 배 모양의 구조와 개별 내 피 세포를 볼 수 있습니다. 이미지는 confocal 현미경;에 찍은 스케일 바, 25 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K 조회수.  University of Würzburg. 생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

비디오: Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Proteomic 분석을위한 인적 유리 바디 요소의 해부

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

연구

의학

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts in this protocol have been successfully used in the derivation of induced pluripotent stem cells to model disease1. Early passages of these fibroblasts can also be used for cell-based functional assays to study specific disease pathways, mechanisms2 and subsequent drug screening approaches. The advantage of the presented protocol over enzymatic procedures are 1) the reproducibility of the technique from small amounts of tissue derived from older patients, e.g. patients affected with Parkinson's disease, 2) the technically simple approach over more challenging methodologies using enzymatic treatments, and 3) the time consideration: this protocol takes 15-20 min and can be performed immediately after biopsy arrival. Enzymatic treatments can take up to 4 hr and have the problems of overdigestion, reduction of cell viability and subsequent attachment of cells when not handled properly. This protocol describes the dissection and preparation of a 4-mm human skin biopsy for derivation of a fibroblast culture and has a very high success rate which is important when dealing with patient-derived tissue samples. In this culture, keratinocytes migrate out of the biopsy tissue within the first week after preparation. Fibroblasts appear 7-10 days after the first outgrowth of keratinocytes. DMEM high glucose media supplemented with 20% FBS favors the growth of fibroblasts over keratinocytes and fibroblasts will overgrow the keratinocytes. After 2 passages keratinocytes have been diluted out resulting in relatively homogenous fibroblast cultures which expresses the fibroblast marker SERPINH1 (HSP-47). Using this approach, 15-20 million fibroblasts can be derived in 4-8 weeks for cell banking. The skin dissection takes about 15-20 min, cells are then monitored once a day under the microscope, and media is changed every 2-3 days after attachment and outgrowth of cells.

The fibroblast explant culture protocol from human skin punch biopsies is a technically robust and simple way to derive skin cells within 4-8 weeks for banking of about 15-20 million cells at a low passage number.

인간의 기본 섬유 아세포의 유도를위한 피부 펀치 생검 절편 문화

Tissues and cell lines derived from an individual with disease are ideal sources to study disease-related cellular phenotypes. Patient-derived fibroblasts ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

쥐의 대동맥 부비동의 동맥 경화 병변의 정량 분석​​ 및 특성

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous studies have shown the results of such dissections, the detailed steps have not been described, precluding researchers outside the field from replicating their methods. Other studies harvest vitreous either through aspiration, which does not maintain the vitreous structure anatomy, or through partial dissection, which only isolates the vitreous core. The proposed method isolates the whole vitreous body, with the vitreous core and cortex intact, while maintaining vitreous anatomy and structural integrity. In this method, a full thickness scleral flap in an enucleated porcine eye is first created and through this, the choroid tissue can be separated from the sclera. The scleral flap is then expanded and the choroid is completely separated from the sclera. Finally the choroid-retina tissue is peeled off the vitreous to leave an isolated intact vitreous body. The proposed vitreous dissection technique can be used to study physical properties of the vitreous humor. In particular, this method has significance for experimental studies involving drug delivery, vitreo-retinal oxygen transport, and intraocular convection.

The goal of this protocol is to show an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes.

Vitreodynamic 분석을위한 항목의 유리체 유머 해부

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse. We also depict representative results produced by these protocols. Finally, we discuss the advantages and utilization of these protocols.

쥐의 전립선 마이크로 해부 및 수술 거세

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at the 12 codon (Ptf1acre/+;LSL-KrasG12D/+) mouse strain as a model of human pancreatic cancer. The goal of our current studies is to identify novel metabolic biomarkers of pancreatic cancer progression. We have performed metabolic profiling of urine, feces, blood, and pancreas tissue extracts, as well as histological analyses of the pancreas to stage the cancer progression. The mouse pancreas is not a well-defined solid organ like in humans, but rather is a diffusely distributed soft tissue that is not easily identified by individuals unfamiliar with mouse internal anatomy or by individuals that have little or no experience performing mouse organ dissections. The purpose of this article is to provide a detailed step-wise visual demonstration to guide novices in the removal of the mouse pancreas by dissection. This article should be especially valuable to students and investigators new to research that requires harvesting of the mouse pancreas by dissection for metabolic profiling or histological analyses.

This video article provides a detailed demonstration of the procedures required to successfully remove the pancreas from a mouse by dissection for histological analysis and metabolic profiling.

조직학 분석 및 대사 프로 파일링에 대 한 마우스 췌의 해 부

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Β-aminopropionitrile-유도 대동맥 동맥 및 해 부의 마우스 모델에서 Aortopathy의 양적 마이크로 CT 분석

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...