L.K.는 브리티시 컬럼비아의 대학 4 년 친교 (4YF) 대학원 재학 상 받는 사람입니다. L.M.S.은 위장의 캐나다 협회의 받는 사람 / 크 론 및 Colitis 캐나다 CIHR 새로운 탐정 급여 수상 / 건강 연구를 위한 마이클 스미스 재단의 생물 의학 학자입니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (# CIHR2016-LS 부여)와 공동으로 캐나다 혈액 서비스에서 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 브리티시 컬럼비아의 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 골 대 식 세포 유도 및 항 체와 활성화
<ol>
	<li>CO2 질을 사용 하 여 안락사를 수행 합니다.<ol>
		<li>유도 챔버에 장소 마우스입니다. 때까지 움직이지 하 고 호흡은 깊고 느린 60-90 s 5 %isoflurane 마 취와 함께 마우스를 안락사 하 고</li>
		<li>Isoflurane 마 취를 끄고 마우스 호흡 중지 될 때까지 6-8 L/분 CO2 의 관리. 두고 마우스 CO2 에 적어도 또 다른 5 분 확인을 위해 거기는 더 이상 심장 박동 또는 호흡. 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다. 참고: 8-12 주 오래 된 마우스 대 식 세포의 가장 높은 수익률을 제공합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>70% 에탄올, 마우스 다리를 스프레이 하 고 무기와 폼 보드 위에 부정사 위치에 밖으로 기지개 하는 다리와 그들을 핀. 가 위, 집게는 피부를 피부와 모피 뒷 다리의 각각의 표면에서 제거 하 얕은 절단 (0.2 cm)를 확인 합니다. 참고:이 절차 및 모든 조직 문화의 조작 살 균 후드에서 수행 합니다.</li>
	<li>Tibias와 화관을 볼 수 있도록 근육을 잘라. Tibias와 화관, 뼈와 근육 고관절 바로 아래와 발목 이상 절단 하 여 제거 합니다. 가능한 많은 근육 정돈 한다.</li>
	<li>70% 에탄올으로 뼈를 살포 하 고 증발, 다음 뼈 플러시 매체 (Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 수정)의 6 잘 플레이트에 넣어 그것을 위해 1 분을 기다립니다.</li>
	<li>0.1 cm 발목, 대 퇴 골의 상단 뼈의 뼈 구멍 노출 되도록 절단 하 여 뼈의 끝을 잘라. 골 수는 보이는 26 게이지 바늘 뼈 구멍에 놓일 수 있습니다 확인 합니다.</li>
	<li>뼈와 근육 tibias와 무릎 관절에서 화관을 잘라. 캐비티에 10 mL 주사기에 부착 된 26 게이지 바늘을 삽입 합니다. 플러시 중간 뼈의 5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 골을 플러시. 각 50 mL 튜브에 두 tibias와 하나의 마우스에서 2 개의 화관을 플러시.</li>
	<li>여러 번 또는 소용돌이 위아래 플라스틱 덩어리를 부드럽게 분산을 느린 속도로 골 수 있습니다. 골 수의 골 수의 작은 (0.5 m m 미만 함) 부스러기로 깨진 해야 합니다. 플러시 중간 뼈로 50 ml 원뿔 튜브를 채우십시오. 피 펫 내용은 75 cm2 조직 문화에 원뿔 튜브의 플라스 크, 취급 하 고 37 ° C, 5% CO2 1 h에서 품 어. 참고: 성숙 세포와 중간 엽 세포 될 것입니다 플라스 크를 부착 하 고 원하는 조 혈 창시자에에서 유지 하는 동안 삭제 됩니다.</li>
	<li>50 mL 원뿔 관으로 조 혈 창시자와 매체를 플라스틱. 원심 5 분 삭제에 대 한 상 온에서 300 x g에 튜브는 상쾌한 고 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (MCSF) 문화 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (IMDM, 10 %FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL 페니실린/스, 및 150 μ M monothioglycerol (MTG))입니다.</li>
	<li>Hemocytometer18를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 106 셀/mL, 107 셀/플라스 크 매체, 30 mL에 x 1.5 x 0.5의 농도에 세포 resuspend를 위아래로 부드럽게 플라스틱을 매체를 추가 합니다. 새로운 75 cm2 취급 하는 조직 배양 플라스 크에 현 탁 액 30 mL를 플라스틱.</li>
	<li>하루 4 일 7 단계 1.9에서에서 초기 문화 후에 세포가 부착 하 고 약간 분기는 반전된 단계 대조 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 비 부착 한 세포를 포함 하는 매체를 버리십시오. 씻어 IMDM 셀 한 번 하 고 MCSF 문화 매체의 30 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>하루 10 세포가 성숙 때 (&#62; F4/80 및 Mac-1에 대 한 긍정적인 95%), 셀은 다시 확인 점착 및 약간.</li>
	<li>에 셀 stimulations 접시, 플라스 크에서 문화 매체를 제거 하 고 효소, EDTA 기반 셀 분리 버퍼 (자료 테이블)의 8 mL을 추가. 37 ° C, 5% CO2에서 5 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>작은 양의 압력, 멸 균 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 부드럽게, 다쳤어요. 세포를 플라스 크 표면에서 분리 된 현미경에서 확인 합니다. 50 mL 원뿔 튜브로 피 펫 해리 셀. 3 번 IMDM의 5 mL로 플라스 크를 헹 구 고 수확 했다 셀 린스 솔루션 수영장. 5 분 동안 실 온에서 300 x g에서 셀 원심</li>
	<li>3 ml 50 mL 원뿔 튜브 당 MCSF 문화 매체의 셀 펠 릿을 resuspend. Hemocytometer18를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 1 x 106 셀/mL 및 플레이트 100 μ 셀 서 스 펜 션 (1 x 105 셀/잘)의 농도에서 세포 당 96 잘 조직 문화 취급, 평면 바닥판의 resuspend. 참고: 한 마우스에서 뼈 100 웰 스에 대 한 충분 한 세포를 생성 합니다. 원하는 경우, 셀의 1 mL 6 잘 플레이트 (조직 문화 취급, 평면 하단)에 도금 수 있습니다. 셀 (1 x 106 셀)의 많은 수는 서쪽 오 점 분석에 유용할 수 있습니다.</li>
	<li>일단 부착, 중복 자극 또는 3 중 각각 10 ng/mL IMDM, IVIg, 또는 IVIg + LPS의 30 mg/mL에서에서 LPS의 우물. LPS 또는 IVIg의 복용량 응답을 최적화 하기 위해 적정 될 수 있습니다. Unstimulated 컨트롤으로 중복 되거나 triplicate 우물을 둡니다. 24 시간 (37 ° C, 5% CO2)에 대 한 그들을 품 어. 참고: 다시 도금된 세포 조직 문화 웰 스 1 시간 이내에 준수 해야 합니다.</li>
	<li>개별 1.7 mL microcentrifuge 튜브 각 우물에서 셀 supernatants를 수집 하 고 5 분 동안 10000 x g에서 회전 하 여 어떤 미 립 자 물질을 제거.</li>
	<li>표면에 뜨는 셀을 제거 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않도록. 명확히 셀 메 마른 microcentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 장소. 참고: 셀 supernatants cytokines, IL-10, 및 cytokine 소 단위, 일리노이-12/23 p 40, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 즉시에 의해 분석 하거나 장기-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 상용 장비 (자료 테이블)에서 ELISA 프로토콜을 따릅니다. 다른 프로 염증 성 cytokines 수 수 분석, 일리노이-6와 TNF, 그들은 또한 공동 치료 IVIg에 의해 감소 된다 + LPS 자극에 비해 서 혼자 LPS 자극. 자극, 후 부착 세포 부 럽 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR) 19,20같은 기법에 대 한 준비 될 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 마우스에 도전 비보에 IVIg와 복 막 대 식 세포를 수확
<ol>
	<li>각 마우스 무게.</li></ol>IVIg (100mg/mL 재고 농도) 각 마우스에 대 한 몸 무게 2.5 g/kg의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. 참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg의 500 µ L이 필요 합니다.
	<li>살 균 1 mL 주사기에 IVIg의 필요한 양을 살 균 26 장착 그리기 게이지 바늘. 컨트롤 마우스 IVIg에는 영향을 받지 것입니다에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS), pH 7.4 IVIg 대신의 등가 선 량 볼륨을 관리 합니다.</li>
	<li>엄지와 검지 손가락으로 목 뒤쪽의 피부를 잡아와 그것의 꼬리와 나머지 손가락으로 뒷 다리를 들고 한 손으로 마우스 아저씨. 그것의 몸을 바닥 쪽으로 기울기.</li>
	<li>바늘 낮은 오른쪽 사분면에서 마우스의 복 부를 기준으로 30-40 ° 각도에서 베벨 놓고 바늘의 1.5 c m를 삽입 합니다. Intraperitoneally IVIg 또는 PBS를 주입. 1 시간을 기다립니다.</li>
	<li>6-8 L/분 CO2 질 식에 의해 다음 5 %isoflurane 마 취와 함께 마우스를 안락사 (단계 1.1.1-1.1.2를 참조), 또는 기관의 윤리 지침에 따라.</li>
	<li>핀 마우스 사지와 폼 보드를 밖으로 퍼졌다. 부품 70% 에탄올 스프레이. 참고: 살 균 후드에는 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>복 막 구멍을 절단 하지 않도록 하는 마우스의 중간 선 따라가 위로 (0.2 cm) 피부에 얕은 상처를 확인 합니다. 그대로 복 벽의 안 대기는 볼 수 있도록 집게를 사용 하 여 마우스의 배꼽에서 복 부 피부를 당겨.</li>
	<li>살 균 PBS (pH 7.4)의 5 mL로 5 mL 주사기를 채우십시오. 한 25 삽입 또는 27 게이지 바늘의 경사와 마우스의 중심 방향으로 오른쪽 또는 왼쪽에서 구멍의 상단에 바늘을. 참고: 장소 바늘 신중 하 게 마우스에 있도록 기관, 그러나 오히려, 복 막 공간으로 PBS 주사 하지 않습니다.</li>
	<li>복 막 구멍으로 액체를 밀어. 구멍에 바늘을 꺼내와 마사지 10 복 셀을 꺼내 려 s. 구멍의 상단에 바늘을 삽입 하 고 장기를 피하십시오. 수집 하 고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브로 게 유체를 놓습니다. 참고: 모든 5 Ml 주입 액체의, 약 3.75 mL 복구할 것 이다.</li>
	<li>주입 및 복구 (2.8-2.9 단계)를 반복 하 여 총에 게 액체의 15 mL를 복구 (20 mL의 총 주입 량), 번 더 3. 별도 15 mL 원뿔 튜브로 각 마우스에서 게를 수집 합니다. 참고: 마지막 주사 후 수 있습니다 액체 축적은 마우스의 멀리 왼쪽 및 오른쪽 측면에서 액체를 추출 하기 쉬운. 장기는 바늘이 위치에 더 적은 방해를 일으킬 것입니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 Resuspend 도금 매체의 500 μ 셀 (IMDM, 10 %FBS, 및 100 U/mL 페니실린/스) 마우스 플러시 당. 실행 가능한 세포 hemocytometer18를 사용 하 여 계산 합니다. 참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다. 전형적인 수확량은 5 x 105 -1 x 106 세포/야생 타입 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 마우스입니다. 옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 제조업체의 지침에 따라 1 x 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 그들을 제거 하는 세포 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>셀 1 x 106 세포/mL에서 중간 도금에 resuspend 그리고 96 잘 플랫 바닥 처리 하는 조직 문화 접시에 잘 당 100 μ 접시. 참고: 그것은 필요할 지도 모른다 풀을 사용 하는 경우 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 셀 triplicate 우물 이나 넣는 자극. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다. 5 웰 스, 또는 중복 한 LPS 복용량 1 실험에 대 한 충분 한 셀 것입니다.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 세포 될 수 있도록 1 h에 대 한 셀을 품 어 부착. 부착 세포가 복 막 대 식 세포. 셀 supernatants 및 비 부착 한 세포를 제거 합니다. 200 μ IMDM (37 ° C에 미리 예 열)로 두 번 웰 스 린스, 10 기다릴 s 접시를 천천히 기울기. 도금 매체를 교체 합니다. 37 ° C, 5% CO2 자극 전에 30 분 동안에 세포를 품 어.</li>
	<li>IMDM에서 LPS의 10 ng/mL로 세포를 자극 하거나 unstimulated 제어로 둡니다. 24 h incubate, 수집 하 고 명확히 IL-10 cytokine ELISA 분석에 대 한 셀 supernatants (1.16-1.17 단계 참조). 상용 장비 (자료 테이블)에서 ELISA 프로토콜을 따릅니다. 참고: 자극, 후 부착 세포는 서쪽 오 점 또는 PCR 등 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.</li>

3. 마우스에 도전 비보에 IVIg + LPS 및 복 막 대 식 세포를 수확
<ol>
	<li>각 마우스 무게. IVIg (100mg/mL 재고 농도) 몸 무게 2.5 g/kg의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. LPS (IMDM에 재고 100 μ g/mL 농도) 0.2 μ g/g 몸 무게의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 금액을 계산 합니다. 참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg 재고 솔루션의 500 µ L와 LPS의 100 μ g/mL 해결책의 40 μ가 필요 합니다.</li>
	<li>IVIg의 필요한 금액을 인출 하 고 살 균 26으로 살 균 1 mL 주사기로 LPS 게이지 바늘. 컨트롤 마우스 IVIg에는 영향을 받지 것입니다에 대 한 살 균 PBS ph 7.4 IVIg의 해당 볼륨을 교체 합니다.</li>
	<li>엄지와 검지 손가락으로 목 뒤쪽의 피부를 잡아와 그것의 꼬리와 나머지 손가락으로 뒷 다리를 들고 한 손으로 마우스 아저씨. 그것의 몸을 바닥 쪽으로 기울기.</li>
	<li>장소 바늘 낮은 오른쪽 사분면에서 마우스의 복 부를 기준으로 30-40 ° 각도, 경사 및 1.5 cm. 넣기는 IVIg + LPS, 또는 PBS + LPS를 삽입, 2.4 단계에서 intraperitoneally.</li>
	<li>1 시간 후 2.5-2.10 단계를 수행 하 여 복 막 대 식 세포를 수확.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 복구 된 게 액체의 1 mL를 제거 및 IL-10과 IL-12/23 p 40 여 ELISA 분석에 대 한 제조업체의 지침에 따라 사용 또는 미래의 분석-80 ℃에서 동결. 참고: 정확한 비교 게 유체 cytokine 분석에 대 한 치료를 보장 하기 위해 수행 복 막 구멍의 5 mL flushs 4 번 15 mL의 최종 볼륨에 대 한. 모든 액체는 각 플러시에서 복구할 수 있습니다.</li>
	<li>2.11 단계에서 resuspend 및 실행 가능한 세포. 참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다.</li></ol>전형적인 수확량은 5 x 105 -1 x 106 세포/야생 타입 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 마우스입니다. 옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 세포 단계 단계 2.11에서 그들을 제거 하려면 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
	<li>2.12 단계에서 다시 셀 중간 도금을 일시 중단 합니다. 참고: 그것은 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 수영장 셀에 필요할 수 있습니다. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다.</li>
	<li>2.13에서 허용 되는 세포를 37 ° C 5% CO2 에서 1 시간에 대 한 셀을 품 어 부착.</li>
	<li>수집 하 고 모든 복 막 세포에서 1.14-1.15, 단계 당 조절된 매체를 명확히. 참고: 샘플 수 있습니다 즉시 사용 또는 동결 되며 ELISA cytokine 분석-80 ° C에 저장.</li>
	<li>2.11, 단계를 수행 하지만 24 h unstimulated에 대 한 셀을 품 어. 수집 하 고 단계 1.16-1.17, cytokine ELISA 분석에 의하여 셀 supernatants 명확히. 참고: 셀 단계 1.16-1.17, 2.14 서쪽 오 점 또는 PCR, 같은 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.</li>

<ol>
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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

대 식 세포 활성화 상태 두 조직의 항상성 및 질병22에 중요 한 역할을 한다. 대 식 세포 활성화 상태, 그들의 microenvironment3에서 신호에 따라 중복 뿐만 아니라 고유 할 수 있습니다. 그들은 염증 반응의 모든 단계에 있는 명백한 역할: 병원 체에 대 한 방어, 상처 치유 및 조직 회복, 그리고 또한 염증 반응2 해제에 대 한 중요 한 다른 항 염증 제 활성화 상태 . 항 염증 제 대 식 세포 활성화 항 염증 성 사이토카인, IL-10, IL-1223같은 프로 염증 성 cytokines의 낮은 금액의 높은 금액을 생산 하는 세포에 대 한 두 개의 외부 자극을 필요 합니다. 하나의 신호 항 체 Fc 감마 수용 체를 통해 행동에서 유래 하 고 두 번째 신호는 LPS 또는 IFNγ와 같은 프로-염증 성 자극24,25. 혈 청, 면역성이 있는 복합물, 및 안티-TNFα 항 체, 모든 세포8,23,,2526에서 높은 IL-10-produing 항 염증 제 활성화 상태를 유도 하기 위해 발견 되었습니다. 우리의 그룹은 이전 murine 골 수 세포를 파생 하 고 또한 IL-10과 거의 없는 프로-염증 성 IL-12/23 p 40 LPS8에 대 한 응답의 높은 금액을 생산 하는 복 막 대 식 세포와 IVIg 자극된 게시 했습니다. 우리는 또한 다른 프로 염증 성 cytokines, 일리노이-6와 TNF에서 파생 하는 골 수 세포8IVIg에 의해 또한 감소 된다 나타났습니다. 여기에 설명 된 방법은 마우스 BMDMs 복 막 대 식 세포 생체 외 및 생체 내에서다른 항 체 기반 약물 응답을 테스트를 적용할 수 있습니다.
마우스 골 수 및 복 막 대 식 세포 치료제 항 체 기반 테스트에서 많은 중요 한 단계가 있습니다. 불 임을 유지 하는 것은 각 프로토콜에 대 한 중요 합니다. 경우 대 식 세포 문화 공기, 모피, 또는 쥐의 배설물에서 미생물과 오염, 대 식 세포는 프로 염증 성 cytokines을 생산 하 여 그 자극에 응답 합니다. Biosafety 캐비닛에 모든 실험을 수행, 에탄올, 자유롭게 마우스를 살포 하 고 복 막 플러시 동안 내장의 무결성을 보장 필수적입니다. 항 체는 또한 살 균 하 고 제조업체의 지시에 따라 저장 유지 되어야 한다. 그것은 오염, 만료, 또는 혼 탁 한 경우 사용할 수 없습니다. 탁도, 약의 효과 감소 하 고 약 적절 한 온도에서 저장 되지 않은 또는 너무 오랫동안 저장 된 경우 발생할 수 있습니다. IVIg는 4 ° C에서 저장 고 전에 만료 날짜에 도달 하면, IL-10 생산 수준의 영향을 받을 수 있기 때문에 사용 될 수 있습니다. 또는, 우리는 응답에 영향 없음-20 ° C에 얼 수 있다 보았다. IVIg 브랜드 준비, 그림 1에서 같이 다른 유형의 세포에서 다른 응답을 발생할 수 있습니다 반면 IVIg의 다른 많은 유사한 실험 결과를 리드. 에센셜 제어, unstimulated와 같은 셀 및 셀, 항 체와 자극된 세포 또는 약물의 오염 배제 하는 각 실험에 포함 되어야 합니다.
몇 가지 수정은 실험을 사용자 지정 하려면 이러한 프로토콜을 만들 수 있습니다. 비 염증 상태에서 대형 실험에 대 한 충분 한 복 막 대 식 세포를 분리 하기 어려울 수 있습니다. 복 막 대 식 세포는 thioglycollate (TG)의 복 주입 하 여 elicited 수 있습니다. 면역 반응을 발생 하 고 4 일 후에 이끌려 복 막 대 식 세포 수확된27일 수 있다. 모집된 대 덜 성숙 수 있습니다 그리고 우리가 여기, 중요 한 고려 사항이 있는 사용 해야 주민 세포를 대표 하지 않는다. TG elicited 세포 수 있습니다 또한 먹어서27에 실험 하는 경우에 특히, 합병증이 있을 수 있습니다 TG 국물에서 agar를 내가지고. 다른 유전 배경, C57BL/6 또는 BALB/c 마우스 실험에도 사용할 수 있습니다 그리고 필요한 특정 유전 배경 질환 모델에서 평가 하는 대 식 세포 응답에 항 체의 영향 검토를 선택할 수 있습니다. 또한, 우리가 우리 자신의 작품8일 Il10/- 생쥐 같은 유전자 변형된 쥐 약물, 행동의 메커니즘에 특정 단백질의 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 염증 성 자극은 또한 대 식 세포 활성화에 항 체의 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. IFNγ, 그리고 수용 체 (TLR) 촉진제 (예: 히 알루 론 산) 같은 파생 호스트 수신자 IL 10 생산 세포25,28을 활성화 하기 위해 사용 되었습니다. 중요 한 고려 사항은 항 체의 복용량은. 항 체 공급자 사이 다 것 이다 복용량은 문화에서 및 동물 실험에서 최적의 복용량을 얻기 위해 적정 한다. 선택한 복용량 또한 인 간에 게 주어진 복용량을 반영 해야 하 고 약물 사이 다를 것 이다. IVIg는 이러한 프로토콜29,30에 사용 되는 적정 한 복용량을 반영 하기 위해 항 염증 치료에서 고용량 (25-35 mg/mL 또는 2g/kg 몸 무게),으로 제공 됩니다.
골 수 및 복 막 대 식 세포의 사용에는 제한이 있습니다. 대 식 세포 세포 라인 개선, 마우스 BMDMs은 조 혈 선구자에서 아직도 인위적으로 파생된 셀. 체 외에서 세포의 면역 반응 테스트 이해 항 체 응답을 하는 중요 한 단계 이지만, vivo에서 실험도 수행 해야. 자극에서 vivo에서 세포 전 비보경작 뒤 주입, 항 체 기반 약물 또한 질병 상태에서 염증 세포를 활성화할 수 있습니다 여부를 조사 하는 미래 연구에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 항 체 기반 biologics을 받는 사람들에서 발생에 결론이이 실험에서 그려야 수 없습니다. 몇 연구 인간 monocyte 파생 된 대 식 세포 생체 외에 IVIg의 효과 평가 하기 위해 출판 되었습니다. 생체 외에서 인간 monocytes 생산 일리노이-6의 수에 있는 감소 보고 되었습니다, IVIg는 공동 LPS 혼자12자극에 비해 LPS로 자극 하는 경우. IVIg 감소 TNFα과 일리노이-6 생산 THP-1 인간 monocytic에 procalcitonin (PCT)와 함께 자극 하면 세포31.
이 문서 내에서 프로토콜 기존 방법에 비해 장점이 있다. 골 수 유래 세포와 복 막 대 식 세포는 1 차 셀, 마우스에서 직접 분리 보다는 세포 선을 불멸 하 게 되 고.RAW264.7 세포 등 마우스 대 식 세포와 같은 세포 라인 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다 IL-12, LPS, 응답에는 IL-10 IVIg8,13에 대 한 응답에서 생산 되는 의해 통제 된다 중요 한 사이토카인. 한 마약에서 테스트 vivo에서 LPS와 게 유체, 복 막 세포, 및 특히, 복 막 대 식 세포의 분석을 통해 지역 복 막 환경에 약의 효력의 검사를 허용 합니다. 그것은 짧은 기간, 질병의 더 이상 하 고 더 비용이 많이 드는 동물 모델에서 대 식 세포 활성화에 항 체의 일반적인 효과의 시험을 정당화 하기 위해 중요 한 정보를 제공할 수 있는 간단한 모델. Endotoxemia 모델 실험 측정이 종종 마우스 생존 또는 혈 청14cytokines에 이점이 있다. 생존 률과 혈 청 cytokines은 면역 반응의 중요 한 측정 하지만 그들은 표시 되지 않습니다 기여 세포 구체적으로 가질 수 있습니다. 분리 하 고 도전 실험에서 복 막 세포 배양 항 체 치료제는 대 식 세포 기능에 미칠 수 있는 직접적이 고 측정 가능한 효과 보여줍니다.
이러한 메서드는 응용 프로그램 테스트 및 생물 학적 치료를 설계. 치료제로 서 항 체를 사용 하 여 최근 몇 년 동안에서 극적으로 증가 했다. 그러나,이 치료는 항 체의 Fc 부분을 인식 하 고 그들의 사이토카인 생산을 변경할 수 있는 세포에 추가 알 수 없는 효과 있을 수 있습니다. 안티-TNFα 항 체, infliximab, IL-10 유도 및 억제 T 세포 확산의 Fc 부분을 통해 표시 되었습니다 그리고 그 액션7,,1526의 메커니즘의 하나로 제안 되었습니다. 유전자 모델을 사용 하 여, 특정 단백질 어떻게 이러한 약물 대 식 세포 활성화에 영향을의 메커니즘에 연루 될 수 있습니다. IgG 항 체와 항 체의 준비의 클래스는 어떻게 세포 생물 의약품에 의해 영향을 받습니다 변경 변경할 수 있습니다. 우리의 데이터 나타냅니다 준비 및/또는 스토리지 같은 항 체 의약품 (IVIg)의 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 줄 수 있습니다. 이 문서 내에서 방법은 치료 될 수 있는 암 치료를 하는 동안 immunosurveillance를 유지 하기 위해 중요 한 염증 세포 종양의 진행을 촉진 수도 있습니다 이러한 효과 없는 디자인을 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 디자인 하 고 이러한 효과 마약 바람직한 평가 또한 사용 될 수 있습니다. 예를 들어 도움이 대 식 세포 선 동적인 응답을 선 동적인 장 질병 또는 류 마티스 관절염에 대 한 치료를 향상 시키기 위해 항 염증 제 IL 10 생산 하는 세포를 만들 수 있습니다.

대 식 세포는 면역 반응에 여러 역할 감염이 나 부상에 타고 난 면역 세포. 대 식 세포는 감염이 나 조직 손상에 대 한 면역 응답을 시작, 선 동적인 응답을 중지 및 치유 응답1을 홍보 하는 일을 담당 합니다. 3 최고의 공부 대 식 세포 활성화의 예: 1) 대 식 세포 치료 인터페론 감마 (IFNγ)와 세균 lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS)는 염증 반응;을 지정 2) 대 식 세포와 인터 루 킨 4 (IL-4), M(IL-4), 자극된 치료 응답;과 관련 된 3) 면역성이 있는 복합물 (IC)와 자극된 세포와 LPS, M (IC + LPS)는 염증 반응2,3해제 하는 기능이 있다. M (IC + LPS) M(IL-4) 상처 치유, 세포에서 고 효소 arginase (Arg-1) 또는 FIZZ14를 표현 하지 않습니다. 이러한 염증 세포에 대 한 최고의 마커는 그들의 cytokine 생산5입니다. 세포 건강을 유지 하는 데 여러 역할 하지만 또한 염증 성 질환 및 암3에 기여. 이 때문에, 대 식 세포는 다양 한 질병의 치료에 대 한 주요 치료 대상. 그것은 질병에 대 한 대 식 세포 기반 치료를 개발 하기 위해 그들의 활성화 상태에 대 한 항 체의 효과 조사 해야 합니다.
이 문서의 초점은 파생 murine 골 수 세포 (BMDMs) 및 선 동적인 응답 생체 외 및 생체 내에서항 체 약물의 효과 테스트 하는 복 막 대 식 세포의 사용에 있습니다. 최근, 대 식 세포 활성화6,,78에 항 체의 효과 보여주는 여러 연구 되었습니다. 대 식 세포는 항 체 항 원, 및 LPS, 일반적으로 염증 성 자극 complexed 면역 단지와 활성화 공동 항 염증 성 사이토카인, IL-10와 프로-염증 성 cytokine의 매우 낮은 레벨의 매우 높은 수준의 생산 인터 루 킨 12 (IL-12)9. 또한, infliximab, TNFα에 대하여 단일 클론 항 체에 작동 하는, 부분적으로, 그것의 조각 crystallizable (Fc) 지역7염증 세포를 유도 하 여 발견 되었습니다. 우리 보고 IVIg + LPS M (IC + LPS), 공동 자극된 세포 많은 양의 IL-10과 23 p40 (또는 소 단위 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨 12의 낮은 금액을 생산 하는 점에서 유사한 항 염증 제 대 식 세포 활성화 유도 IL-12/23p40), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 그리고 TNF8. IVIg polyclonal 항 체의 구성 하는 약 주로 IgG, 1000 명 이상의 기증자10의 혈액에서 풀링된 되는 이다. Idiopathic thrombocytopenic 혈관 등 만성 demyelinating 증, 면역 질환의 광범위 한 치료 하는 데 사용은 하지만 행동의 그것의 기계 장치는 완전히 이해11. 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물의 효과 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 평가 될 수 있다.
BMDMs 및 복 막 대 식 세포 대 식 세포 활성화에 특정 생물 의약품의 효과 테스트할 수 있습니다. 이 대 식 세포 소스를 사용 하 여 1 차 셀의 평가 허용 합니다. 예비 테스트 교양된 1 차 셀에 항 체의 적은 시간과 다른 시간이 소모 및 비싼 질병 모델 보다 통화 투자 필요 합니다. 주입 약을 건강 한 마우스에서 vivo에서, 그리고 셀을 절연 하 고 비보 전분석, 한 연구는 생물 의약품으로 치료에 영향을 미치는 질병 모델에서 대 식 세포 활성화 여부를 평가 하기 위해 보증을 확인할 수 있습니다.
대 식 세포 활성화 생체 외 및 생체 내에서 생물 학적 치료의 효과 직접 테스트 하는 몇 가지 연구, 우리의 기술을 대체 기술을 통해 이점을 제공 합니다. 현재 기술 포함 혼합된 셀 인구에서 생체 외에서주변 혈액 단 세포, 인간의 세포에는 반응 혼합된 림프 구 (미르) 또는 IVIg infliximab의 효과 같은 생물 학적 약물 효과 테스트 어디 효과 특정 세포 유형7,12에 표시 될 수 없습니다. BMDMs를 사용 하 여 복 막 대 식 세포는 유리 RAW264.7 세포, 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다, 같은 셀 라인을 사용 하 여 IL-12, LPS8,13에 대 한 응답. 대 식 세포 응답 ex vivo에 는 항 체 기반 약물의 효과 테스트 cytokine 응답 대 식 세포, 직접 할당 될 수 있기 때문에 이점이 있다 보다는 혈 청 사이토카인 수준14 측정 하 여 대 식 세포 응답을 유추 . BMDMs 및 복 막 대 식 세포를 파생 하 고 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 있는 단백질의 특정 역할을 결정 하는 유전자 변형된 쥐에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 우리 Il10 결핍 사용(-/-) IVIg 유도 프로-염증 성 cytokine 생산의 감소는 IL-108에 부분적으로 의존을 설명 하는 BMDMs. 활동의 기계 장치는 약의 서 부 럽, 특정 단백질 및 신호 이벤트의 역할을 확인할 수 있습니다을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) BMDMs 또는 복 막 대 식 세포 항 체 활성화에 기인 하는 유전자 발현의 패턴을 보여주는 것에 수행할 수 있습니다. 질병 모델 생쥐에서 모델에서 항 체 기반 생물 학적 치료의 잠재적인 효 험에 염증 성 장 질환, 류 마티스 관절염과 암15,16, 같은 질병에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 17., 여기에 설명 된 기술 정보를 제공 합니다 이러한 생물 의약품의 행동의 메커니즘에 그들은 항 염증 제 대 식 세포 활동을 유도 하는 여부를 확인 하 여.

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

대 식 세포는 phagocytic 타고 난 면역 세포는 병원 체에 대 한 면역 응답을 시작 하 고 치유와 조직 회복을. 대 식 세포는 선 동적인 응답을 해제에 동등 하 게 중요 하다. 우리 세포 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)와 자극된의 다량 항 염증 성 사이토카인, 인터 루 킨 10 (IL-10), 그리고 세균 lipopolysaccharides (응답에서 프로 염증 성 cytokines의 저급 생산할 수 있는 것으로 나타났습니다. LPS)입니다. IVIg는 1000 명 이상의 혈액 기증자의 플라즈마에서 풀링된 다 원자가 항 체, 면역 글로불린 Gs (IgGs), 주로. 면역 결핍증 환자에서 항 체를 보완 하기 위해 또는 면역 또는 염증 성 조건 가진 환자에 있는 면역 반응 억제에 사용 됩니다. Infliximab, 치료 항 종양 괴 사 요인 알파 (TNFα) 항 체 또한 염증 성 자극에 대 한 응답에서 IL-10를 생산 하는 세포를 활성화 하기 위해 표시 되었습니다. IVIg 및 다른 항 체 기반 생물 의약품은 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 확인 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 이 문서에는 파생, 자극, 및 murine 골 수 세포를 체 외에서 항 체에 의해 활성화와 murine 복 막 대 식 세포 항 체 비보와 활성화의 평가 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 항 염증 제 대 식 세포 활동 통로 신호 하는 특정 셀의 기여를 결정 하 게 더 럽 히기 서쪽의 사용을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 특정 protein(s)의 효과 결정 하 유전자 변형된 생쥐와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 biologics 세포 선 동적인 응답 비보를 감소 시키는 IL 10 생산 하는 항 염증 제 활성화 상태를 변경 하 여 행동 수 있습니다 여부를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 질병 모델 생쥐, 동안 생물 의약품의 효능에 대 식 세포 활성화의 역할에 대 한 정보를 제공 하 고 사람에서 행동의 잠재적인 새로운 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 반대로,이 수 주의 특정 항 체 기반 생물 의약품의 사용에 대 한 전염 성 질병을 치료 하 대 식 세포는 감염에 대 한 호스트 방어에 중요 한 역할을 재생 하는 경우에 특히.

Murine 뼈 골 수 유래 세포 aspirates 골 수에서에서 조 혈 세포 선구자에서 경작 될 수 있습니다. 일반적으로 화관과 tibias 한 C57BL/6 마우스의 풀링 골 aspirates 항복 107 파생 된 골 수 세포, 그들에 게 실험에 대 한 대 식 세포의 편리한 소스를 만들기. BMDMs 항 체 기반 약물 응답은 염증 성 자극에 체 외에도전 하는 경우 테스트에 사용할 수 있습니다. 그림 1 에서는 그 IVIg 브랜드 Gammunex (GX) + LPS 항 염증 성 사이토카인의 생산을 증가 하는 IL-10, 7-fold LPS 자극 혼자 (그림 1A)에 비해과 생산의 IL-12/23 p 40 (그림 1 감소 B). 그림 1 는 또한 다른 IVIg 준비 다르게 수행 하는 방법을 보여 줍니다. IVIg의 3 개의 다른 준비는 IL-12/23 p 40 크게 (그림 1B), Octagam (와)과 Gammagard를 줄일 수 있지만 액체 (GL), 크게 증가 하지 IL-10 생산 LPS (그림 1 에 대 한 응답 A). OG와 GL 응답 LPS, 하지만 GX 보다 낮은 학위 IL-12/23 p 40 생산을 크게 줄일 수 있습니다. 이러한 결과 항 체에 영향을 미치는 골 대 식 세포 활성화, 파생 그리고 응답에 변화를 일으킬 수 있는 동일한 약의 준비의 차이점을 보여 줍니다.
BMDMs 서양 blotting에 의해, IVIg의 기계적 효과 테스트를 사용할 수 있습니다. IC + LPS로 활성화 한 대 식 세포 분열 활성화 단백질 (지도) kinases, p38, Erk1/2, 증가 IL-10 생산21에 대 한 책임은의 인 산화를 증가 했다. 그림 2 에 결과 표시 자극, 또는 LPS, IVIg, 또는 IVIg + LPS 자극 되어 대 식 세포에 의해 IL-10 생산에 필요한 지도 키 니 아 제 활성화를 감지 하는 전형적인 서쪽 오 점. IVIg 자극 혼자 또는 IVIg + LPS 공동 자극 증가 활성화 지도 kinases의 LPS 혼자와 본에 비해 이전 및 장기간 인 산화와 Erk1/2. P38의 활성화는 세포 IVIg + LPS 혼자 그 자극에 비해 LPS 자극된에 이전 발생 했습니다. 이 결과 세포 신호에 BMDMs 항 체 약물의 효과 보여 서 부 럽, 같은 메서드를 사용할 수 있습니다 보여 줍니다. Cytokine 생산, 뿐만 아니라 항 염증 제 대 식 세포 활성화 되었음을 보여 지도 키 니 아 제 활성화를 사용할 수 있습니다.
성숙, 조직 주민 대 식 세포 수도 있습니다 IVIg 5.0 x 105 에 대 한 응답을 평가 하는 쥐에서 격리-1.0 x 106 복 막 대 식 세포는 하나의 건강 한 C57BL/6 마우스에서 격리 될 수 있습니다. 그림 3에서 마우스 IVIg 주사에서 복 막 세포 크게 늘리지 마십시오 자극에서 생체 외에서PBS 주입 마우스에 비해의 부재에서 IL-10 생산. IVIg에서 복 막 세포 주입 했을 때 마우스는 ex vivoLPS로 자극, 그들은 6-fold 더 IL-10 PBS를 주입 하는 쥐 보다 생산. 그러나 그들은, 감지 금액의 IL-12/23 p 40 때 비보 전LPS로 자극을 생산 하지를 않습니다. 이러한 결과 입증 비보에 약물을 주입 하 고이 방법으로 세포 전 비보 를 경작 하 여 항 체 효과 세포에 시험 될 수 있다.
대 식 세포 항 체와 염증 성 자극 응답 평가 비보수 있습니다. Cytokine 생산 게 액체에서 평가 될 수 있다 그리고 supernatants ex vivo에서 에서 복 막 대 식 세포를 자극. 그림 4 는 항 염증 성 cytokine IL-10 때에 게 액체(그림 4), 복 막 세포 (그림 4B), 그리고 복 막 대 식 세포 (그림 4C) 증가 마우스 IVIg + LPS PBS + LPS에 비해 도전입니다. 프로-염증 성 cytokine 소 단위, 일리노이-12/23 p 40의 생산에 게 액체만 교양된 복 막 대 식 세포, 상당히 절감 됩니다. 이 방법은 시험에 선 동적인 응답에 vivo에서 ex vivo항 체 의약품의 영향의 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig1.jpg"> 
그림 1 : IVIg와 LPS의 다른 브랜드와 공동 자극 응답에서 macrophage IL-10과 IL-12/23 p 40 생산. C57BL/6 MCSF 파생 된 골 수 세포 중 unstimulated (C) 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), 또는 IVIg + LPS. IVIg의 다른 브랜드의 세 가지 테스트를 했다: Gammunex (GX), Gammagard 액체 (GL)와 Octagam (와). 대 식 세포 supernatants 자극, 후 24 h를 수집 하 고 원심 분리에 의해 명백 하 게 했다. (A) IL-10과 IL-12/23 p 40 (B)에 대 한 ELISAs 수행 했다. 데이터는 대 식 세포에서 n = 3 독립적인 실험, 세포 실험, ELISAs 당 1 개별 마우스에서 중복에서 분석. 데이터는 의미 ± sd. *P &#60; 0.05, * * P &#60; 0.001, * * *P &#60; LPS 자극와 IVIg 사이 비교를 위해 0.0001 + LPS 공동 자극. 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 다중 비교 테스트 후와 통계 분석을 위해 사용 되었다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig2.jpg"> 
그림 2 : IVIg 활성화 대 식 세포에서 지도 키 니 아 제 활성화의 서쪽 오 점 분석. MCSF 파생 된 골 수 세포 했다 unstimulated 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), 또는 GX IVIg + LPS; 0, 10, 40, 또는 120 분 전체 세포 lysates (1.0 x 106 대/차선) 나트륨 라우릴 황산 염-polyacrylamide 대상이 됐다 위해 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)와 서양 p38 대 인 특정 항 체를 더 럽 히 고 세포 외 신호 통제 키 (Erk1/2), 뿐만 아니라 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH), 로드 제어로. 표시 된 결과 n = 3 독립적인 실험, 세포 실험 당 1 개별 마우스에서.3 독립적인 실험에서 평균 GAPDH 정규화 pp38 및 pErk1/2 단백질 수준, Densitometry 각 밴드 아래 표시 됩니다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig3.jpg"> 
그림 3 : IVIg 비보와 함께 도전 하는 쥐에서 대 식 세포에 의해 IL-10 생산. 8 주 된 C57BL/6 마우스 살 균 PBS (주입 제어) 또는 GX IVIg (2.5 g/kg) intraperitoneally 부여 했다. 1 시간 후 쥐 했다 안락사 하 고 복 lavages 수행 했다. 복 막 대 식 세포 부착 선택을 사용 하 여 격리 했다입니다. 대 식 세포 중 unstimulated (C) 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL). 셀 supernatants 수확 하 고 IL-10 ELISAs 24 h 후 명확히 했다. 데이터는 n에서 = 3 독립적인 실험, ELISAs에서에서 수행 하는 그룹 당 5 개별 마우스 중복에서 분석. 데이터는 의미 ± sd. * P &#60; 0.01 및 NS = 중요 한. 통계 분석은 양방향 ANOVA를 사용 하 여 여러 비교를 Sidak의 posttest를 수행 했다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig4.jpg"> 
그림 4 : IL-10과 IL-12/23 p 40 생산 IVIg + LPS 도전 쥐에서 vivo에서. 8 주 된 C57BL/6 마우스 컨트롤; PBS + LPS (0.2 µ g/g 몸 무게), intraperitoneally 주입 했다 또는 GX IVIg (2.5 g/kg 몸 무게) + LPS (0.2 µ g/g 몸 무게). 1 시간 후 쥐 했다 안락사 하 고 복 lavages 수행 했다. (A) Clarified 게 액체, (B) 단계 1 h 대 식 세포 부착, 복 막 세포에서 조절된 supernatants 명확히 하 고 (C) 명백 하 게 24 시간 복 막 대 식 세포 (Mφ) supernatants 했다에 대 한 분석 IL-10과 IL-12/23 p 40에 의해 애 란 데이터는 의미 ± SD n = 3 독립적인 실험에서 5 쥐 ELISAs와 중복에서 분석. P &#60; 0.05, * *P &#60; 0.01, * * *P &#60; 0.001, 및 NS = 중요 한. PBS + LPS를 주입 하는 쥐 IVIg + LPS는 학생의 t 시험을 사용 하 여 주입 하는 쥐를 비교 했다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.

Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K 조회수.  University of British Columbia. 항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

연구

면역학 및 감염병학

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Monocyte-Macrophage Assay를 이용한 적혈구 항체 유의성 예측(Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay)

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

항체에 반응하는 마우스 골수 유래 대식세포의 활성화(Activation of mouse bone marrow-derived macrophages in response to antibos)

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host Defense Mechanism

In Vivo Activation of Peritoneal Macrophages in Response to Antibodies in a Murine Model

Source: Kozicky, L., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the activation of a mouse&#39;s peritoneal macrophages using intravenous immunoglobulin and bacterial lipopolysaccharide. The co-stimulation activates the peritoneal macrophages into anti-inflammatory macrophages possessing immune regulatory activity.

쥐 모델에서 항체에 반응하여 복막 대식세포의 생체 내 활성화(In vivo Activation of peritoneal macrophages in response to antibodies in a murine model)

Source: Kozicky, L., et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.&#160;J. Vis. Exp. ...