Name: assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation at JoVE.com

La rosa è il destinatario del premio borsa di studio laureato 4-anno fellowship (4YF) University of British Columbia. L.M.S è il destinatario di un'associazione canadese di Gastroenterologia / di Crohn e colite Canada / CIHR nuovo investigatore stipendio premio ed è uno studioso biomedica della Fondazione Michael Smith per ricerca di salute. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto dal Canadian Blood Services, in collaborazione con la canadese istituti di ricerca sanitaria (concessione n # CIHR2016-LS).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of British Columbia.
1. del midollo osseo del macrofago derivazione e attivazione con anticorpi
<ol>
	<li>Eseguire l'eutanasia usando CO2 asfissia.<ol>
		<li>Del mouse posto nella camera di induzione. Eutanasia, mouse con 5% isoflurane anestesia, per 60-90 s, fino a quando l'immobile e la respirazione è profondo e lento.</li>
		<li>Spegnere l'anestesia isoflurano e amministrare di CO2 del 6-8 L/min fino a quando il mouse ha smesso di respirare. Lasciare mouse con CO2 per almeno altri 5 min verifica che non c'è più un battito cardiaco o la respirazione. Eseguire una dislocazione cervicale per assicurare la morte. Nota: 8-12 settimane vecchi topi forniscono il più alto rendimento dei macrofagi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spray gambe del mouse con etanolo al 70% e bloccarli con braccia e gambe distese nella posizione supina sopra un bordo della gomma piuma. Con forbici e pinze per tenere la pelle, fate un taglio superficiale (0,2 cm) per rimuovere la pelle e del pelo dalla superficie di ciascuna delle zampe posteriori. Nota: Eseguire questa procedura e tutte le manipolazioni di cultura del tessuto in una cappa sterile.</li>
	<li>Tagliare il muscolo per rendere visibile delle tibie e femori. Rimuovere le tibie e femori, tagliando l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Tagliare come muscolo molto possibile.</li>
	<li>Spruzzare le ossa con etanolo al 70% e attendere 1 minuto per farlo evaporare, poi metterli in ben 6 piastra di medie a livello osseo (Iscove modificato medio di Dulbecco (IMDM), 10% siero bovino fetale (FBS)).</li>
	<li>Tagliare le estremità delle ossa di taglio 0,1 cm dell'osso fuori della caviglia e la parte superiore del femore in modo che la cavità dell'osso è esposto. Assicurarsi che il midollo è visibile e un ago di 26 calibro può essere posizionato nella cavità dell'osso.</li>
	<li>Tagliare le ossa e i muscoli per separare le tibie e femori da articolazioni del ginocchio. Inserire un ago di 26 calibro collegato a una siringa da 10 mL nella cavità. Sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 50 mL con 5 mL di osso a filo medio. Lavare due tibie e due femori, da un mouse, in ogni provetta da 50 mL.</li>
	<li>Pipettare su e giù parecchie volte o vortice il midollo a bassa velocità per disperdere delicatamente ciuffi. Stringhe del midollo devono essere suddiviso in macchie di piccolo (meno di 0,5 mm) del midollo. Riempire la provetta conica a 50 mL con l'osso a filo medio. Pipetta contenuto della provetta conica in una cultura di tessuto2 75 cm trattati boccetta e incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per 1 h. Nota: Macrofagi maturi e cellule mesenchimali diventerà aderente al pallone ed essere scartato, mentre i progenitori ematopoietici desiderati rimangano in sospensione.</li>
	<li>Dispensare il mezzo con progenitori ematopoietici in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare la provetta a 300 x g e a temperatura ambiente per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura (MCSF) fattore di stimolazione della Colonia del macrofago (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro18. Aggiungere il terreno per risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL, 1,5 x 107 cellule/boccetta in 30 mL di terreno e pipettare su e giù delicatamente. Pipettare 30 mL di sospensione in un matraccio da nuova coltura di tessuti trattato2 di 75 cm.</li>
	<li>Il giorno 4 e 7 ° giorno dopo la coltura iniziale nel passaggio 1,9, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificata utilizzando un microscopio a campo chiaro contrasto fase invertita. Scartare il supporto che contiene le cellule non-aderenti. Lavare le cellule con IMDM una volta e aggiungere 30 mL di terreno di coltura MCSF.</li>
	<li>Quando le cellule sono mature di giorno 10 (&#62; 95% positivo per F4/80 e Mac-1), verificare di nuovo che le cellule sono aderenti e leggermente.</li>
	<li>Piastra di cellule per stimolazioni, rimuovere il terreno di coltura dalla beuta e aggiungere 8 mL di tampone di enzima libero, basato su EDTA cella dissociazione (Tabella materiali). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Raschiare delicatamente, cellule con una piccola quantità di pressione, con una spatola sterile cella. Check-nel microscopio che cellule staccato dalla superficie del pallone. Pipettare cellule dissociate in una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il matraccio 3 volte con 5 mL di IMDM e piscina la soluzione di risciacquo con le cellule che sono state raccolte. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura MCSF a tubo conico da 50 mL. Conteggio di cellule vitali utilizzando un emocitometro18. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e piastra 100 µ l di sospensione cellulare (1 x 105 cellule/pozzetto) per pozzetto di una cultura di tessuto 96 pozzetti trattata, piatto fondo piatto. Nota: Le ossa da un mouse genererà abbastanza cellule per 100 pozzi. Se lo si desidera, 1 mL di cellule può essere placcato in una piastra a 6 pozzetti (coltura di tessuti trattati, fondo piatto). Un numero maggiore di cellule (1 x 106 cellule) può essere utile per analisi western blot.</li>
	<li>Una volta che è aderente, stimolare duplicato o triplicato pozzetti ciascuna con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg, o IVIg + LPS. Dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplice copia come controlli non stimolati. Li Incubare per 24 h (37 ° C, 5% CO2). Nota: Ri-placcate cellule dovrebbero aderire pozzi di coltura del tessuto all'interno di 1 h.</li>
	<li>Raccogliere i surnatanti delle cellule da ciascun pozzetto in microcentrifuga individuali 1,7 mL e rimuovere particelle estranee di filatura a 10.000 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante delle cellule ed evitare di disturbare il pellet. Mettere la cella chiarificata surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile. Nota: I surnatanti delle cellule possono essere analizzati per citochine, IL-10 e subunità di citochina, IL-12 / 23p 40, dall'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) immediatamente, o conservati a-80 ° C a lungo termine. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Altre citochine pro-infiammatorie può essere analizzato, come IL-6 e TNF, come sono anche ridotti dal co-trattamento con IVIg + stimolazione dei LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo. Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche quali macchiarsi occidentale o quantitativa della polimerasi reazione a catena (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. impegnativo topi In Vivo con IVIg e macrofagi peritoneali di raccolta
<ol>
	<li>Pesare ogni mouse.</li></ol>Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo per ogni mouse. Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di IVIg è richiesto.
	<li>Disegnare la quantità necessaria di IVIg in una siringa sterile da 1 mL dotata di una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, somministrare un volume equivalente di dose di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 invece di IVIg.</li>
	<li>Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.</li>
	<li>Posizionare l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, in rilievo fino e inserire 1,5 cm dell'ago. Iniettare l'IVIg o PBS intraperitonealmente. Aspettare 1 ora.</li>
	<li>Eutanasia di topi con l'anestesia di isoflurano 5% seguita da 6-8 L/min CO2 asfissia (vedere i passaggi 1.1.1 - 1.1.2), o secondo orientamenti etici dell'istituzione.</li>
	<li>Pin il mouse a un bordo della gomma piuma, con le membra sparse. Spruzzare le parti con etanolo al 70%. Nota: Eseguire la procedura in una cappa sterile.</li>
	<li>Fate un taglio superficiale della pelle (0,2 cm) con le forbici lungo la linea mediana del mouse, per evitare di tagliare la cavità peritoneale. Tirare la pelle addominale fuori pancia del mouse usando il forcipe, affinché il rivestimento della parete peritoneale intatto è visibile.</li>
	<li>Riempire una siringa da 5 mL con 5 mL di PBS sterile (pH 7.4). Inserire un 25 o 27 ago nella parte superiore della cavità da sinistra o da destra verso il centro del mouse con la smussatura dell'ago del manometro fino. Nota: Inserire l'ago con attenzione nel topo affinché non si inietti PBS negli organi, ma piuttosto, nello spazio peritoneale.</li>
	<li>Spingere il fluido nella cavità peritoneale. Estrarre l'ago dalla cavità e massaggiare il peritoneo per 10 s per rimuovere tutte le cellule. Inserire l'ago nella parte superiore della cavità ed evitare gli organi. Raccogliere e mettere il liquido di lavaggio recuperato in una provetta conica da 15 mL sul ghiaccio. Nota: Per ogni 5 mL di fluido iniettato, saranno recuperati circa 3,75 mL.</li>
	<li>Ripetere l'iniezione e recupero (passaggi 2,8-2,9) 3 più volte (volume di iniezione totale di 20 mL), per recuperare 15 mL di liquido di lavaggio in totale. Raccogliere il lavaggio da ogni mouse in una provetta conica separato da 15 mL. Nota: Dopo l'ultima iniezione, potrebbe essere più facile estrarre il liquido dal lato lontano destro e sinistro del mouse, dove ha accumulato fluido. Gli organi causerà meno interferenze con l'ago in questa posizione.</li>
	<li>Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 μL di placcatura medio (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina) per topo svuotata. Conta Vitali macrofagi utilizzando un emocitometro18. Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali. Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio. Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi per rimuoverli, utilizzando il buffer di lisi del globulo rosso di 1x secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Risospendere le cellule in mezzo a 1 x 106 macrofagi/mL di placcatura e 100 μL per pozzetto in una piastra di coltura di tessuti trattato 96 pozzetti piatto inferiore della lastra. Nota: Potrebbe essere necessario al pool di cellule da più di un mouse per un esperimento se utilizza in triplice copia pozzi o titolazione stimolanti. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria. Non ci sarebbe abbastanza cellule per 5 pozzi, o 1 esperimento in duplice copia, con una dose di LPS.</li>
	<li>Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente. Le cellule aderenti sono macrofagi peritoneali. Rimuovere i surnatanti delle cellule e cellule non aderenti. Lavare i pozzetti due volte con 200 μL IMDM (pre-riscaldato a 37 ° C), attendere 10 s e lentamente inclinare il piatto. Sostituire il mezzo di placcatura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 per 30 min prima della stimolazione.</li>
	<li>Stimolare i macrofagi con 10 ng/mL di LPS in IMDM, o lasciare non stimolate, come un controllo. Incubare per 24 h, raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule (vedere i passaggi 1.16-1.17) per analisi di citochina IL-10 da ELISA. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Nota: Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR.</li>

3. impegnativo topi in Vivo con IVIg + LPS e macrofagi peritoneali di raccolta
<ol>
	<li>Pesare ogni mouse. Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo. Calcolare la quantità di LPS (concentrazione stock 100 μg/mL in IMDM) necessaria per fornire una dose finale di 0,2 μg/g di peso di corpo. Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di soluzione madre di IVIg e 40 µ l di una soluzione di 100 μg/mL di LPS è richiesti.</li>
	<li>Disegnare la quantità necessaria di IVIg e LPS in una siringa sterile da 1 mL con una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, è possibile sostituire un volume equivalente di IVIg con PBS sterile a pH 7,4.</li>
	<li>Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.</li>
	<li>Posto l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, smussato e inserire 1,5 cm. iniettare le IVIg + LPS, o PBS + LPS, intraperitonealmente as in passaggio 2.4.</li>
	<li>Dopo 1h, raccogliere macrofagi peritoneali attenendosi alla procedura 2.5-2.10.</li>
	<li>Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere 1 mL di fluido di lavaggio recuperati e utilizzare per IL-10 e IL-12 / 23p 40 analisi di ELISA secondo le istruzioni del produttore o congelare a-80 ° C per le analisi future. Nota: Per garantire il confronto puntuale tra i trattamenti per l'analisi di citochina fluido di lavaggio, eseguire Internetlittlereno 5ml della cavità peritoneale 4 volte per un volume finale di 15 mL. Non tutto il liquido sarà recuperato da ogni filo.</li>
	<li>Come descritto al punto 2.11, risospendere e contare i macrofagi praticabili. Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali.</li></ol>Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio. Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi secondo le istruzioni del produttore per rimuoverli, come descritto al punto 2.11.
	<li>Come descritto al punto 2.12, risospendere le cellule in medium di placcatura. Nota: Potrebbe essere necessario alle cellule di piscina da più di un mouse per un esperimento. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria.</li>
	<li>Come in 2.13, incubare le cellule per 1 h a 37 ° C 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente.</li>
	<li>Raccogliere e chiarire il medium condizionato, secondo passi 1.14-1.15, da tutte le cellule peritoneali. Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o congelati e conservati a-80 ° C per l'analisi di cytokine Elisa.</li>
	<li>Eseguire il passaggio 2.11, ma Incubare le cellule per 24 h non stimolate. Raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule, secondo passi 1.16-1.17, per l'analisi di cytokine Elisa. Nota: Le cellule possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR, come in passaggi 1.16-1.17 e 2.14.</li>

<ol>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto22. Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente3. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è importante per lo spegnimento della risposta infiammatoria2 . L'attivazione del macrofago antinfiammatori richiede due stimoli esterni per i macrofagi a produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria IL-10 e basse quantità di citochine pro-infiammatorie, quali IL-1223. Un segnale proviene da anticorpi che agiscono attraverso i recettori Fc gamma, e il secondo segnale è uno stimolo pro-infiammatorie, come LPS o IFNγ24,25. Siero, gli immunocomplessi e anticorpi anti-TNF, sono stati trovati per indurre uno stato di attivazione antinfiammatoria IL-10-produing alto in macrofagi8,23,25,26. Il nostro gruppo ha precedentemente pubblicato che del midollo osseo murino derivate macrofagi e macrofagi peritoneali stimolate con IVIg inoltre producono elevate quantità di IL-10 e poco a nessun pro-infiammatorie IL-12 / 23p 40 in risposta a LPS8. Abbiamo anche trovato che altre citochine pro-infiammatorie, TNF e IL-6 sono anche ridotti di IVIg in derivazione midollare macrofagi8. I metodi descritti qui possono essere applicati per testare altre risposte anticorpali basato di droga in mouse BMDMs e macrofagi peritoneali in vitro e in vivo.
Ci sono molti passaggi critici in fase di test basati su anticorpi terapeutica il midollo osseo di topo e macrofagi peritoneali. Mantenere la sterilità è importante per ogni protocollo. Se culture del macrofago sono contaminate con microrganismi provenienti dall'aria, pelliccia o feci dei topi, i macrofagi risponderà a tali stimoli con la produzione di citochine pro-infiammatorie. Esecuzione di tutti gli esperimenti in una cappa di biosicurezza, il mouse di spruzzatura liberalmente con etanolo e garantendo l'integrità dell'intestino durante peritoneale vampate sono essenziali. L'anticorpo deve anche rimanere sterili e conservati secondo le istruzioni del fabbricante. Non può essere utilizzato se è contaminata, scaduti o torbidi. Torbidità diminuirà l'efficacia del farmaco e può verificarsi se il farmaco non viene memorizzato alla temperatura adeguata o per troppo tempo è stato memorizzato. IVIg può essere conservato a 4 ° C e solo utilizzato prima della data di scadenza è raggiunto, poiché i livelli di produzione di IL-10 possono essere influenzati. In alternativa, abbiamo visto che può essere congelato a-20 ° C con nessun effetto sulle risposte. Diversi lotti di IVIg conducono a risultati sperimentali simili, mentre diversi tipi di preparazioni di marca di IVIg, come illustrato nella Figura 1, possono causare reazioni diverse nei macrofagi. I controlli essenziali, come stimolate le cellule e le cellule stimolate con anticorpo da solo, devono essere incluso in ogni esperimento per escludere la contaminazione dei macrofagi o della droga.
Parecchie modifiche possono essere fatto a questi protocolli per personalizzare un esperimento. Nello stato non infiammata, può essere difficile isolare abbastanza macrofagi peritoneali per grandi esperimenti. Macrofagi peritoneali possono essere suscitati tramite l'iniezione intraperitoneale di tioglicolato (TG). Si verifica una risposta immunitaria, e dopo 4 giorni, hanno suscitato i macrofagi peritoneali possono essere raccolto27. I macrofagi reclutati possono essere meno maturi e non rappresentano le cellule residenti, come abbiamo usato qui, che sono considerazioni importanti. TG-suscitata macrofagi potrebbero anche hanno interiorizzato agar dal brodo TG, che può essere una complicazione, particolarmente se facendo esperimenti sulla fagocitosi27. Topi da diversi background genetici, C57BL/6 o BALB/c, possono anche essere utilizzati per esperimenti e possono essere scelti per esaminare l'impatto degli anticorpi sulle risposte del macrofago che saranno valutati in modelli di malattie che richiedono uno specifico background genetico. Inoltre, topi geneticamente modificati, come Il10- / - mouse, possono essere usati per valutare la funzione delle proteine specifiche nel meccanismo di azione di un farmaco, come abbiamo fatto nel nostro lavoro8. Diversi stimoli infiammatori è utilizzabile anche per valutare l'impatto degli anticorpi su attivazione macrofagica. IFNγ e host derivato toll-like receptor (TLR) agonisti (ad es. acido ialuronico), sono stati utilizzati per attivare la produzione di IL-10 macrofagi25,28. Una considerazione importante è la dose dell'anticorpo. La dose dovrebbe essere titolata per ottenere la dose ottimale nella cultura e negli esperimenti sugli animali, come sarà diverso tra anticorpi, come pure i fornitori. La dose scelta dovrebbe anche riflettere la dose somministrata agli esseri umani e varierà tra farmaci. IVIg è dato come una terapia antinfiammatoria ad alte dosi (25-35 mg/mL o 2 g/kg peso corporeo), che riflette la titolata dosi utilizzate in questi protocolli29,30.
L'uso del midollo osseo e macrofagi peritoneali hanno limitazioni. Anche se un miglioramento rispetto le linee cellulari del macrofago, BMDMs del mouse sono cellule ancora artificialmente derivate dai precursori ematopoietici. Test risposte immunitarie dei macrofagi in vitro è un passo importante per le risposte dell'anticorpo di comprensione, ma in vivo gli esperimenti devono essere eseguite come bene. Iniezione di stimoli in vivo seguita da coltura cellule ex vivo, può fornire ulteriori informazioni per gli studi futuri di indagare se farmaci a base di anticorpi possono anche attivare i macrofagi antinfiammatori in uno stato di malattia. Non è possibile trarre conclusioni su ciò che si verifica in persone che ricevono farmaci biologici basati su anticorpi da questi esperimenti. Pochi studi sono stati pubblicati per valutare gli effetti di IVIg su monocito umano derivato macrofagi in vitro. Una riduzione del numero di IL-6 produce monociti umani in vitro sono stati segnalati, quando IVIg è co-stimolati con LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo12. IVIg riduce TNFα e produzione di IL-6 quando stimolati con procalcitonina (PCT) in essere umano THP-1 monocytic cellule31.
I protocolli all'interno di questa carta hanno vantaggi rispetto ai metodi esistenti. Midollo osseo derivato macrofagi e macrofagi peritoneali sono cellule primarie, isolate direttamente dai topi, piuttosto che essere immortalato linee cellulari.Linee macrofago-come mouse, quali cellule RAW 264.7, non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta ai LPS, che è un'importante citochina che è regolata da l'IL-10 che viene prodotta in risposta a IVIg8,13. Una droga test in vivo con LPS permette l'esame dell'effetto del farmaco sull'ambiente peritoneale locale attraverso l'analisi del fluido di lavaggio, cellule peritoneali e in particolare, i macrofagi peritoneali. È un a breve termine, il modello semplice che può fornire informazioni importanti per giustificare l'esame degli effetti non specifici di anticorpi su attivazione macrofagica in più lunghi e più costosi modelli animali della malattia. Ha un vantaggio rispetto ai modelli di endotossiemia dove la misura sperimentale è spesso solo mouse sopravvivenza o citochine in siero14. I tassi di sopravvivenza e citochine del siero sono misure importanti della risposta immunitaria, ma non mostrano il contributo che i macrofagi possono avere in particolare. Isolamento e coltura di macrofagi peritoneali da un esperimento di sfida Mostra un effetto diretto e misurabile che terapeutica dell'anticorpo possa avere sulla funzione del macrofago.
Questi metodi hanno applicazioni per test e la progettazione di terapie biologiche. L'uso di anticorpi come terapeutica è aumentato drammaticamente negli ultimi anni. Tuttavia, queste terapie possono avere ulteriori effetti sconosciuti sui macrofagi che possono riconoscere la porzione Fc dell'anticorpo e cambiare la loro produzione di citochina. L'anticorpo anti-TNF, infliximab, è stato indicato per indurre IL-10 e sopprimere la proliferazione delle cellule T attraverso la porzione Fc, e che è stato proposto come uno dei suoi meccanismi di azione7,15,26. Utilizzando modelli genetici, proteine specifiche possono essere implicate nel meccanismo di come questi farmaci influenzano l'attivazione del macrofago. Classi di anticorpi IgG e preparazioni a base di anticorpi possono essere modificate per modificare come macrofagi sono colpiti da biologics. I nostri dati indicano la preparazione e/o deposito del farmaco stesso anticorpo (IVIg) possa avere un impatto relativo effetti sull'attivazione del macrofago. I metodi all'interno di questa carta è utilizzabile per progettare le terapie che non hanno questi effetti, che possono essere fondamentali per mantenere immunosorveglianza durante terapie del cancro, dove i macrofagi infiammatori potrebbero promuovere la progressione del tumore. Queste tecniche potrebbero essere utilizzate anche per progettare e valutare i farmaci che hanno questi effetti, se opportuno. Ad esempio, potrebbe essere utile per ridurre le risposte infiammatorie dei macrofagi e creare i macrofagi producono IL-10 anti-infiammatori per migliorare il trattamento per le malattie infiammatorie intestinali o artrite reumatoide.

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell'avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta1. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l'interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3) macrofagi stimolati con immunocomplessi (IC) e LPS, M (IC + LPS), che hanno la capacità di spegnere la risposta infiammatoria2,3. M (IC + LPS) sono distinti dai macrofagi di cicatrizzazione M(IL-4) e non esprimono l'arginasi enzima (Arg-1) o FIZZ14. Il miglior marcatore per questi macrofagi infiammatori è loro cytokine produzione5. I macrofagi hanno ruoli multipli nel mantenimento della salute, ma anche contribuiranno a malattie infiammatorie e cancro3. Per questo motivo, i macrofagi sono un fondamentale obiettivo terapeutico per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. È importante studiare gli effetti degli anticorpi sul loro stato di attivazione di sviluppare trattamenti basati su macrofago per malattia.
Il focus di questa carta è sull'uso dei macrofagi del midollo osseo murino derivato (BMDMs) e macrofagi peritoneali di testare l'effetto di droghe dell'anticorpo su risposte infiammatorie in vitro e in vivo. Recentemente, ci sono stati più studi che mostrano gli effetti degli anticorpi il macrofago attivazione6,7,8. Macrofagi co-attivati con complessi immuni, che sono anticorpi complessati con un antigene e LPS, uno stimolo infiammatorio normalmente, producono livelli molto elevati della citochina antinfiammatoria IL-10 e livelli molto bassi di citochina pro-infiammatoria, interleuchina 12 (IL-12)9. Inoltre, infliximab, un anticorpo monoclonale contro il TNFα, è stato trovato a lavorare, in parte, inducendo antinfiammatori macrofagi attraverso suo frammento cristallizzabile (Fc) regione7. Abbiamo segnalato che IVIg + LPS inducono l'attivazione del macrofago antinfiammatori che è simile a M (IC + LPS), in cui co-stimolato i macrofagi producono grandi quantità di IL-10 e basse quantità della subunità citochina pro-infiammatoria Interleukin 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) e TNF8. IVIg è un farmaco composto da anticorpi policlonali, principalmente IgG, che è stata riunita dal sangue di più di 1.000 donatori10. Esso è usato per trattare una vasta gamma di malattie immunologiche, come purpura thrombocytopenic idiopatico e polineuropatia demielinizzante cronica, ma il suo meccanismo d'azione non è completamente capito11. Gli effetti delle droghe dell'anticorpo basato sull'attivazione del macrofago possono essere valutati utilizzando i metodi descritti nel presente documento.
Gli effetti dei farmaci biologici specifici sull'attivazione del macrofago possono essere testati in BMDMs e macrofagi peritoneali. Utilizzando queste fonti del macrofago consente la valutazione di cellule primarie. Test preliminari di anticorpi su cellule in coltura primaria richiede meno tempo e investimento monetario rispetto ad altri modelli di malattia che richiede tempo e costoso. Iniettare una droga in un topo sano in vivoe isolando le cellule e analizzarli ex vivo, si può determinare se gli studi sono autorizzati per valutare se il trattamento con farmaci biologici colpisce l'attivazione del macrofago in modelli di malattia.
Con pochi studi test direttamente l'effetto delle terapie biologiche sul macrofago attivazione in vitro e in vivo , le nostre tecniche forniscono un vantaggio rispetto a tecniche alternative. Le attuali tecniche comportano test effetti di farmaci biologici su cellule miste popolazioni in vitro, ad esempio l'effetto di infliximab in una reazione linfocitaria mista (MLR) o IVIg su macrofagi umani in cellule mononucleari di sangue periferico, dove l'effetto non può essere attribuita a una cella specifica tipo7,12. Utilizzando BMDMs e macrofagi peritoneali è vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari, quali le cellule RAW 264.7, che non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta a LPS8,13. Verificare l'effetto di un farmaco a base di anticorpi sul macrofago risposte ex vivo ha vantaggi perché risposte di citochina possono essere attribuite direttamente ai macrofagi, piuttosto che la deduzione di risposte del macrofago misurando i livelli di citochina del siero14 . BMDMs e macrofagi peritoneali possono essere derivati e isolati da topi geneticamente modificati per determinare il ruolo specifico di una proteina in attivazione macrofagica anti-infiammatori. Ad esempio, abbiamo utilizzato Il10 carente(- / -) BMDMs per dimostrare che IVIg-indotta di riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie dipende parzialmente dal-108. Meccanismo di azione di un farmaco può essere studiato usando macchiarsi occidentale, dove può essere determinato il ruolo delle proteine specifiche e segnalazione eventi. Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) può essere eseguita su BMDMs o macrofagi peritoneali di mostrare pattern di espressione genica che derivano dall'attivazione dell'anticorpo. Modelli di malattia in topi possono fornire informazioni sull'efficacia potenziale di anticorpo-ha basato le terapie biologiche nei modelli per le malattie infiammatorie intestinali malattia, artrite reumatoide ed il cancro15,16, 17. Tuttavia, le tecniche qui descritte forniranno informazioni sul meccanismo di azione di questi farmaci biologici determinando se essi inducono l'attività antinfiammatoria del macrofago.

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

I macrofagi sono fagocitiche cellule dell'immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l'immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull'attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l'utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l'effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell'attivazione macrofagica nell'efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l'uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro l'infezione.

Macrofagi derivato del midollo osseo murino possono essere coltivati da precursori di cellule ematopoietiche nel midollo osseo aspira. Il midollo osseo aspira pool da femori e tibie di un topo C57BL/6 in genere resa 107 derivata midollare macrofagi, che li rende una fonte conveniente dei macrofagi per esperimenti. BMDMs può essere utilizzato per verificare le risposte di droga dell'anticorpo basato quando sfidato con uno stimolo infiammatorio in vitro. La figura 1 Mostra quel marchio di IVIg, Gammunex (GX), + LPS aumenta la produzione della citochina antinfiammatoria, IL-10, 7 volte rispetto alla stimolazione dei LPS da solo (Figura 1A) e diminuisce la produzione di IL-12/23 p 40 (Figura 1 B). Figura 1 dimostra anche che diverse preparazioni di IVIg eseguano in modo diverso. Anche se le tre diverse preparazioni di IVIg sono in grado di diminuire IL-12 / 23p 40 significativamente (Figura 1B), Octagam (OG) e Gammagard liquido (GL), non aumentare significativamente la produzione di IL-10 in risposta ai LPS (Figura 1 A). OG e GL sono in grado di ridurre significativamente la produzione di IL-12/23 p 40 in risposta ai LPS, ma in misura minore rispetto a GX. Questi risultati dimostrano che l'anticorpo colpisce midollo osseo derivato attivazione macrofagica, e che ci sono differenze tra le preparazioni del farmaco stesso che può causare cambiamenti nelle risposte.
BMDMs può essere utilizzato per testare gli effetti meccanicistici di IVIg, mediante western blotting. Macrofagi attivati con IC + LPS hanno aumentato la fosforilazione delle chinasi della proteina (mappa) attivate mitogene, p38 ed Erk1/2, che sono responsabili per la produzione di IL-10 aumentata21. Risultati nella Figura 2 mostrano una tipica macchia occidentale per rilevare l'attivazione di chinasi mappa necessaria per la produzione di IL-10 dai macrofagi che sono non stimolate, o sono stati stimolati con LPS, IVIg, o IVIg + LPS. IVIg stimolazione da solo o IVIg + LPS co-stimolazione aumentata attivazione delle MAP chinasi, Erk1/2, con fosforilazione precedente e prolungata rispetto a quello osservato con LPS da solo. Attivazione di p38 si è presentata precedentemente in macrofagi stimolati con IVIg + LPS rispetto a quelle stimolate con LPS da solo. Questi risultati indicano che metodi come macchiarsi occidentale, utilizzabile per mostrare gli effetti delle droghe dell'anticorpo su BMDMs di segnalazione delle cellule. Oltre alla produzione di citochine, l'attivazione della chinasi della mappa può essere utilizzato per mostrare che si è verificato l'attivazione del macrofago anti-infiammatori.
Maturo, macrofagi residenti del tessuto possono anche essere isolati dai topi per valutare le risposte di IVIg 5,0 x 105 - 1.0 x 106 macrofagi peritoneali possono essere isolati da un sano del mouse C57BL/6. Nella Figura 3, macrofagi peritoneali dai topi iniettati con IVIg non aumentano significativamente produzione di IL-10 in assenza di stimolazione in vitro, rispetto ai topi di PBS iniettato. Quando i macrofagi peritoneali da IVIg iniettato i topi sono stimolati con LPS ex vivo, che producono IL-10 6 volte di più rispetto ai topi iniettati con PBS. Non, tuttavia, producono quantità rilevabili di IL-12 / 23p 40 quando stimolati con LPS ex vivo. Questi risultati dimostrano che gli effetti dell'anticorpo possono essere testati sui macrofagi iniettando il farmaco in vivo e la coltura di cellule ex vivo con questo metodo.
Macrofago risposte agli anticorpi e stimoli infiammatori possono essere valutati in vivo. La produzione di citochina può essere valutata nel fluido di lavaggio e in surnatanti di ex vivo ha stimolato i macrofagi peritoneali. La figura 4 Mostra la citochina antinfiammatoria IL-10 è aumentata nel fluido di lavaggio (Figura 4A), cellule peritoneali (Figura 4B) e macrofagi peritoneali (Figura 4C) quando topi sono sfidati con IVIg + LPS rispetto a PBS + LPS. Produzione della citochina pro-infiammatoria subunità, IL-12 / 23p 40, è ridotto significativamente in macrofagi peritoneali coltivati, ma non nel liquido di lavaggio. Questo metodo consente l'esame dell'impatto di un farmaco anticorpo su risposte infiammatorie in vivo come pure ex vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig1.jpg"> 
Figura 1 : Produzione del macrofago IL-10 e IL-12 / 23p 40 in risposta alla co-stimolazione con diverse marche di IVIg e LPS. I macrofagi di derivazione midollare MCSF C57BL/6 erano entrambi non stimolate (C), o stimolate con LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), o IVIg + LPS. Sono stati testati tre diverse marche di IVIg: Gammunex (GX), liquido Gammagard (GL) e Octagam (OG). I surnatanti macrofago sono stati raccolti 24 h dopo stimolazione e chiarificati mediante centrifugazione. Elisa per IL-10 (A) e IL-12/23 p 40 (B) sono state eseguite. I dati sono per i macrofagi da n = 3 esperimenti indipendenti, con celle da singoli 1 mouse ogni esperimento, con Elisa saggiati in duplicato. Dati sono mezzi ± SD. *P &#60; 0.05, * * P &#60; 0.001, * * *P &#60; 0,0001 per confronto tra stimolazione dei LPS e IVIg + co-stimolazione dei LPS. Unidirezionale analisi della varianza (ANOVA) con post-test di Tukey per i confronti multipli sono stati utilizzati per analisi statistiche. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig2.jpg"> 
Figura 2 : Analisi di Western blot di attivazione della chinasi mappa in macrofagi attivati IVIg. MCSF derivato del midollo osseo macrofagi erano non stimolate o stimolate con i LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), o IVIg GX + LPS; per 0, 10, 40 o 120 min lisati di cellule intere (1.0 x 106 macrofagi/lane) sono stati sottoposti a sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) e western blotting con anticorpi fosfo-specifici per p38 ed extracellulare chinasi segnale-regolata (Erk1/2), come pure gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), come un controllo di carico. Risultati mostrati sono rappresentativi di n = 3 esperimenti indipendenti, con celle da singoli 1 mouse ogni esperimento.Densitometria per pp38 e livelli della proteina pErk1/2, normalizzata di GAPDH, in media da 3 esperimenti indipendenti sono indicati sotto ciascuna banda. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig3.jpg"> 
Figura 3 : Produzione di IL-10 dai macrofagi dai topi sfidati con IVIg vivo in. 8-settimana-vecchi topi C57BL/6 sono stati dati PBS sterile (controllo dell'iniezione) o GX IVIg (2,5 g/kg) per via intraperitoneale. Dopo 1 h, topi sono stati eutanasizzati e lavaggi peritoneali sono stati effettuati. Macrofagi peritoneali sono stati isolati mediante selezione di aderenza. I macrofagi sono stati entrambi non stimolate (C), o stimolate con LPS (10 ng/mL). I surnatanti delle cellule sono state raccolte e chiariti dopo 24 h per IL-10 ELISAs. I dati sono da n = 5 topi individuali per ogni gruppo eseguito in 3 esperimenti indipendenti, con Elisa saggiati in duplicato. Dati sono mezzi ± SD. * P &#60; 0,01 e NS = non significativo. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un ANOVA a due vie con posttest di Sidak per i confronti multipli. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56689/56689fig4.jpg"> 
Figura 4 : Produzione di IL-10 e IL-12 / 23p 40 da topi sfidati con IVIg + LPS in vivo. 8-settimana-vecchi topi C57BL/6 sono stati iniettati intraperitonealmente con sia PBS + LPS (peso corporeo di 0,2 µ g/g), come un controllo; o GX IVIg (2,5 g/kg di peso corporeo) + LPS (peso corporeo di 0,2 µ g/g). Dopo 1 h, topi sono stati eutanasizzati e lavaggi peritoneali sono stati effettuati. (A) chiarito dal fluido di lavaggio, (B) chiarito surnatanti condizionati da cellule peritoneali durante un passo di aderenza del macrofago di 1h, e (C) chiarito 24h surnatanti peritoneale del macrofago (Mφ) sono stati analizzati per IL-10 e IL-12 / 23p 40 da ELISA. Dati sono mezzi ± SD per n = 5 topi in 3 esperimenti indipendenti, con Elisa saggiati in duplicato. P &#60; 0.05, * *P &#60; 0,01, * * *P &#60; 0,001 e NS = non significativo. Topi iniettati con PBS + LPS sono stati confrontati ai topi iniettati con IVIg + LPS con il test t di uno studente. Questa figura è stata modificata da Cisar et al.8. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56689/56689fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Views.  University of British Columbia. Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Video: Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Effetto dell'anticorpo Anti-c-fms sulla formazione degli osteoclasti e la proliferazione dei precursori degli osteoclasti In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

Previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi utilizzando il test dei monociti-macrofagi

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Source: Kozicky, L. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Attivazione di macrofagi derivati dal midollo osseo di topo in risposta agli anticorpi

Source: Kozicky, L. et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation. J. Vis. Exp. (2017)
In ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immune Response

Host Defense Mechanism

In Vivo Activation of Peritoneal Macrophages in Response to Antibodies in a Murine Model

Source: Kozicky, L., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56689">Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the activation of a mouse&#39;s peritoneal macrophages using intravenous immunoglobulin and bacterial lipopolysaccharide. The co-stimulation activates the peritoneal macrophages into anti-inflammatory macrophages possessing immune regulatory activity.

Attivazione in vivo di macrofagi peritoneali in risposta agli anticorpi in un modello murino

Source: Kozicky, L., et al., Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation.&#160;J. Vis. Exp. ...