모든 현미경 W. M. 켁 현미경 센터 다니엘 피터 스의 지원 및 NIH 포상 S10OD016240의 지원으로 이루어졌다. S.L.F.는 NIH K08AI119142와 R21AI130281에 의해 지원 됩니다. 우리는 박사 리처드 Flavell 및 caspase-1/11 결핍 마우스, 박사 브래드 쿡 박사 브래드 쿡 실험실 시설 및 장비를 공유 하기 위한 감사 합니다.

모든 동물 절차 승인 되었고 워싱턴 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침의 대학에서 실시.
1입니다. 골의 수확
<ol><li>Aseptically는 마우스에서 대 퇴 골과 경골을 제거 하 고 불 임 악기를 사용 하 여 뼈를 청소. Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol + 50 mg/mL gentamicin 황산 + 10000 U/mL 페니실린/스 + 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, DMEM-10 완전 한) 청소 뼈를 놓고 알을 품는 15 분 동안 얼음에 튜브.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 인접 및 원심 볼 관절을 제거 합니다. 중간 뼈의 구 렁에 가득 10 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 삽입 합니다. DMEM-완전 한 10를 사용 하 여 골 수 밖으로 플러시. 어떤 덩어리를 pipetting 매체를 위아래로 부드럽게 하 여 resuspend.</li>
	<li>셀 300 x g에서 10 분 원심 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산. 이 시점에서, 90 %FBS + 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 사용 하 여 셀을 고정 하거나 접시 15cm L929 단련 중간 (단계 2.1)를 사용 하 여 세포 분화를 페 트리 접시에에서 셀.</li>
</ol>2. 골 수 유래 세포의 분화
<ol><li>미리 데워 진된 차별화 매체 (DMEM-10 완전 한의 21 mL 및 L929 세포 조절 매체 스완 손 외 에 설명 된 대로의 9 mL를 사용 하 여 18) 15 cm에서 골 수 세포를 넣어 조직 문화 취급 페 트리 접시 (1.2-1.5 x 107 셀). 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 하루 3 또는 4에 접시를 차별화 매체의 추가적인 30 mL를 추가 합니다. 참고: 그것은 중요 하다를 취급 하는 조직 문화 접시를 사용 하지 대 식 세포를 분리 하 고 수확 하기 어려울 것입니다.</li>
	<li>대 식 세포를 수집 하려면 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 접시를 세척 하 고 차가운 PBS + 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 20 mL를 추가 합니다. 셀 위에 PBS + EDTA를 pipetting으로 셀 10 분 수확에 대 한 4 ° C에서 접시를 품 어 하 고 PBS의 10 mL와 함께 접시를 씻어. 두 개의 15 mL 원뿔 튜브에 두 세척을 결합 한다.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g에서 세포를 원심 및 페 놀 레드 무료 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-글루타민 + 0.05 m m 2-mercaptoethanol, 5%의 10 mL에 셀 resuspend FBS (DMEM-5)는 hemocytometer 또는 Coulter 카운터 중 하나를 사용 하 여 셀을 카운트. 계산 하는 동안 얼음에 셀을 계속.</li>
	<li>2 x 105 셀/mL에 코팅 하는 조직 문화 접시에 있는 대 식 세포 씨앗 현미경 실험, coverslips 24 잘 플레이트에 셀의 1 mL 씨. LDH 방출 분석 실험, 96 잘 접시에 셀의 100 µ L 씨. LDH 분석 결과 대 한 9 웰 스 (3 웰 스 치료, 100% 세포 제어 3 우물과 실험 자극에 대 한 3 웰 스) 씨.</li>
	<li>특정 셀에 게 300 x g에 5 분 동안 원심 분리기는 96 잘 접시는 동등 하 게 잘 분산.</li>
	<li>못쓰게 프로세스를 시작 하기 전에 하룻밤에서 37 ° C + 5% CO2 접시를 품 어.</li>
</ol>3입니다. 애 벌 칠
<ol><li>100 ng/mL LPS 잘 접시 24에 대 한 500 μ (잘 접시는 96에 대 한 50 μ) 포함 된 신선한 매체 (DMEM-5)와 매체를 교체 합니다. 참고: 다양 한 LPS TLR4 중재 못쓰게19를 자극 하는 능력에 영향을 미치는 구조 변화 있다. 살 모 넬 라 미네소타 R595에서 LPS (Re) 여러 공급 업체에서 제공 하 고 것이 좋습니다.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO23 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
</ol>4. Nigericin와 NLRP3 Inflammasome 및 팸-YVAD-FMK로의 활성화
<ol><li>매체를 제거 하 고 290 μ DMEM-5 5 μ M nigericin 및 5mm 글리신의 바꿉니다. 글리신은 caspase-1 활성화5하는 동안 발생 하는 세포 세포의 양을 줄이기 위해 추가 됩니다. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어. 야생 유형 및 caspase-1 부족 한 대 식 세포를 사용 하 여 관찰된 변하면 caspase-1에 대 한 특정 되도록.</li>
	<li>마지막 45 분 동안 추가 30 10 μ x 팸-YVAD-FMK, 제조업체의 지침에 따라 준비.</li>
	<li>60 분 후에 매체를 제거 하 고 씻어 3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 셀.</li>
	<li>각 음을 2 %paraformaldehyde 250 μ를 추가 하 고 30 분 동안 알루미늄 호 일로 덮여 얼음에 품 어.</li>
	<li>마지막 5 분 동안 4 μ의 핵을 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩을 추가 합니다. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 다른 염료 상표 DNA 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>세 번 차가운 PBS의 1 mL로 세포 세척 하 고 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslips를 탑재. 장착 매체 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 대 식 세포를 이미지. 예 스 / 팸-YVAD-FMK에 대 한 Em 492/520nm 642/661 빨강 형광 핵 산 얼룩에 대 한. 현미경 치료 셀 488 채널에 얼룩 어떤 배경 표시 안 되도록 설정 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 배경 식구 들-YVAD-FMK 얼룩 감지 하 고 실제 활성 caspase-1 될 것입니다. 참고: 현미경 설정 섹션 6에서에서 설명 되어 있습니다.</li>
</ol>5. 항 체 얼룩이 지기
참고: ASC를 검출 하기 위하여 항 체와 함께 셀 라벨, 씨앗, 프라임 고 노출 셀 nigericin 이전 섹션에 동일 하. 처리 후는 다음과 같습니다:
<ol><li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 함께 차가운 PBS의 세포를 씻어. 고정 및 permeabilization 솔루션의 250 μ를 추가 합니다. 얼음에 셀을 품 어 그리고 30 분 동안.</li>
	<li>3 시간 5 분 동안 각 1 mL와 워시 버퍼의 대 식 세포를 씻어.</li>
	<li>ASC에 대 한 1 차적인 항 체의 250 μ 희석 1: 500 워시 버퍼에 추가 하 고 얼음에 1 시간에 품 어. 포함 한 coverslip 어떤 1 차 항 체에 영향을 받지 않는 하지만 보조를 받을 것 이다. 이 coverslip 올바른 오프셋을 설정 하는 현미경 설치 하는 동안 사용 됩니다.</li>
	<li>셀 5 분 각 1 mL 워시 버퍼에 대 한 세 번 씻는 다.</li>
	<li>이차 항 체 (형광 색소 활용 된 염소-안티-마우스)의 250 μ 워시 버퍼에서 1: 500을 희석 하 고 얼음에 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다. 레이블 핵에 0.2 m m 빨강 형광 핵 산 얼룩이이 외피의 마지막 5 분의 4 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>3 세포를 씻어 감기 워시 버퍼 및 현미경에 coverslips 7 μ 방지 페이드 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드 마운트의 1 mL x. 장착 매체 투명 매니큐어를 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip 밀봉 하기 전에 밤에 강화 하자.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미지 세포입니다. 전 이차 항 체에 대 한 Em은 555/580 / nm와 642/661 빨강 형광 핵 산에 대 한 얼룩 (아래와 같이). 참고: FAM-YVAD-FMK와 항 체 라벨로 표시 활성 caspase-1 및 ASC 공동 현지화를 결합 수 있습니다. 이 위해 식구 들-YVAD-FMK 라벨에 대 한 조건에 따라 하 고 추가 처리를 위해 프로토콜 라벨 항 체로 전환.</li>
</ol>6. Confocal 현미경 검사 법에 의해 레이블이 세포 이미징
참고: 후에 coverslips 하룻밤 치료와 매니큐어와 현미경 슬라이드에 밀폐 되어 허용 된 스테인드 세포를 볼 수 있습니다. 여기, 이미징 confocal 현미경을 사용 하 여 설명 합니다. 세포는 또한 표준 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
<ol><li>현미경 단계에 치료 제어 셀과 슬라이드를 놓고 셀에 현미경을 집중 합니다.</li>
	<li>치료 되지 않는 셀에 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 지는 그런 현미경 볼을 테이블 (LUT) 설정을 사용 하 여, 오프셋을 조정 합니다. 이 과정 또한 caspase-1 부족 한 세포를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 참고: 오프셋, 실험에 사용 되는 각 채널에 대 한 조정 해야 하지만 올바른 오프셋을 설정 하는 것이 식구 들-YVAD-FMK 채널 및 형광 항 체 채널에 대 한 가장 중요 한. DNA 채널에 대 한 오프셋은 덜 중요 합니다. 오프셋을 설정 실험의 나머지 부분에 대 한이 설정을 조정 하지 않습니다.</li>
	<li>취급 하는 nigericin 샘플 슬라이드를 전환 합니다. 긍정적이 고 식구 들-YVAD-FMK 얼룩에 대 한 부정적인 두 셀을 포함 하는 필드를 찾아. 긍정적인 얼룩이 지기의 가장 높은 강도 가진 비행기로 팸-YVAD-FMK 채널의 영상 평면을 조정 합니다. 이것은 일반적으로 비행기 inflammasome 초점의 센터 몇 군데 됩니다.</li>
	<li>그런 foci 응축된 핵이 있는 셀에 표시 되는 이득을 조정 합니다. 이득 및 오프셋을 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분에 대 한 이러한 설정을 둡니다. 참고: 셀 pyroptotic 인지 확인 하는 쉬운 편도 핵 형태를 보고는. 활성 caspase-1 셀 둥근 이며 응축된 핵, nucleoli caspase-1 활성화 및 핵 형태학 없이 세포에서 볼 수 있습니다 하는 동안 치료 세포의 것과 유사 합니다.</li>
	<li>총 배율 X 100에 5 무작위로 선택 된 필드의 이미지를 수집 합니다. 이 이미지 당 약 40 셀 일반적으로 발생 합니다. 각 샘플에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 각 이미지에는 셀의 수를 계산 합니다. 다음 긍정적인 팸-YVAD-FMK 얼룩이 있는 셀의 개수를 계산 합니다. 팸-YVAD-FMK 긍정적인 세포의 백분율로 caspase-1 활성화의 수준을 나타냅니다.</li>
</ol>7. LDH 자료 분석 결과
참고: LDH 자료 분석 결과 대 한 씨앗과 프라임 셀 이전 섹션에 설명 된 대로 제외 하 고 사용 하 여 96 잘 접시. 못쓰게 후 매체를 제거 하지 마십시오.
<ol><li>DMEM-5 실험 웰 스에 10 μ M nigericin 및 50 μ의 50 μ 추가 자연과 100% 세포 제어 웰 스 DMEM-5. 때문에 목표 셀 세포를 측정 하는이 실험에서 글리신을 추가 하지 마십시오. 37 ° C, 5% CO260 분 동안 품 어.</li>
	<li>30 분 후 100% 세포 제어 웰 스에 10 x 세포의 용 해 버퍼의 10 μ를 추가 하 고 다른 우물에 DMEM 5 10 μ를 추가 합니다. 이 부 화 하는 동안 냉장고에서 기판 믹스 (동결된 기판의 1.5 mL)의 1 유리병과 분석 결과 버퍼 (~ 12 mL) 1 약 수를 제거 하 고 실내 온도에 빛에서 보호 해 동 그들. 참고: 기판 믹스 빨간색 formazan 제품으로 변환 되는 tetrazolium 소금 (iodonitro tetrazolium 바이올렛), 포함 합니다.</li>
	<li>60 분 총 부 화 후 10 ° c.에 x 500g에 5 분 동안 접시를 원심 분명 평면 하단 플레이트에는 상쾌한의 50 μ를 전송 합니다. 이 시간 동안 기판 믹스의 유리병에 분석 결과 버퍼의 12 mL을 추가 하 고 사용 하기 전에 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>50 μ 기판의 각 음을 추가 하 고 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 중간만 웰 스 빈 값을 포함 합니다. 신호 플레이트 리더의 검출 한계를 초과 하지 것입니다 되도록 15 분 후 접시를 확인 합니다.</li>
	<li>30 분 후 정지 솔루션 (1 M 초 산)의 50 μ를 추가 하 고 OD490 플레이트 리더를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용 하 여 세포 세포의 용 해의 비율을 계산: %Cytoxicity = ((Experimental-Spontaneous) / (최대-자발적인)) × 100 실험: 취급 하는 nigericin 세포; 자연: 치료 세포; 최대: 세포 세포의 용 해 버퍼에 노출</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 충돌의 관심을가지고

이 원고에서 우리 inflammasome 활성화 및 caspase-1 활성화 murine 골 수 유래 세포에서 NLRP3 자극을 다음의 결과 검사 하는 두 가지 방법을 제시 했습니다. 첫 번째 기술은 형광 기자 팸-YVAD-FMK를 사용 하 여 셀룰러 기준 caspase-1 활성화의 수준을 결정 하는 연구원을 수 있습니다. 이 기자는 caspase-1/11 결핍 세포에 얼룩의 부재에 의해 본 바인딩 효소, caspase-1 가족에 대 한 매우 구체적인. 특이성은 또한 LaRock 외에의해 표시 됩니다. 그들의 원고에서 caspase-1 활성화에 페스트 단백질 YopM의 역할을 설명 하. 그들의 원고에서 그들은 FAM-YVAD-FMK foci caspase-117에 대하여 지시 하는 항 체와 함께 표시 했다 foci와 겹치는 보여줍니다.
어떤 실험으로 거짓 긍정적인 결과 제거 하기 위해 따라야 하는 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 우선, 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포를 사용 하는 것이 필수적입니다. 이러한 두 셀 형식 사용 하 여 일반적인 얼룩 이어질 조건 추가 분석에서 제외할 수 있습니다. 둘째, 어떤 항 체 또는 활동 조사 분석 결과 라벨와 마찬가지로 셀 식구 들-YVAD-FMK와 얼룩을 씻고 철저 하 게 중요 하다. 3 5 분 세척을 사용 하 여 배경 신호 수준의 크게 감소 된다. 세 번째 중요 한 단계는 confocal 현미경의 설치 하는 동안 발생합니다. 여기, 그것은 중요 한 치료 셀 식구 들-YVAD-FMK 표시 긍정적인 세포질 얼룩이 지는 치료 셀에서 관찰 하는 방식에 confocal 현미경의 오프셋을 설정 하는 데 사용 됩니다. 때 이러한 단계를 따라이 기술은 셀룰러 기준 caspase-1의 활성화를 평가 하는 유용한 도구 이다.
이 프로토콜 연구원 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 예를 들어 셀 전체 과정 중 여러 단계에서 작은 분자량 화합물으로 처리할 수 있습니다. 이것은 경로 NLR, ASC 또는 프로-caspase-1의 채용의 oligomerization 변조 식별에 대 한 허용 또는 caspase-1 자체의 활성화. 이 프로토콜에 대 한 수정 필요 그런 그들 자체로 caspase-1을 활성화 하지 않습니다. 이 경우에 약물의 복용량 응답 곡선이 필요 합니다. 비록 우리가 NLRP3 inflammasome의 활성화에 초점을 맞춘,이 프로토콜은 다른 호흡기에 의해 발생 하는 inflammasomes를 검사 하도 사용할 수 있습니다. 우리는이 원고에 포함 하는 다른 수정 식구 들-YVAD-FMK 항 체 라벨 inflammasome 구성 요소와 얼룩의 조합 이다. 우리는 활성 caspase-1 inflammasome 어댑터 ASC의 공동 지역화는 보여줍니다. 이 방법의 한계 설명, confocal 현미경에 접근을 요구 한다 이다. 그러나, cytometry에 의해 ASC 초점 형성을 검출 하는 관련된 전략 보고20,21되었습니다.
두 번째 기술은 우리가 논의 LDH 자료 분석 결과 사용 하 여 셀 세포의 급속 한 탐지 할 수 있습니다. LDH 릴리스는 또한 많은 다른 형태의 세포 죽음 동안 발생 하 고 pyroptosis에는 원형질 막 세포 무결성 및 셀의 손실을 나타냅니다 중요 하다. 그러나, caspase-1 부족 한 셀의 사용 caspase-1-종속 세포 세포의 용 해, pyroptosis의 정의 기능을 확인할 수 있습니다.
이 프로토콜 (특히 사용 하는 경우는 전염성이 에이전트)에서 중요 한 단계는 96 잘 접시에 셀 시드 후 접시를 원심. 원심 분리 격판덮개의 우물의 전체 표면에 걸쳐 세포의 동등한 배급에 대 한 수 있습니다. 동등 하 게 분배와 각 대 식 세포는 박테리아의 동일한 수에 노출 됩니다. 원심 분리, 없이 우물에 있는 액체의 초승달 모양 효과 우물의 가장자리에 축적 하는 더 많은 세포를 이어질 것입니다. 이 우물의 센터에서 (나) 잘 벽 가까이 하 고 의도 한 것 보다 더 높은 나 감염의 의도 다양성 보다 낮은 이어질 것 이다.
LDH 자료 분석 결과의 잠재적인 단점은 세포 인구 수준에 및 분석 결과 당 한 시간 점에서 측정입니다. 대체 방법은 현미경 검사 법, 식별 하는 단일 셀 기준 막 무결성의 손실에 의해 셀 impermeant 염료의 통풍 관을 정할 것입니다. 라이브 셀 이미징 플랫폼을 결합해,이 방법은 pyroptosis22의 일시적인 평가 제공할 수도 있습니다. Propidium 요오드 화물과 같은 작은 DNA 바인딩 형광 염료 또는 ethidium 평범한 사람 수 통과 gasdermin D 기 공, 세포 핵 산, 바인딩할5,,2223형광. 기 공 형성 하 고 이러한 작은 염료의 일시적으로 앞 터미널 세포 세포의 용 해. 세포는 더 큰 염료의 통풍 관 및 LDH 등 큰 세포질 단백질의 손실 수 있습니다. 글리신의 사용 수 있다 실험적으로 연결을 푸십시오 기 공 형성을에서 세포, 글리신 gasdermin D 중재 기 공 형성, 작은 염료의 통풍 관 또는, IL 1β의 분 비를 차단 하지 않습니다 하지만 급속 한 세포 및 LDH 릴리스5,22 글리신 방지는 , 23 , 24. 막 무결성의 완전 한 손실을 방지 하기 위해 팸-YAVD-FMK 착 실험에 글리신을 포함 하는 것이 좋습니다 하지만 글리신 pyroptotic LDH 릴리스를 측정할 때 생략 해야 합니다.

Inflammasome 중재 염증 병원 성 유기 체1에 대 한 방어의 중요 한 구성 요소 이지만, 또한 많은 질병2의 병 인 기초. 다양 한 감염에 염증 반응을 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)의 cytosolic 탐지에 의해 트리거되는 또는 손상 관련 된 분자 패턴 (DAMPs). 패턴 인식 수용 체 (PRR), 끄 덕 임 같이 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 이러한 감지 시 oligomerize PAMPs 및 DAMPs. 이 다중 단백질 복잡 한 inflammasome, PRR, Apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 C 터미널 caspase 신규 모집 도메인 (카드) (ASC), 그리고 프로 형태의 포함 된 어댑터 단백질을 포함 하 되 나의 형성을 유발 caspase-13,4. 이 복잡 한 근접 유도 caspase-1의 자동 활성화 수 있습니다. 활성 caspase-1 다음 이벤트 염증 성 세포 죽음 통로 pyroptosis의 특성 집합을 리드. 이 이벤트에 포함 됩니다: 분열 그리고 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 세포 외 공간, 핵 응축 및 gasdermin D 분열에 lysosomal 내용의 출시와 함께 리소좀 exocytosis IL 18의 릴리스. Gasdermin D의 출시 된 N 맨끝 도메인 원형질 막 파열 및 병원 체 복제5, 에 대 한 보호 틈새를 데 려 하는 것 외에도 염증 성 내용의 자료를 일으키는 원인이 되는 숨 구멍을 형성 하는 원형질 막에 삽입 6 , 7.
여기, 우리는 잘 공부 NLRP3 inflammasome에 집중 한다. NLRP3 inflammasome의 활성화 2 단계 과정8통해 발생합니다. "프라이 밍"의 첫 번째 단계는 미생물 제품의 통행세 같이 수용 체 (TLR)에 의해 인식 통해 발생합니다. 이 LPS TLR4 자극을 사용 하 여 실험실에서 복제 됩니다. 이 자극 upregulates NLRP3 및 프로-일리노이-1β NF kB 신호를 통해 합니다. 또한 못쓰게 비 transcriptional 메커니즘을 통해 유도 deubiquitination9,10 및 인 산화 또는 특정 잔류물11,12dephosphorylation NLRP3 라이센스.
NLRP3 정품 인증에 대 한 두 번째 신호는 미토 콘 드 리아 요인, 반응성 산소 종, 칼륨 경과 및 신호, 칼슘을 포함 하는 NLRP3 활성화를 위한 통합 메커니즘 애매8남아 있지만 생각 된다. 활성화 된 NLRP3의 시 1 도메인 간의 상호 작용을 통해 oligomerizes 그리고 pyrin (PYD) 도메인13의 바인딩을 통해 ASC 신병. 각 셀에 이러한 고분자 단지 단일 현미경으로 보이는 초점을 형성 한다. ASC 22 KDa 단백질 인간의 백혈병 세포의 apoptosis 동안 "반점"를 형성 하 고 명명 된 apoptosis 관련 스펙 같은 단백질 포함 된 카드14원래 확인 되었다. 그것은 나중에 ASC 프로-caspase-1 inflammasome15형성 프로-caspase-1의 카드와 함께 ASC의 카드의 상호 작용을 통해 신병 결정 되었다.
모든 NLRs는 caspase-1 활성화를 유도 하는 ASC의 존재를 필요로. 달리 NLRP3, NLRC4 및 NLRP1b 카드 도메인 있고 프로-caspase-1 카드-카드 상호 작용 caspase-1 활성화 유도를 통해 모집 직접 수 있습니다. ASC의 부재, 활성 caspase-1는 cytosol에 걸쳐 확산 유적과 단일 초점을 형성 하지 않습니다. 확산이 활성 caspase-1 pyroptotic 세포 죽음을 유도 하기에 충분 하지만 프로 일 1β13,16처리할 수 있습니다.
이 원고에서 우리 inflammasome 활성화를 평가 하기 위해 두 가지 방법을 설명 합니다. 첫 번째 사용 하 여 형광 활동 프로브, FAM-YVAD-FMK, 프로 테아 제 caspase-1 제품군을 바인딩합니다. 이 가족 caspase-1, 또한 마우스 caspase-11와 인간의 caspase-4 caspase-5 포함 되어 있습니다. 모든 실험에 caspase-1/11 결핍 쥐에서 세포를 사용 하 여이 프로브의 특이성을 해결 것입니다. 이 방법은 항 체 또한 설명 합니다 inflammasome 부품의 라벨 결합 될 수 있다. 현미경 시각화는 개별 셀을 포함 하는 활성 caspase-1와 oligomerized ASC의 식별에 대 한 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 어디 inflammasome 형성 캐스케이드 호스트 셀 또는 연구에서 병원 성 유기 체 그들의 조작 효과가지고 결정할 수 됩니다. 예를 들어 하나의 주어진된 개입 복잡 한 NLRP3를 ASC의 채용을 방지 또는 후속 모집과 caspase-117의 활성화 여부를 구분할 수 있습니다. Caspase-1 활성화 IL 1β 분 비 등의 결과 검토 것 수 없습니다 이러한 두 가능성 사이 구별 하. 또한, IL 1β의 분 비는 caspase-1을 활성화 하 고 pyroptotic 세포 죽음16받을 수 셀을 변경 하지 않고 변경 될 수 있습니다.
두 번째 방법은 위에서 설명한 caspase-1 활성화 다음 pyroptotic 대 식 세포 세포의 용 해 도중 발생 하는 표면에 뜨는, 셀으로 젖 산 효소 (LDH)의 출시를 측정 합니다. 이 두 번째 방법은 전체에서 LDH의 릴리스 잘 측정은 인구에 기초를 둔 접근 이다.입니다. 이 간단한 접근 caspase 1 중재 하는 세포 죽음 인지 확인 하려면 샘플의 빠른 분석 (보육 시간 30 분)에 대 한 허용 하 고 96 잘 접시 형태로 수행할 수 있습니다.
이러한 메서드는 상호 보완적인, 각각 다른 장점, 그리고 둘 다 쉽게 수정 의무가 있습니다. 예를 들어 inflammasome 자극 이전 대상된 작은 분자량 화합물과 대 식 세포 치료 단백질에 선 동적인 응답을 제어 할 수 있습니다 특정 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-MEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>For growing L929 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCRC clone 929 (L929)&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Includes fixation and permeabilization solution, and wash buffer.&#160; Proprietary formulations. Contains 4.2% formaldehyde</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotox96 Nonradioactive cytotoxicity assay</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-G1780</td>
			<td>Includes Substrate Mix and Assay Buffer; Proprietary formulations. Stop solution is 1 M Acetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAM-YVAD-FMK</td>
			<td>Immunocytochemistry Technologies</td>
			<td>98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, US origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Heat inactivated at 55&#176;C for 50 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p36934</td>
			<td>Proprietary formulation. Curing mounting medium. Hardens to refractory index of 1.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse ALEXA555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21051024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3 Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>far-red fluorescent nucleic acid stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mouse</td>
			<td>Jackson Laboratoy</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caspase-1/11-/- mouse</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>016621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8X Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure LPS from Salmonella minnesota R595 (Re)</td>
			<td>List Biologicals</td>
			<td>434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ASC clone 2EI-7</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>04-417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercapto-ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>D2650-5X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax M3 plate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>5000414</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of inflammasome activation and pyroptotic cell death in murine bone marrow-derived macrophages

Inflammasomes는 많은 병원 성 생물의 성공적인 제어에 필요한 하지만 또한 염증 촉진 하는 타고 난 면역 신호 플랫폼 autoinflammatory 질병. Inflammasomes 끄 덕 같은 수용 체 (NLR) 가족의 일원을 포함 하 여 cytosolic 패턴 인식 수용 체에 의해 활성화 됩니다. 이 수용 체는 미생물 또는 손상 관련 된 자극의 감지 시 oligomerize. 접합 기 단백질 ASC의 후속 모집 caspase-1 근접 유도 자동 활성화를 통해 활성화 현미경으로 보이는 inflammasome 복잡 한, 형성 한다. 활성화, 따라 caspase-1 프로-일리노이-1β 및 프로-일-18, 활성화 및 이러한 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 앞. Caspase-1는 또한 염증 성 형태의 세포 죽음 pyroptosis, 기능 막 무결성 및 셀 세포의 손실이 되 나 중재. Caspase-1 gasdermin D, 원형질 막 숨 구멍을 형성 하는 N 맨끝 파편 공개 삼투성 세포로 이어지는 앞.
골 수 유래 세포 caspase-1 활동 프로브 팸-YVAD-FMK의 라벨 및 어댑터 단백질 ASC에 대 한 항 체와 함께 셀 라벨 시험관, caspase-1의 활성화를 확인할 수 있습니다. 이 기술은 inflammasome 형성 및 caspase-1 활성화 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개별 셀에 식별 수 있습니다. Pyroptotic 세포 죽음은 매체에 cytosolic 젖 산 효소의 릴리스를 측정 하 여 검색할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 비용 효과적인 심사에 대 한 적응을 허용 96 잘 접시 형태로 수행 합니다. 이 원고에서 우리 표시 nigericin, NLRP3 inflammasome의 활성화 어댑터 단백질 ASC 및 활성 caspase-1, 공동 현지화를 리드 pyroptosis로 이어지는.

검출 하기 caspase-1 활성화 nigericin에 노출 다음, 세포 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 처리 했다. 우리 식구 들-YVAD-FMK와 ASC 항 체는 ASC 및 활성 caspase-1 공동 지역화 NLRP3이 중재 inflammasome 활성화 다음 보여 라벨 결합. 그림 1A 5 μ M nigericin에 노출 하는 야생 타입 세포 perinuclear 지역에서 ASC 초점의 형성을가지고 있음을 보여준다. 이 포커스 식구 들-YVAD-FMK와 ASC의 공동 지역화 보는 활성 caspase-1 포함. 활성 caspase-1 긍정적인 세포 핵 응축 보여주는 이러한 셀 pyroptosis 겪고 있다. 그림 1B 는 caspase-1/11 결핍 쥐의 세포는 ASC 초점의 형성을가, 그들은 필요가 없습니다 어떤 활성 caspase-연결 된 1이이 포커스 식구 들-YVAD-FMK 얼룩이 지기의 부재와 같이 보여 줍니다. 이 세포의 핵은 하지 집 광, 아무 pyroptotic 나타내는 세포 죽음 발생. 이미지는 기름 침수 목표 X 63와 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 촬영 했다. 이미지는 어떤 추가 처리 없이 TIFF 파일으로 저장 되었다.
연결 nigericin에 노출 된 세포 죽음의 수준을 결정 하기 위하여 우리는 표면에 뜨는 문화에 LDH 자료 분석 결과 수행 합니다. 그림 2 는 야생 타입 세포 nigericin에 노출 된 후 세포 죽음을 받 다. 대조적으로, 세포 결핍 caspase-1 셀은 그대로 나타내는 셀 상쾌한에 LDH를 해제 하지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig1.jpg"> 그림 1: FAM-YVAD-FMK와 안티 ASC 라벨. (A) 야생 타입 (WT)와 (B) (c 1/11-/-) caspase-1/11 불충분 한 세포 1 h 5 μ M nigericin에 노출 되었고 식구 들-YVAD-FMK를 사용 하 여 활성 caspase-1, 그리고 안티-ASC를 감지 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 활성 caspase-1에 대 한 분석 ASC를 감지 하는 기본 및 염소-안티-마우스 보조 항 체 형성 초점. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57463/57463fig2.jpg"> 그림 2: LDH 자료 분석 결과 결과. 야생 유형 및 caspase-1/11 결핍 세포는 1 시간에 5 μ M nigericin에 노출 됐다 고 셀 표면에 뜨는 LDH의 존재에 대 한 분석 했다. 데이터는 3 개의 복제의 수단 ± SD. <a href="/files/ftp_upload/57463/57463fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

detection-inflammasome-activation-pyroptotic-cell-death-murine-bone

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K 조회수.  University of Washington. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

비디오: Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Murine 골 복 막 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물 효과의 평가

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...