저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ' 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ' 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.

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저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,1617,18,19,20,21,34의 위치. 우리의 접근 방법에서 대상 대뇌 피 질 이므로 일관 되 고 재현 가능한 개발 telencephalon의 큰 영역에 배치할 수 있는 5 m m 직경 electroporation 전극 사용 합니다. 다른 사이트 (예: diencephalon, 망막), 뇌 또는 대뇌 피 질 내에서 지역의 보다 구체적인 대상에 대 한 대상, 절차 및이 목적을 위해 명시적으로 설계 된 전극 수 있습니다 사용된15, 16. 우리는 또한 단일 구문입니다 밝은 라벨을 제공 하 고 모든 붙일 레이블 신경 Cre recombinase 포함 하는 보장을 제공. 단일 구조를 사용 하 여 밝은 라벨을 달성 하는 단점은 레이블이 인구 너무 조밀한 (그림 2C), 수 있지만이 레이블이 지정 된 영역 (그림 2D)의 주변에 세포 이미징으로 해결 될 수 있습니다. 또한, 형광 구문 표현 Cre recombinase 식17에 따라 디자인 될 수 있다 하지만 낮은 식 수준 형광 표식에 대 한 immunostaining를 요구할 수 있습니다. 이 한계는 Cre 종속 형광 마커 식 (그림 3A)23,24의 "초신성" 시스템에 의해 해결 됩니다.
Cre lox 재결합 electroporation utero에서 함께 결합 하 여, 우리 타임-임신 여성의 최적의 번 식에 대 한 몇 가지 향상을 제공 합니다. 그것은 층 류 두건 등으로 인 한 진동과 소음에서 자유롭다 지주 방에 쥐를 유지 해야 합니다. 중첩 물자, 플라스틱 이글루와 환경 풍부 하 고 해바라기 씨 (재료의 목록 참조) 같은 보조 제. 환경 고려 사항 외에도 우리는 여자의 첫 번째 쓰레기 일반적으로 낮은 생존 율을가지고 나타났습니다. 따라서, 우리의 프로토콜 제안 electroporation utero에서 수행 하는 여자의 두 번째 임신 때까지 대기 합니다. 이 전략 쓰레기의 생존을 증가 하는 동안 또한 수술 시간을 길게 하 고 따라서 수술의 성공을 낮출 수 있는 쓰레기 크기를 증가 시키는 경향이 있다. 따라서, 특히 많은 수의 배아 (예: 8 이상) 발생, 조직이 가장 부상 하는 경향이 특히 난소와 자 궁 경부에 가장 가까운 배아 배아의 일부는 electroporation를 건너뛰는 것이 좋습니다. 또한, 출산 후 새끼의 생존을 증가 하는 경향이 (플라스틱 igloos, 소재, 식이 보조 제를 중첩) 위에서 언급 한 동일한 환경 농축 전략을 사용 하 여. 그것은 또한 그 발 정기는 여성에서 발생할 수 있습니다 첫 번째 쓰레기의 출산 후 몇 시간 하는 것이 중요입니다. 이 경우에, 그녀의 두 번째 쓰레기를 낳을 다음 짝짓기 타임 시도 하려면 이유 후 별도 여성을 수 있습니다. 찾을 때 질 플러그, 그것은 플러그인을 찾을 수 없는 경우에 암컷은 발 정기에 전날 밤 하는 경우에 특히 여성을 구분 하는 것이 좋습니다. 특정 긴장에 플러그는 어렵지만, 그리고 개념 이미 발생 할 수 있습니다.
개선의 또 다른 지역은 electroporation utero에 대 한 적절 한 microinjection 펫 생산에 있다. 측면 심으로 DNA 주입에 대 한 펫을 당기는 중요 한 단계입니다. 여기, 우리는 일관 된 팁 크기와 거친 팁 가장자리 펫을 설정 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 다른 방법 다시 메스 블레이드15 팁 하거나 집게16,17끝 떨어져 곤란을 포함 됩니다. Note 피 펫 팁 너무 작은 경우, 그들은 제대로 자 궁 벽을 찔린 것 이다 하지만 주입 유량 피펫으로 배아 두뇌에서 제기 하는 시간을 길게, 너무 낮은 될 것입니다. 피 펫 팁 너무 큰 경우, 그들은 자 궁 벽과 배아 뇌 손상 수 있습니다. 피 펫 팁이 너무 부드럽게, 그들은 태아 손상을 통해 침입 하기 전에 자 궁 벽 또는 배아 두개골에 큰 디벗을 발생 합니다. 연습 20-25 µ m 팁을 생산 하 고 팁 (예: 10 X 목표) 간단한 가벼운 현미경 검사를 거친 휴식을 만드는 일관 된 결과 얻을 때까지. 그 액체를 테스트 수 팁 크기 허용 범위 내에서 보장 하는 또 다른 방법은 이다 흡 인기 튜브 어셈블리와 합리적인 속도 (예: ~0.5 µ L/s)에서 pipetted. 때문에 사출 펫 보정 졸업, 측면 뇌 실에 전달 하는 DNA의 정확한 양을 알려져 있다. 이것은 원하는 스파스 reproducibly 크기 순서를 달성 하기 위한 가장 중요 한 단계 이다. 즉, 주어진된 농도 10 ~ 100 개 신경 특정 범위, 예를 들면 내 라벨 항복 한다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 utero에 electroporation 절차입니다. 자 궁을 노출 하는 동안 매우 부드러운 수 있습니다. 복 부 구멍에서 마지막 태아를 꺼내 때 난소 나 자 궁 경부에 내려고 하지 있는지 확인 합니다. Microinjection 및 electroporation 동안 엄지 및 집게 손가락을 사용 하 여 측면 뇌 실 공개 배아의 온화 하 고, 교묘한 조작 있으며 배아 자 궁 벽에 부드럽게 밀어 수 있습니다. 매우 부드러운 터치가 자 궁과 태아를 처리할 때 중요 합니다. 부드러운 터치를 달성 하기 어려운 경우는 집게 배아 또는 조직 손상을 초래 하는 자 궁에 내려 클램핑 하지 않도록 내장 제한 나사 링 집게를 사용 합니다. 더 배려 carprofen 및 수술 직전 buprenorphine를 관리 하는, 배아 생존에 영향을 주지 않고 utero에서 수술 하는 동안 효과적인 통증 관리를 제공 하기 위해 표시 되는 연습35 요금 .
우리의 간단한 조직학 프로시저를 다음에 몇 가지 단계는 중요 합니다. 정착 액 실험 머리 perfusing, 후 뇌를 뇌 조직 손상 으로부터 보호 하기 후 고정 중 두개골에 그대로 유지. 동안 주, 그 형광을 주의 하는 며칠 동안 PFA PFA 솔루션 polymerizes로 줄어 1%에서 두뇌를 저장 가능 하다. 100 µ m 슬라이스 코로나 섹션은 수지상 및 axonal 형태학의 대부분을 유지 하면서 전체 섹션을 통해 confocal 현미경 검사 법을 허용 하도록 충분히 일반적으로 얇은. 고정 제대로 발생, P13 보다 더 오래 된 동물에서 두뇌는 cyanoacrylate 접착제로 간단 하 게 진동 톰에 장착할 수 있습니다. 그러나, 두뇌 진동 톰에 의해 절단 되 고 하는 동안 너무 고 경우에, 작은 한 천 또는 agarose 블록 구분 되는 동안 굽 힘에서 그것을 방지 하기 위해 두뇌의 뒤에 아래로 접착제. 문제가 해결 되지 않으면, 젊은 산 후 두뇌 (단계 5.8)에 대 한 제안으로 진동 톰으로 잘라 블록을 형성 하는 agar에 두뇌를 포함 합니다.
이 방법은 신경 세포에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있는 모자이크를 생성 하려면 utero에서 electroporation Cre lox 재결합 시스템을 결합 합니다. 이 방법은 또한 구문 (예: CRISPR/Cas9)6또는 모두 될 수 있습니다. 있는 다른 사이트 recombinases (예: Flp/FRT 또는 드레/를 이용한24), 편집 하는 유전자의 utero에서 electroporation를 지원 하도록 구성할 수 수 있습니다. 모자이크 뇌 조직의 생산 하도록 설계 되었습니다. 1 개의 유망한 대체 기술 모자이크 조직을 생산 하는 데 사용할 수 신생아 쥐36intraventricular 주입을 통해 바이러스 배달입니다. 결합 intraventricular 주입 시연으로 배아 나가에 여기와 다른 곳에서15,,1617,18,19,20, 21,,2237, Cre recombinase 코딩 하는 바이러스 성 벡터는 심 실 영역에서 floxed 조상 세포 감염을 출생 하기 전에 전달 될 수 있는. 하나의 중요 한 고려는 바이러스 성 벡터는 희석 충분히 스파스 절단 및 라벨을 보장 하는 것입니다. 그러나,이 또한 형광 마커 신경 해부학 관측 (예: 모 수석 등뼈 또는 arborization)24필수를 포함 하 여 배달 되는 구문의 낮은 복사 번호 될 것 이다. 이 함정이 여기 시연 "초신성" 구문 스파스 레이블 레이블된 셀24의 밝기에 해당 감소 없이 달성 하는 데 사용할 수 있는 동일한 전략을 사용 하 여 새 구문은 카운터를. 또 다른 중요 한 고려 사항은 바이러스 배달 전달된 구문을 발기인 셀 인구 공부 되 고 (예 : 피라미드 뉴런 흥분 성의)에 있도록입니다. 바이러스 성 벡터의 intraventricular 주입 하면 모든 조직을 둘러싼 뿐만 아니라 심 실 영역 등 telencephalon의 외피 그리고 hippocampal 흥분 성의 뉴런 생성을 포함 하 여 심 뿐만 아니라는 중간의 감염 및 많은 피 질 수는34를 태어난 절 정령 측면 Utero electroporation 바이러스 배달의 구문에 비해의 또 다른 기능은 배달의 그것의 상대적으로 좁은 시간 창을입니다. 옆 뇌 실에 주입 하는 바이러스 계속 심 실 영역을 일렬로 세우는 세포를 감염 하는 수술 후 유지 수 있습니다. 반면, electroporation 셀의 훨씬 더 구체적인 집합을 대상으로 초에 발생 합니다. 이 장점이 나 단점은 공부 될 세포의 부분 모집단에 따라 조사 수 있습니다.
우리의 접근 방식을 단일 구성 또는 "초신성" 구문을의 도입에 의해 Cre lox 재결합을 지원합니다. "초신성" 구문 경우 우리는 익숙해 장점과 한계가이 전략을 사용 하 여 조사를 촉구 합니다. 예를 들어 Cre 삭제의 타이밍 레이어 II/III 흥분 성의 뉴런 대뇌 피 질24의 2 일 안에 발생을 입증 되었습니다. 따라서, 그것은 그럴듯한 Cre 절단 보다는 다음 electroporation, electroporation 직후 48 h 동안 발생할 수 있습니다. 따라서, 다른 형태의 타이밍 및 Cre 절단 (예: Cre 기자 마우스 선을 사용 하 여)의 위치를 확실 한지 알아보는 특히 작은 기간 이내 Cre 절단은 중요 한 연구에서에서이 새로운 기술의 사용을 보완 하기 위해 사용 해야 고려 사항입니다. 또 다른 잠재적인 함정이 "초신성" 실험에서 레이블이 셀의 작은 백분율로 Cre recombinase 표현할 수 있는 것 이다. 예를 들어 그림 3, 우리는 공동-electroporated 2 플라스 미드에서에서: CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE의 높은 농도 트 레-Cre의 낮은 농도. 트 레 새 발기인 때문에 비록이 드문 것 Cre recombinase 받은 트 레-Cre 플라스 미드만 하지 loxP 그만 loxP EGFP tTA 플라스 미드, 셀에 표현 될 수 있습니다. 어디 그것은 필수적 그 모든 레이블이 셀 아무 Cre 중재 절단 무엇이 든 지, "초신성" 실험은 Cre recombinase 식의 외부 표시 신경 제어 실험으로 보충을 할 수 있습니다 실험에서 평가 다른 통해 (예: Cre recombinase immunohistochemistry)을 의미합니다.
요약 하면, 우리의 프로토콜 쉽게 만드는 electroporation utero에서 모자이크 분석에 대 한 훨씬 더 유용 하 고 적응할 수 있는 방법이 새로운 구문에 맞게 수정 됩니다. 따라서, electroporation utero에서 모자이크 뇌 조직에서 vivo에서공부 하는 여러 가지 방법으로 유전자 재조합의 파워와 결합할 수 있습니다.

유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.
여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,3,4에 집중 하 고 내 생 신체적인 mosaicism5,6 그린 모자이크에 따라 그들의 결론 뇌 조직입니다. 조건부 삭제 Cre lox 재결합 시스템을 통해 유전자의 유전자 변형 마우스 라인의 좋은 가용성을 최대한 활용 하는 방법입니다. 이 방법에서는, 2 개의 loxP 사이트 loxP 사이트 같은 방향으로 ("floxed")에서 두 얼굴을 있는 그것을 떠나 (예:는 exon), 유전자의 필요한 시퀀스의 양쪽에 소개 된다. Cre recombinase loxP 사이트7사이 시퀀스 excises. Cre 중재 재결합 Cre recombinase 셀 ("Cre 기자 선")의 하위 집합에서 형광 표식 함께 표현 하는 또 다른 마우스 라인을 건너 floxed 마우스에 의해 얻을 수 있습니다. 이 다양 한 방법으로 흥분 성의 뉴런 등 이다8셀의 하위 집합에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 입증 되었습니다. Cre 기자 라인 Cre 중재 재결합 마약을 유도할 수 있는 (단일 신경 라벨 유도할 수 있는 Cre 중재 녹아웃 또는 매끄러운) 될 수 있도록 있다T2 를 표현할 수 있습니다9. 다른 전략 이라는 이중 표식 (MADM)10,11모자이크 분석, Cre 중재 interchromosomal 재결합 homozygous 돌연변이 heterozygous 조직 함께 만들 수 있습니다. 이러한 방식에서 쥐의 새로운 라인 각 후보 유전자 또는 세포 하위 테스트에 대 한 각 시간 제작 될 필요가 있다. 또는, Cre recombinase 소개 될 수 있다 postnatally 또는 바이러스 성 벡터 (예를들면 adeno 관련 바이러스13 또는 lentiviruses14 셀룰러 하위 형식 관련 운반 iontophoresis12 통해 발기인)입니다. 이 전략 강력 하 고 산 후 라벨을 만듭니다. 대뇌 피 질 뉴런을 띄엄띄엄 prenatally 개발 대상으로 이상적인 전략의 형광 표시와 함께 Cre recombinase electroporation utero에 입니다.
Cre lox 재결합 electroporation utero에서 생성을 통해 결합 뿐만 아니라 vivo에서조직 모자이크, 다른 게시 프로토콜15,,16에서 프로시저에 여러 각 색 한 소개 17,,1819,,2021. 우리는 사육 타임-임신 여성에서 성공을 개선 하는 정보를 제공 합니다. 우리 또한 우리의 두 전략 스파스 하 고 밝은 대뇌 피 질의 조직에서 뉴런의 라벨을 소개 하는 개요: 하나의 전략 Cre recombinase 및 형광 마커22단일 구문을 코딩의 수준을 적정 하는 것입니다. 또 다른 전략 마음23,24에 이러한 매개 변수를 특별히 설계 된 "초신성" 시스템을 사용 하는 것입니다. 또한, 생산 하는 일관 된 microinjection 펫 및 단순화에 utero electroporation 수술에 개선을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 더 얼룩 또는 immunohistochemistry 없이 모 수석 등뼈와 수지상 및 axonal 아 버의 분석을 허용 하는 간단한 조직학 준비에서 중요 한 단계를 개요.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td>See &#34;1. Mouse set-up&#34; (step 1.1, &#34;wildtype mice&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP.Cre empty vector</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#20781</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker&#34;). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69138</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#69136</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>#85006</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.1 &#34;Supernova&#34; system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>#12362</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.3 &#34;endotoxin-free plasmid purification kit&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue powder, BioReagent grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6146-5G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;trypan blue&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-2.5KG</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;NaCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride, ACS, 500 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#97061-566</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;Na2HPO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5379-100G</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;KH2PO4&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td>See &#34;2. DNA set-up&#34; (step 2.5 &#34;HCl&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.0 mm wide trough filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>FT330B</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1 &#34;glass capillary puller&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Glass Capillaries, 4&#34;, 1 / 0.75 OD/ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100-4</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.1.1 &#34;glass capillary&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5&#34;</td>
			<td>Phenix</td>
			<td>LW-8148</td>
			<td>See &#34;3. Pipette set-up&#34; (step 3.2.1 &#34;single-ply task wipe&#34;); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#14140</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Graefe forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503708-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;iris scissors&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503728-12</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Hartman mosquito forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Non-Woven Sponges, 2&#34; x 2&#34;, 4-ply</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>#2204-c</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;non-woven gauze sponges&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#503203</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;ring-tipped forceps&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes complete, O.D. &#215; H 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3160102-12EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;Petri dishes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8&#34; x 9-3/4&#34; x 5/8&#34;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B007SHGAHA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.1 &#34;stainless steel tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 5 mm</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0489</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.16 &#34;tweezer-type electrodes&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Foot Pedal</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0211</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 and 4.17 &#34;foot pedal&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Generator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>#45-0052</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.3 &#34;generator&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>#72-6468</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.4 and 4.6 &#34;nose cone&#34;, step 4.4 &#34;induction chamber&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td>
			<td>#0536108691</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.7 &#34;veterinary ophthalmic ointment&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Space Gel (AIMS)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#95059-640</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.8 &#34;sealed pouch filled with supersaturated salt solution&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula</td>
			<td>Veet</td>
			<td>#062200809951</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.9 &#34;depilatory cream&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>TSP-10LKIT</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.12 &#34;sterile 10 &#181;L micropipette tip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.15 &#34;aspirator tube assembly&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27&#34;</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>MV-J397</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.19 &#34;absorbable sutures&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;LiquiVet Rapid&#8221; Tissue Adhesive</td>
			<td>Medrepexpress</td>
			<td>VG3</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.20 &#34;tissue adhesive&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z551546-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;1 mL syringe&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z192392-100EA</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.21 &#34;26G, &#189;&#8221; needle&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestlets Nesting Material</td>
			<td>Ancare</td>
			<td>NES3600</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;nesting materials&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile</td>
			<td>Bio-Serv</td>
			<td>S5137</td>
			<td>See &#34;4. In utero electroporation&#34; (step 4.24 &#34;sunflower seeds&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.1.1 &#34;PFA&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>#501976</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.5 &#34;tweezers&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar powder</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>#10752</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.8.1 &#34;agar&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-edge razor blades, #9 blade</td>
			<td>Stanley Tools</td>
			<td>#11-515</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;single-edge razor blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen disc S D 50 mm</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046327404</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.9 &#34;vibrating microtome specimen disc&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer tray S assembly</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#1404630132</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;buffer tray&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1000 S Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14047235612</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;vibrating microtome&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Razor Blades</td>
			<td>Personna</td>
			<td>BP9020</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;blade&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knife Holder S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>#14046230131</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.10 &#34;knife holder&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B0089KU6XE</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;fine tipped paintbrush&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>#71869-11</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.1 &#34;microscope slide&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.3-5.12.4 &#34;mountant&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS1415-10</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.12.4 &#34;coverslip&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.13.1 &#34;DAPI&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Stage Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;light microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000/C2si</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;confocal microscope&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x objective, NA = 0.20</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;low-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x objective, NA = 0.75</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;medium-power objective&#34;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x objective, NA = 1.40</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
			<td>See &#34;5. Histology&#34; (step 5.15 &#34;high-power objective&#34;)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing cre-lox recombination in mouse cerebral cortex through in utero electroporation

유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.

단일 GFP를 구성 합니다. Cre는 E15.5에서 electroporated 이었고 P14에서 시각 (재료의 목록 참조). 구성의 농도 주입의 볼륨에 따라 스파스 또는 밀도 결과22,26얻어질 수 있다. 예를 들어, 2 mg/mL GFP의 1 µ L의 주입. 레이블이 지정 된 셀, 일부는 밝은 (그림 1A), 그리고에서 지역화 레이어 II/III (그림 1B) 수의 스파스 유통 Cre 결과. 조직 때문에 두께가 100 µ m, 수지상 아 버의 대부분 (그림 1C) 유지 됩니다. 모 수석 등뼈 높은 배율 (60 X;에서 관찰 될 수 있다 그림 1D)입니다. 동일한 농도에서 1.5 µ L의 사출 매우 조밀한 neurites 및 모 수석 등뼈 (그림 2C)의 소스를 추적 하기가 어렵습니다으로 최적의 수 있는 레이어 II/III (그림 2B)에서 (그림 2A)를 라벨 결과. 그러나, 그것은 신경 (그림 2D) 및 프로세스 (그림 2E) 레이블이 지정 된 영역 (그림 2D)의 주변에 밝은 셀을 선택 하 여 이미지 수 있습니다.
마지막으로, 레이블이 지정 된 셀의 스파스 배포 하면서 뉴런의 밝기를 극대화 하기 위해 가능 하다. 여기, 초신성-GFP E15.5에 electroporated 이었다 (재료의 목록 참조)와 P23에서 시각. 뇌 조직의 다양 한 산 후 연령대에서의 관측에 따라 어떤 형광 구문의 밝기에 나이의 영향23,,2426여기 사용 될 나타나지 않습니다. 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) 및 10 µ g/mL 트 레-Cre 결과 레이어 II/III (그림 3B) 주로 밝은 셀 (그림 3A)의 스파스 배포에 포함 하는 혼합물의 1 µ L 주입 돌기 및 axonal 프로세스 (그림 3B)와 모 수석 등뼈 (그림 3C) 구상 될 수 있다. 우리의 경험으로 타겟팅 GFP 같은 단일 구문을. Cre 또는 "초신성"와 구문 reproducibly electroporated 배아의 75% 이상에서 식을 얻을 것입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig1.jpg"> 그림 1: Sparse 및 단일 electroporation utero에서 후 밝은 식 구성 포함 GFP와 Cre recombinase. (A)의 E15.5에서 electroporation 후 P23에서 대뇌 피 질 낮은 배율 (X 4) 형광 현미경 사진. (B) (I, II/III, IV, 및 깊은 4 레이어 레이어) 대뇌 피 질의 층을 드러내는 DAPI 핵 얼룩의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (C)는 단일 뉴런의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (D) 모 수석 등뼈의 고배율 (60 X) 형광 현미경 사진. 스케일 바 = 200 µ m (A); 100 µ m (B, C); 그리고 5 µ m (D)입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig2.jpg"> 그림 2: 좁게 및 단일 electroporation utero에서 후 밝은 식 구성 포함 GFP와 Cre recombinase. (A)의 E15.5에서 electroporation 후 P14에서 대뇌 피 질 낮은 배율 (X 4) 형광 현미경 사진. (B) (I, II/III, IV, 및 깊은 4 레이어 레이어) 대뇌 피 질의 층을 드러내는 DAPI 핵 얼룩의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (C) 조밀 라벨의 영역에서 뉴런의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (D) 조밀 라벨의 영역의 주변에서 뉴런의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (E) 모 수석 등뼈의 고배율 (60 X) 형광 현미경 사진. 스케일 바 = 200 µ m (A); 100 µ m (B, C, D); 그리고 5 µ m (E)입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56675/56675fig3.jpg"> 그림 3: Sparse과 밝은 식 초신성 GFP와 electroporation utero에서 생성 포함 GFP와 Cre recombinase 후. (A)의 E15.5에서 electroporation 후 P14에서 대뇌 피 질 낮은 배율 (X 4) 형광 현미경 사진. (B) (I, II/III, IV, 및 깊은 4 레이어 레이어) 대뇌 피 질의 층을 드러내는 DAPI 핵 얼룩의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (C)는 단일 뉴런의 매체-확대 (20 X) 형광 현미경 사진. (D) 모 수석 등뼈의 고배율 (60 X) 형광 현미경 사진. 스케일 바 = 200 µ m (A); 100 µ m (B, C); 그리고 5 µ m (D)입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56675/56675fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

11.6K 조회수.  James Madison University. 두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

의 연결을 Morphogenesis의 연구를위한 방법 :<em&gt; 예 생체내</em배아 Murine 대뇌 피질에서&gt; RNAi의 Electroporation

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...