저자는 플라스미드를 제공하는 트레이시 영 피어스 아츠시 다니 감사합니다. CK, 그리고 질량 (DE 792/2-4)이 작품은 OR과 CK (BMBF 01EW1003), DFG (GRK1033 코 1679/3-1)에 신경 세포 ERANET 발견에 의해 투자되었다

국가 및 유럽의 법률에 따라, 모든 동물 실험은 책임 Landesministerium FÜR 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz (87 51.05.2010.A​​301 LANUV NRW)에 의해 승인되었다. 1.에서 자궁 에레 이 방법은 Walantus 외. 3 기준 쥐뿐만 아니라, 밥 등. 4 조브에 상세히 설명되어 여기에서는 간략하게 요약되어있다. 6-8 새끼의 쓰레기 크기는 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. (아래 참조) 생존율을 증가시키기 위해 적어도 두 개의 비 - 일렉트로 배아가 있어야한다. <ol><li> 1.5 ㎍ / μl를 포함 DNA-혼합물을 제조 목표 플라스미드 (shRNA를 : pENTR-U6, 인비 트 로젠, 유진, OR / DISC1 과발현 : pCAX 21), 0.5 ㎍ / 플라스미드 (pCAX), 0.5 ㎍ / GFP μl를 포함하는 루시 페라 제 μL 1X PBS 솔루션 스테인드 빛 블루의 플라스미드 (는 pCAGGS 22)를 포함빠른 녹색 염료와 전자. </li><li> 바늘 피펫 끌어 당기는 유리 모세 혈관 밖으로 주사 바늘을 준비합니다. 그리고 알코올 성분의 소독제 (kodan Tinktur 포르테)와 고압 증기 멸균 또는 배양하거나 수술 도구를 소독. </li><li> 15 분 수술 전 십육일 수정 (E16) 후 임신 한 쥐에 부 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)의 수술 전 투여 량을 관리 할 수​​ 있습니다. 그 후 이소 플루 란 챔버에 동물을 마취. <ol><li> 마취시, 1.8 %에서 0.4 L / 분 이소 플루 란에 산소 설정을 사용하여 마취 장치에 연결 호흡 마스크와 37 ° C 예열 작업 테이블에 앙와위에서 쥐를 놓습니다. </li><li> 복부를 면도 후 면도 면적에게 kodan Tinktur 포르테 (알코올 성분의 소독제)으로 3 회 소독. </li><li> 만 면도 작업 필드를 노출, 멸균 천과 쥐를 커버. </li></ol></li><li> 자궁 일렉트로에 수행합니다. <ol><li> scisso와 복부를 잘라리네아 알바 따라 R (~ 2cm). </li><li> 링 집게로 조심스럽게 자궁 뿔을 노출합니다. </li><li> 전체 수술 중 가온 멸균 PBS에 젖은 자궁 벽을 유지하기 위해주의하십시오. </li><li> 배아의 뇌실 중 하나에 얇은 유리 바늘 DNA 용액을 주입한다. </li><li> 태아의 머리 주위에 7mm 전극을 배치합니다. 상단에 대뇌 피질의 층의 세포 집단을 치고, E16 23에서 IUE을 수행하고 약간의 지느러미 / 측면 경향이 주입 된 심실 위의 반구에 긍정적 인 전극을 배치합니다. 해마 세포가 측면으로 주입 된 심실보다 반대편에 긍정적 인 전극 배치를 변경 대상에 약간 등의 방향 (그림 1). </li><li> 사각 파 펄스 electroporator 950 밀리 초 나누기 55 V에서 다섯 50 밀리 초 펄스로 전기 충격을 수행합니다. </li><li> t를 증가시키기 위해 각각의 자궁 뿔의 질 끝에 제 배아 예비그는 모든 배아의 생존의 기회. </li><li> 다시 어머니의 쥐에 자궁 뿔을 넣어. </li><li> 흡수 Vicryl 수술 봉합사와 복부 벽을 STICH. </li><li> Vicryl 봉합사 재료 또는 봉합 클립으로 피부를 닫습니다. </li><li> 다시 홈 케이지에 어머니의 쥐를 넣고 2 ~ 3 시간 동안 보온. </li><li> 동물 시설의 방에 자신의 홈 케이지에 혼자 쥐를 잡고 임의로 먹이. 그들은 E22-24 사이에 출생을 제공합니다. </li><li> 셋째 주 자신의 어머니와 함께 쥐의 새끼를 유지하고 성별 이후를 구분합니다. </li></ol></li></ol> 2. 루시퍼 라제 효소 반응의 생물 발광 실시간 이미징 이 방법은 자궁 내에서 형질 감염된 세포의 위치를 분석하는 데 사용된다. 공동 일렉트로 반딧불 루시 페라 제 cDNA를 oxyluciferin하는 D-루시페린 대사에, 광자 (그림 2를 방출 활성 루시퍼로 번역 </stronG&gt;). 그 결과 발광는 출생 후 (그림 4) 약 35 일 세까지 IVIS 스펙트럼에 긍정적 인 일렉트로 젊은 쥐의 뇌에서 발견 할 수있다. 본 연구에서, 루시 페라 제 분석 및 생물 발광 영상은 P7에서 시작 하였다. 이 시점은 어머니와 새끼는 출생 스트레스로부터 복구 할 수 있도록 선택되었다. 처음 P0에서 새끼와 함께 작업 할 때, 강아지의 생존에 심각한 새끼가 죽은 채 발견 또는 어머니에 의해 먹게 된 점에서 영향을 받았다. 처음에는 성공 일렉트로와 쥐의 새끼는 3 분 노출 시간을 2 차원 생물 발광의 사진으로 식별됩니다. 이어서, 긍정적 새끼는 일렉트로 영역의 위치를​​ 지정하기 위해 3D 이미지를 만들기 위해 사용된다. <ol><li> ML 15 ㎎ /의 농도로 PBS에 D-루시페린 나트륨 염을 희석하고 멸균 주사기 필터를 통해 여과하여 소독. </li><li> 새끼의 무게를. </li><li> 상단 복부에 한 손으로 강아지를 타고 약간 복부를 스트레칭. 루시페린 솔루션 복강의 체중의 10 μL / g을 주입한다. 나이가 더 민첩 사람을 위해, 루시페린을 주입하기 전에 유도 챔버에서 이소 플루 란과 새끼를 미리 마취시키다. </li><li> 3 % 이소 플루 란과 IVIS 스펙트럼 내에서 XGI-8 가스 마취 시스템의 이소 플루 란 유입을 켭니다. </li><li> 마취 시스템의 유리 코 콘에 동물의 주둥이를 넣습니다. </li><li> 그것은 깊은 마취 (2 ~ 3 분)가 될 때까지 발생하기 쉬운 위치에있는 동물을 잡아. 그 후 1.5 %로 이소 플루 란 유입을 줄일 수 있습니다. </li><li> 전체 쓰레기의 양 새끼를 선택하기 위해 2 차원 생물 발광 측정을 선택합니다. 다음 설정을 사용 <img alt="화면 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> CHEC을 설정kmark 8의 중간 비닝 (binning) 및 F / 정지와 사진에 카메라가 측정을 시작한 후 위의 사진을 걸립니다. </li><li> 설정 여기 필터 : 블록. </li><li> 매연 필터를 설정 : 개방. </li><li> 매체에 비닝을 설정합니다. </li><li> 1에서 F / 정지를 설정합니다. </li><li> 설정 스테이지 레벨 A. </li><li> 180 초에 발광 노출 시간을 설정합니다. </li></ol></li><li> 더 좋은, 긍정적 인 새끼에서 일렉트로 영역을 정량화 반딧불 루시 페라 제에 대해 다음 DLIT 설정을 사용하기 위해 3D 그림의 제작을위한. <img alt="화면 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol><li> 사진에 체크 표시를 설정하고, 카메라는 측정을 시작한 후 위의 사진을 걸립니다. </li><li> 구조에 체크 표시를 설정, 동물의 표면은 이전에 생물 발광 측정 IVIS에 의해 검색됩니다. </li><li> 유SE 2 주 세까지 배출 필터와 노출 시간 설정을 다음과 같은 : 매연 필터 (1) : 590 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (2) : 600 nm의, 노출 시간이 240 초 매연 필터 (3) : 620 nm의, 노출 시간이 180 초 매연 필터 (4) : 640 nm의, 노출 시간이 120 초 P20보다 나이가 쥐 매연 필터 (1) : 600 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (2) : 620 nm의, 노출 시간이 300 초 매연 필터 (3) : 640 nm의, 노출 시간이 300 초 <img alt="화면 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 인해 이전 동물에서 신호 강도의 감소로, 노출 시간은 세 가지 유용한 방출 필터에 대해 확대된다. </li><li> 설정 단계 레벨 B </li><li> 매체에 비닝을 설정합니다. </li><li> 1에서 F / 정지를 설정합니다 </li></ol></li><li> 후 측정, 3 월<html> 서로 구별하기 귓구멍 코드 쥐 K와 IVIS 라이브 영상 이미지에 일치하도록 </li><li> 측정 절차의 마지막에, 이소 플루 란의 유입을 끄고 케이지에 반환하기 전에 몇 분 동안 예열 접시에 쥐를 유지합니다. </li></ol> 3. 생물 발광 이미지 분석 3D 영상, 3D 영화 및 신호 소스의 볼륨의 정량의 발생은 생활 이미지 소프트웨어 IVIS 스펙트럼에 사전 설치에 의해 이루어집니다. <ol><li> 3D 영상의 생성 <ol><li> 첫째, 표면 지형을 재구성 따라서 20 ~ 30 % 사이의 임계 값을 설정합니다. <img alt="화면 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="화면 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> EEN 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> 각 파장에 대한 10 %의 이미지 임계 값과 DLIT 3D 재건을 시작합니다. <img alt="화면 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="스크린 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="화면 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . </li><li> 3D 도구 모음에서 애니메이션 버튼을 사용하여 3D 영화를 만들 수 있습니다. </li><li> 3D 이미지의 서로 다른 방향뿐만 아니라, 키 프레임으로 확대보기를 선택하고 &#39;기록 &amp; #을 누르39, 버튼, 하나의 위치 / 방향에서 다른 전환을 기록. <img alt="화면 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . </li></ol></li></ol> 4. 행동 테스트 행동 시험은 쥐의 IUE-매개 유전자 조작이 성인으로 지속 장기적인 효과를 시작할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 수행되었다. 본 특정 경우에, 과도의 효과는, IUE 후 일방적 전체 길이 인간의 DISC1의 대뇌 피질의 과발현은 도파민 관련에 대한 특정 시험으로, 암페타민의 낮은 복용량과하지 않고, (의)의 열기 필드에서 운동을 테스트하여 조사 하였다 문제 24. 에 의해 수행되는 유사한 절차에 니와 등. DISC1의 최저, IUE 마우스 아니지만을 사용 IUE 마우스의 컨트롤이 과민 반응을 보였다18 암페타민. 자궁에 DISC1 과발현 벡터로 일렉트로 된 쥐 오전 7시부터 오후 7시까지 12 시간 빛과 실험실 조건에서 개최하고, 임의로을 공급 하였다. 세 3 개월에서, 쥐의 행동 실험을 시행 하였다. 암페타민의 효과를 판독, 소리와 빛 격리 된 챔버에 위치한 트루 스캔 작업 시스템의 오픈 필드로 운동을 정량화하기 위해 사용되었다. 이 시스템은 지속 시간을 측정하고, 개방 공간의 여백 또는 중앙에서 소요 동물 이동 시간과 거리를 거리뿐만 아니라, 동작 (25)를 양육. <ol><li> 첫 날, 식염수 주사 후 시험 <ol><li> 동물의 무게를 측정. </li><li> 복강 내로 생리 식염수 (1X PBS) 1 μL / g의 체중을 주입한다. </li><li> 마우스 오른쪽 버튼으로 주사 후, 오픈 필드에 동물을 넣고 TruScan의 시스템의 측정을 시작합니다. 15 분 녹음D 3 × 5 분의 부분으로 데이터를 분할. </li><li> 다시 홈 케이지에 동물을 넣어. </li></ol></li><li> 암페타민 주사에 둘째 날 테스트 <ol><li> 동물의 무게를 측정. </li><li> 복강 0.5 ㎎ / ㎖ 암페타민 용액 1 μL / g 체중을 주입. </li><li> 주사는 오픈 필드에 동물을 넣고 TruScan의 시스템의 측정을 시작 직후. 15 분 녹음하고 3 × 5 분의 부분으로 데이터를 분할. </li><li> 자신의 홈 케이지에 동물을 반환합니다. </li></ol></li><li> 운동 및 특정 트루 스캔 소프트웨어에 의해 생성 된 양육 행동을 분석 할 수 있습니다. 그래프 패드 (프리즘)와 그래프를 작성하고 SPSS 통계 소프트웨어 통계를 계산합니다. </li></ol>

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이 연구의 저자는이 연구에 재정적 이해가없는 상태에서이 연구를 위해 기업의 후원을하지 않았다. 오픈 액세스 비용은 퍼킨 엘머 주식 포스트 간행물에 기여했다.

우리의 연구는 IUE가 뉴런이 뇌의 선택 영역에서 유전자를 발현하고, 이것은 간섭의 결과로,이 동물은 수행 조작의 기능을 나타내는 행동의 변화를 나타낸다와 성숙한 쥐를 생성하는데 적합 것을 보여준다. 본 연구에서는, 예를 들어, 전두엽 피질의 작은 부분에 일방적으로 DISC1을 과발현 쥐 암페타민으로 과민 반응 (그림 9)를 보여 주었다. 생체 내 생물 발광 영상으로 일렉트로의 성공을 위해 쥐를 선택하면 IUE 세포 형질 전환에 내재 된 변동성을 통제하는 효과가 나중에 수사 낮은 간 주제 가변성의 균일 한 IUE 지역으로 그룹을 생성하기 위해 적용되었다. 이 연구에서, 우리는 심지어 그래도, 갓 태어난 동물의 공동 일렉트로 GFP에 의한 형광 검출하여 쓰레기에서 일렉트로 새끼를 선택 할 수 없습니다우 동일한 시간에 동일한 동물에 동등하게 공동 일렉트로 루시 페라 제의 생물 발광 신호는 루시페린 주입 (그림 6) 이후에 검출 할 수 있고, 신경을 표현 GFP 6 개월의 나이에 아직도 뇌에 존재했다. 우리는 쥐에, 루시 페라 제 / 루시페린 반응이 성공적으로 일렉트로 두뇌를 가진 동물 (그림 3)을 구분하기 위해 매우 적합하다는 것을 결론을 내린다. IUE 성공 정량적 모니터링 동일한 노광 시간 (도 3) 내의 광자의 카운트에 의해 측정 공동 발현 루시퍼 라제의 효소 활성에 대응되는 생물 발광 신호의 강도에 관한 것이다. 작은 생물 발광 신호는 6 개월 쥐의 뇌의 조직학 ~ 1 × 4 광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안 쇼 1,000-2,000 GFP - 염색 된 세포의 생기에, 광자의 100 ~ 200 카운트에 의해 검출하고,. 가장 높은 신호 DISP의 윤기를 누워 ~ 5 × 6 광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안와 ~ 64,000 카운트까지. 사용되는 스프 라그 돌리 쥐 변형, 우리는 연령 증가에 길이 방향으로 생물 발광 신호의 약화를 관찰하고 신호는 P35의 나이 (그림 4)을 넘어 사라졌다. 이 시점에서, 우리는 루시퍼의 과도, 플라스미드 벡터 기반의 표현식이 감소, 또는 생물 발광 신호가 증가로 인해 뇌의 질량, 또는 둘 모두가 사라지는 신호에 대한 원인입니다을 약화 경우 여부를 알 수 없습니다. 성인 쥐의 본 기능 분석을 위해, 행동 연구에 대한 선택은 단순히 신호의 위치에 따라 제 아니지만 생물 발광 신호 강도 하였다. 3D 양적 생물 발광 모니터링은 다른 일렉트로 영역 (그림 5) 사이의 차별화 허용하더라도, 그 정확함은 깊이 다임에있는 셀에 대한 제한되었다뇌 nsion.도 6은 2D 및 3D 영상에 생물 발광 측정이 일렉트로의 좋은 위치를 지시 한 해마 일렉트로의 예를 나타낸다. 해부 사후 뇌에서 GFP 형광 신호가 해마의 정확한 타겟팅을 나타내는 생물 발광 신호와 같은 위치에 대한 검출되었다. 그러나 조직학 쇼는 해마의 피질 등의 세포 (그림 7)을 대상으로했다 그. 이 생물 발광 분석은 긍정적, IUE 새끼를 감지하고 또한 일렉트로 지역의 아이디어를 가지고 있지만, 궁극적으로, 영상은 정확히 적극적으로 타겟 세포를 집중에 사후의 조직학을 대체 할 수있는 유용한 도구임을 나타냅니다. 이 데모는 C에 aberrances을 시뮬레이션하는 대뇌 피질이나 해마 뇌 영역의 미묘한 대상 조작을 생성하는 IUE 기술의 응용 프로그램에 대한 약속을 나타냅니다ortical 마이그레이션 또는 성인 동물에 영향을 미칠 수있는 다른 신경 발달 결함. 양자 일렉트로 26 거동에 큰 영향 가능성의 이점을 가지고 있지만, 태아를 더 사망률도있다. 일방적 인 일렉트로는 일방적, 작은 지역에도 IUE 조작이 동작을 변경하려면 충분하다는 것을 표시하기위한 내부 통제와 같은 하나,뿐만 아니라 함께 두 개의 반구를 비교하기 위해 선택되었다. 뉴런 사이의 연결이나 건축 IUE 유도 변경하여 적절한 행동 테스트와 병변 - 수 - IUE-조작 영역의 필요한 경기를 되살리는없이 유도 할 수있다하는 것은 과학적인 문제에 따라 달라집니다. 트러블 슈팅 감소 산자 IUE 새끼의 생존을 증가에 대한 몇 가지 제안이 있습니다. 첫째, 전기 천공 중에 매우 얇은 유리 모세관의 사용 조직 lesio을 최소화하기 위해N을 권장합니다. 둘째, 각각의 자궁 뿔의 질 끝에 첫 번째 배아를 electroporate하지 않습니다 장자 배아의 죽음은 다른 모든 배아의 중단의 가능성을 증가시킨다. 셋째, 출산 후, 어머니의 쥐가 자주 인해 주 산기 스트레스에 그들의 자손의 일부를 죽일. 추가적인 응력을 감소시키기 위하여, 오른쪽 생후 라이브 촬상로 시작하지 않지만, 칠일 기다린다. 새끼의 GFP 형광 검출 1 주로 출산 후, I​​VIS 스펙트럼과 라이브 양안 형광 현미경 영상 또는 형광 이미징을 사용하여 하나에 의한 형광 신호 없음 (표면 형광 및 transfluorescence 모드, GFP 여​​기 / 방출에 대한 : 520분의 465 nm의 540분의 500 NM). 또한, 피부의 두개골과 높은 자기 형광 배경처럼 조직 내지 단파장 여기 및 발광 광의 제한된 전송 DESC 하에서 형광을 사용하여 둘 것을 방지 할 수있다쥐의 조건을 ribed. 도 6에 도시 된 바와 같이, 살아있는 동물에서 루시퍼 신호는 또한 (두개골)없이 해부 뇌에서 검출 될 수있어, 또한 형광 신호는 (도 6D) 검출이다. 근접한 뇌 영역에있는 생물 발광의 분화 심지어 3D 그림에서 생물 발광 영역의 위치가 100 %로 예측 될 수 없다. 또는 예측 된 영역의 아래 위에 특히 세포는 또한 실수로 대상 및 형질 전환 할 수 있습니다. 정확한 위치는 (그림 7 참조) 사후의 (형광) 조직 학적으로 제어 할 수 있습니다.

그것은 상대적으로 쉽게 신경 발달 연구를 활성화하기 때문에 두뇌 개발에 유전자 발현의 조절을 할 수있는 자궁 일렉트로 (IUE) 방법의 개발, 돌파구이다.의 표적 유전자의 발현 수준에 1-7 변경 설치류에 배아 및 / 또는 주 산기 개발하는 동안 특정 뇌 영역이 영향을 신경 증식, 이동, arborization 및 연결 결정적 입증했다. 8-10 정신 분열증은 신경 발달 이상 (11, 12) 그러므로 정신 분열증에 대한 확인 된 후보 유전자의 많은에 대한 예를 들어 같은 신경 발달에 대한 잠재적 인 변조 효과를 조사하는 관련 된 급성과 만성 증상이 복잡한 정신 질환 인 중단 -에 - 정신 분열증 -1 (DISC1) 유전자 13-15. 두뇌 개발은 regulat입니다사전, 요정과 출생 후 발달 기간에 역할을하는 유전 적 요인과 환경과의 상호 작용에 의해 에드. 다양한 행동 장애에 대한 하나의 주요 유전 적 위험 요인은 쥐 13, 17 마이그레이션 결함 DISC1 16 유전자. DISC1 넉다운 리드하고, IUE에 의해 개발 피질 DISC1 식의 조작은 성인 마우스 (18)의 행동에 영향을 미치는 것으로 나타났다. IUE에 의해 뇌의 유전자 발현을 조작하는 것은 몇 가지 장점에게 유전자 변형 동물 라인의 세대에 비해 19 있습니다. 첫째, 관심 영역 내에서 유전자 발현은 달이 아닌 유전자 변형 쥐 라인을 사육의 여러 세대에 주 이내에 이루어집니다. 둘째, 생식 공학 동물 (20)의 표현형을 보호 할 수 있습니다 초기 개발시 보상 메커니즘을 피할 수 있습니다. 단지 특정 세포 집단 또는 뇌의 특정 영역, migrati을 대상으로를 통해, 세 번째또는 확산의 차이는 직접 비 돌연변이와 비교하거나 일방적 electroporations이 선택하는 경우 반대쪽을 제어 할 수 있습니다. 한편, IUE는 프로모터 구동 CRE / LOX 유도 식의 타이밍 및 특정 지역의 셀만을 모집단의 유전자 발현 패턴의 모자이크 종류 선도 대상의 정확성을 가지고 있지 않습니다. 안정, 생식선 - 형질 전환 설치류의 주요 장점은 무시할 수 있도록 성체 설치류에서 많은 실험 애플리케이션의 뇌 영역에있는 셀들의 한정된 수의 일시적인 형질 감염은, 충분한, 또는 바람직 할 수있다. 사실, IUE 일부 비정상적으로 개발 된 세포가 세포 나 회로의 전체 네트워크에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하는 데 유용합니다. 또 다른 장점으로 인해 히트의 모자이크 성격 유전자의 비 세포 자율적 인 효과를 입증 할 수있는 능력이 될 수 있습니다. 또한, 유전자 변형과 녹아웃 쥐의 발생을 초기 단계 및 사용에게 아직비정상적인 두뇌 발달의 결과를 연구하는이 종 IUE의 높은 관심이다. 지금까지, 인원수 등 그 동물에 개입 결과를 조사 할 IUE 사용의 주요 장애물은 모니터링 일렉트로 성공의 부족이다. 지금까지, 라이브 신생아 래트 새끼 적합한 쌍안 형광 현미경 또는 IVIS 스펙트럼의 형광 이미징 검출 할 수없는 형광 뉴런 GFP - 코 - 형질. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 루시퍼 라제 리포터 유전자를 공동 형질과 IUE 뇌 영역의 3 차원 (3D) 정량에 의해 새끼의 생물 발광 라이브 영상을 수행 하였다. 신경 발달 유전자 조작, 쥐 태아의 뇌실에 인간의 DISC1, 루시퍼 라제 및 GFP를 포함하는 플라스미드의 공동 주사를 테스트하기 기능 분석에이 방법의 적용 가능성을 입증하기위한 예를 들어 <su트위터 전극과 일렉트로 다음 P&gt; (3)을 수행 하였다. 형광 신호가 생체 내에서 출생 후의 단계에서 검출되지 않을 수 있지만, 공동 형질 루시퍼 라제 유전자에 의해 루시페린의 신진 대사에서 파생 된 고체 생물 발광 신호는 출생 후 5 주까지 검출되었다. 부족하거나 잘못된 일렉트로와 새끼가 IUE 동물의 할당을 가능하게하여, 처음부터 확인 (관심의 유전자를 제어 스크램블) 낮은 변동성의 일치 일렉트로 뇌 영역과 실험군으로 하였다있다 일렉트로 뇌 영역 허용 정량의 3D 측정 . 행동 패러다임 어른 IUE 쥐의 사용은이 프로토콜의 유용성의 예를 들어 설명 하였다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent name&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>without calcium, without magnesium</td></tr><tr><td>D-luciferin, sodium salt</td><td>SynChem OHG, Germany</td><td>BC218</td><td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>F7258-25G</td><td>CAS: 2353-45-9</td></tr><tr><td>D-Amphetamine</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>A 5880</td><td>CAS: 51-63-8</td></tr><tr><td>kodan Tinktur forte</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH, Germany</td><td>104 005</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Material / product&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Glass capillaries</td><td>Sutter Instrument</td><td>Novato, California, USA</td><td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td></tr><tr><td>Needle Pipette Puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Tujunga, California, USA</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer electrode</td><td>Nepa Gene CO., LTD.</td><td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td><td> 7 mm in diameter platinum disc electrodes (&lt;a href=&quot;http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;&lt;em&gt;CUY650P7&lt;/em&gt;&lt;/a&gt;) </td></tr><tr><td>Surgical Scissors - sharp </td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Germany</td><td> Straight, 12 cm (14002-12) </td></tr><tr><td>Ring Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Germany</td><td> 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) </td></tr><tr><td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td><td>Nepa Gene CO., LTD.</td><td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td><td>(CUY21SC)</td></tr><tr><td>Vicryl surgical suture material </td><td>Ethicon</td><td>Norderstedt, Germany</td><td>3-0; 2 Ph. Eur;</td></tr><tr><td>Wound Clip Applicator </td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Germany</td><td>Reflex 9 mm (12032-09)</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>VWR</td><td>Darmstadt, Germany</td><td>0.45 &amp;mu;m cellulose acetate</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum </td><td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td><td>Waltham, MassachusettsUSA</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td><td>PerkinElmer</td><td>Waltham, Massachuset tsUSA</td><td></td></tr><tr><td>Open-field</td><td>Coulbourn Instruments</td><td>Allentown, USA</td><td>(40 x 40 x 39 cm)</td></tr><tr><td>Tru Scan activity system </td><td>Coulbourn Instruments</td><td>Allentown, USA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;table border=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt;&lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;4&quot;&gt;&lt;strong&gt;Table of recipes&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt; &lt;strong&gt;Number&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Buffer name&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Content&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Comments &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;1&lt;/td&gt; &lt;td&gt;DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1.5 &amp;mu;g/&amp;mu;l pCAX humanDISC-1, &lt;br/&gt; 0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;l pCAX-luciferase, &lt;br/&gt; 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 &amp;mu;l of the mixture are enough for ~5 IUE&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;2&lt;/td&gt; &lt;td&gt;DNA-Mixure for control&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0,75 &amp;mu;g/&amp;mu;l control shRNA1, 0,75 &amp;mu;g/&amp;mu;l control shRNA2, 0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;l pCAX-luciferase, 0.5 &amp;mu;g/&amp;mu;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Fast Green Dye (0,5 %) add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;100 &amp;mu;l of the mixure are enough for ~5 IUE&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;3&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Fast green Dye&lt;/td&gt; &lt;td&gt;10 mg/ml Fast Green FCF in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;4&lt;/td&gt; &lt;td&gt;D-luciferin solution&lt;/td&gt; &lt;td&gt;15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;5&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Amphetamine solution&lt;/td&gt; &lt;td&gt;0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt; </td></tr></tbody></table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

자궁 일렉트로에서 (IUE)는 신경 세포의 발달을 조사하기 위해 뇌 세포의 유전자 조작을 가능하게하는 기술이다. 지금까지 성인 뇌의 행동이나 신경 병리학을 조사하는 IUE의 사용은 출생 후 동물의 비 침습 기술에 의해 IUE 형질 전환 성공의 모니터링을위한 불충분 한 방법으로 제한되었습니다. 본 연구의 경우, E16의 쥐 IUE 사용 하였다. 배아로 핵산의 뇌 실내 주입 후, 족집게 전극의 위치는 현상 피질 또는 해마 하나를 타겟팅 중요했다. 심실 공동 사출 및 3D 정량화 소프트웨어 IVIS 스펙트럼 장치를 사용하여 출생 후 생체 내 생물 발광에 의한 마취 라이브 P7 강아지의 루시페린 복강 주사 후 형질 감염된 세포의 루시퍼 라제 유전자 허용 모니터링의 일렉트로. <p생물 발광에 의한 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 지역의 정의는 명확하게 대뇌 피질과 해마 electroporations 구별 출생 후에 5 주 정도 시간이 지남에 길이 방향으로 신호를 감지 할 수 있습니다. 이 영상 기술은 우리가 세 3 개월 째 행동 조사를 수행하기 위해, 이후, 생물학적 효과를 유발하고 필요한 가정 형질 세포의 충분한 수의 새끼를 선택하는 것을 허용했다. 예를 들어,이 연구는 쥐의 대뇌 피질에 인간의 전체 길이 DISC1 유전자와 IUE는 암페타민 과민 반응을 이끌었다 고 보여줍니다. 공동 형질 GFP 생후 ≥ 6개월에 존재하는 유전자 발현을 나타내는 저온부에 사후의 형광 현미경으로 뉴런에서 발견 할 수있다. 우리는 출생 후 생물 발광 영상은 쥐의 IUE와 일시적인 형질의 성공을 평가할 수 있다는 결론을 내린다. neurodevelopmen 동안 국소 유전자 조작의 영향에 대한 조사성인의 뇌와의 연결에 t 크게 촉진된다. 많은 과학적인 질문을 위해,이 기술은 보완 또는 형질 전환 쥐의 사용을 대체 및 행동 신경 과학에 대한 새로운 기술을 제공 할 수 있습니다.

<html> 그림 3은 150 밀리그램의 루시페린 / kg 체중의 주사 후 P7에서 세 쥐 새끼의 영상 측정을 살고있다. IUE의 효율의 변동을 나타내는 신호 강도의 차이를 볼 수있다. 강한 생물 발광 신호는 P36 (그림 4)까지 기록되었다. 그림 5에서, 생물 발광 영상에서 대뇌 피질 (도 5A 및 5C)와 해마 (그림 (b)와 (d)) 일렉트로을 정의 할 수있는 기능이 그려져있다. 두개골 제거 (그림 7B)와 P14의 저온 절단 된 뇌 (그림 8)에서 해당 GFP - 일렉트로 세포 후의 형광 신호와 생물 발광 신호 (그림 7A)의 상관 관계는 그림 6-8에 묘사되어있다. 참고로, 더 있었다 어떤 시점에서 살아있는 쥐의 형광 신호의 검출. 십t &quot;&gt; 생체 내 생물 발광 영상은 표시된 예에서. 2D로 다른 일렉트로 뇌 영역의 대략적인 차별 크게 3D 이미지 (그림 5C 및 5D)를 생성 IVIS 스펙트럼 소프트웨어의 DLIT 프로그램 개선 (도 5A 및 5B)를 수 , 전두엽 피질과 해마의 일렉트로는 구별 할 수 있습니다. 그것은 해마를 electroporate을 목표로하면서, 해마의 피질 거짓말 등의 일부 전구 세포는 또한 (그림 7) 타격을받을 수 있다는 것을 유의해야한다. 일방적으로 자궁의 피질에 pCAX 벡터로 electroporation하여 이후에 전체 길이 인간의 DISC1을 발현하는 쥐가 성인과 자연과 암페타민에 의한 과잉 행동 모두에 대해 조사 하였다. pCAX-DISC1과 일렉트로 쥐 암페타민의 낮은 복용량에 과민했다. 이 쥐가 크게 개월 이동다시 후 식염수 주입보다 암페타민 처리, 후 반면 대조군 (그림 10)하지 않았다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> 그림 1. A) 피질 일렉트로 및 B) 해마의 electroporation에 대한 전극 위치의 계획, 녹색 = 뇌실 내 DNA-믹스를 주입했다. <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> 그림 2. 루시 페라 제 반응. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> 그림 3. / kg 체중 luciferine 150 mg을 주입 후 P7 래트의 발광 측정, 노광 시간 180 초, 노 발광 신호 A) 쥐; B) 쥐<html> 약한 생물 발광 신호, 강한 발광 신호 C) 쥐. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> 그림 4. IUE 성공을 검출 할 수있는 많은 시간 창을 보여주는 150 ㎎ / kg의 luciferine의 주입 후 동일한 래트 연속 생물 발광 측정 시간 라인. <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> 해마에서 B) &amp; D). C) &amp; D) 3D 사진;; 피질에서) &amp; C). P7 A) &amp; B의 대뇌 피질과 해마 일렉트로의 차이) 2D 그림의 그림 5와 그림.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> 그림 6. P14의에서 쥐 강아지의 E16 ​​해마의 electroporation) 생물 발광의 B의 2 차원 그림) 생물 발광 신호 C의 3D 그림)의 그림은 생물 발광 신호 D) 뇌 GFP 에피 형광 신호로 뇌를 해부. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> 그림 7. GFP 포함하는 플라스미드 및 루시퍼와 일렉트로 같은 P14 쥐 뇌의 20 μm의를내는 부분에서 형광 영상의 세부 사항벡터, DAPI로 핵 염색, CA1-3 = 뿔 Ammonis 1-3, DG = 치아 이랑 (dentate gyrus), FC는 = Fasciolarum cinereum. 비디오 1. 해마의 3D 애니메이션은 P14에 쥐 일렉트로. <img alt="그림 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> 그림 8. 암페타민 테스트 방식 : 첫날 식염수 주입 15 분 시험 전에, 24 시간 이후 암페타민 열기 필드 챔버에서 테스트하기 전에 주입. <img alt="그림 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> 그림 9. 암페타민 테스트. . 회색 막대 = DISC1 과발현 군,, 대조군 N = 10, 15 분 화이트 바 = 대조군에 비해 TrueScan 시스템에 의해 기록 된 동물 (cm)는 이동 된 거리를 표시하는 막대 그래프 DISC1 과발현 그룹 N = 11; ANOVA : GENO * 치료 P = 0.043; 암페타민 NS 대 총 시간 식염수 = 중요하지 pcontrol = 0.172, pDISC1 = 0.001 T-테스트.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.5K 조회수.  Medical School Düsseldorf.  유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다. 

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

비 심실 플라스미드 주입 및 Electroporation에 의해 출생 후의 쥐 뇌에 유전자 전달

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

연구

신경과학

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol, we outline the experimental methodology for preparing rats for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E15-E21 rats, however it is most commonly performed at E16 as shown in this video.

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

생물학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

발생학

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is an invaluable tool for gene function analysis in living organisms. The standard transgenesis method is based on microinjecting foreign DNA fragments into a pronucleus of a fertilized oocyte. This technique is widely used in mice but remains relatively inefficient and technically demanding in other animal species. The transgene can also be introduced into one-cell-stage embryos via lentiviral infection, providing an effective alternative to standard pronuclear injections, especially in species or strains with a more challenging embryo structure. In this approach, a suspension that contains lentiviral vectors is injected into the perivitelline space of a fertilized rat embryo, which is technically less demanding and has a higher success rate. Lentiviral vectors were shown to efficiently incorporate the transgene into the genome to determine the generation of stable transgenic lines. Despite some limitations (e.g., Biosafety Level 2 requirements, DNA fragment size limits), lentiviral transgenesis is a rapid and efficient transgenesis method. Additionally, using female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is presented as an alternative to generate pseudopregnant foster mothers.

This article aims to provide the methodology for lentiviral transgenesis in rat embryos using multiple injections of a virus suspension into the zygote perivitelline space. Female rats that are mated with a fertile male strain with a different dominant fur color is used to generate pseudopregnant foster mothers.

렌티바이러스 벡터 접근법을 이용한 형질전환 쥐 생성

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

생체공학

Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia (BPD). In premature infants, BPD is a major complication despite early use of surfactant therapy, optimal ventilation strategies, and noninvasive positive pressure ventilation. Because pulmonary inflammation plays a crucial role in the pathogenesis of BPD, corticosteroid use is one potential treatment to prevent it. Nevertheless, systemic corticosteroid treatment is not usually recommended for preterm infants due to long-term adverse effects. Preclinical studies and human phase I clinical trials demonstrated that use of mesenchymal stromal cells (MSCs) in hyperoxia-induced lung injuries and in preterm infants is safe and feasible. Intratracheal and intravenous MSC transplantation has been shown to protect against neonatal hyperoxic lung injury. Therefore, intratracheal administration of stem cells and combined surfactant and glucocorticoid treatment has emerged as a new strategy to treat newborns with respiratory disorders. The developmental stage of rat lungs at birth is equivalent to that in human lungs at 26&#8722;28 week of gestation. Hence, newborn rats are appropriate for studying intratracheal administration to preterm infants with respiratory distress to evaluate its efficacy. This intratracheal instillation technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into the lungs.

Described is a protocol for performing intratracheal transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs) through intratracheal injection in term neonatal rats. This technique is a clinically viable option for delivery of stem cells and drugs into neonatal rat lungs to evaluate their efficacy.

신생아 쥐 기간에 줄기 세포의 내 치 통 주입

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해

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