우리는이 원고를 편집 하는 그녀의 도움에 대 한 섬 너 엘리자베스를 인정 하 고 싶습니다. 이 프로젝트에 대 한 자금 의해 제공 했다 일부는 무디 프로젝트 변환 외상 성 뇌 부상 연구 및 RO1NS052532 HLH 하.

참고: 관리 및 활용에 대 한 국가 학회 건강 가이드의 지시에 따라 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 텍사스 의학 지점, Galveston, 텍사스의 대학 위원회에 의해 승인 실험 동물 (8 판, 국가 연구 위원회).
 1. 조직 컬렉션, 지역 식별 및 단면화 <ol><li>주제 성인, 남성, Sprague-Dawley 쥐, 대략 6 주 오래 된, 250-300 g, 실험 유체 타악기 부상, 쉬 마무 라 외에 설명 된 대로. 4.</li> <li>실험 TBI 후 24 시간 고통 없이 4%까지 깊이 취 isoflurane 농도와 챔버에 배치 하 여 동물을 안락사. 잘린 여 죽음을 보장, 두뇌, 소비 세 및 즉시 가루 드라이 아이스에 동결. 단면까지-80 ° C 냉장고에 머리를 고정 하는 게.</li>
	<li>이전 transcriptional 분석을 포함 하는 모든 LCM 프로시저에 오염 및 RNA 저하에 대 한 위험을 완화 하려면 제거 세제 RNase와 모든 표면을 청소. 
	참고: 얼룩, cryostat 어디 조직 구분은, 사용 하는 지역과 LCM 장치 주변 지역 포함이 청소.</li>
	<li>Cryostat-20에 냉각에 스토리지 및 장소에서 뇌 조직의 검색 ° C. 허용 뇌 ~ 10 분 cryostat 챔버의 온도에 equilibrate</li>
	<li>는 Cryostat 무대 위에 거 즈 시트를 뇌 복 부 측을 놓습니다. 깨끗 한, RNase 무료 면도날으로 잘라 후부 부분 소 뇌에 그냥 rostral (수 저장 하거나 삭제) 시 chiasm (그리고) 그냥 앞쪽 부분.</li>
	<li>두 개의 별도 cryomolds로 최적의 절삭 온도 (10 월) 매체의 작은 금액을 놓습니다. 두뇌 (및 포함 하는 정면 협회 피 질 (FrA) 핵 accumbens 코어 (AcbC)) cryomolds 앞쪽 측면에 아래로 놓습니다. 충분 한 10 월 매체 조직을 커버를 추가 합니다.
	<ol><li>마 (Hp) 및 suprachiasmatic 핵 (SCN) 포함 하는 뇌 조직으로이 단계를 반복.</li>
		<li>는 cryostat에서 ~ 20 분 동안 완전히 동결 OCT 매체 허용.</li>
	</ol></li> <li>조직과 10 월 중간 완전히 고정 하 고, 일단 장착 머리에 시비 거는 작은 양의 10 월 누르고 언된 cryomolds 장착 머리에 조직 포함. 허용 형 조직을 포함 하는 머리에 단단히 부착 되도록 완전히 동결 OCT.</li>
	<li>단면 마운트 헤드 첨부 파일 보안 하 고 나사를 조입니다. 섹션 고르게 잘라 되도록 조정 레버 cryostat 블레이드 관련 절단 각도 조정.</li>
	<li>30 µ m 섹션 두께 설정합니다. 단면화 이용 및 AcbC를 포함 하는 조직 블록 때 먼저 단면화 대뇌 피 질은 분명 때까지 하 고 다음 시작 수집 시작.</li>
	<li>두어서 부드럽게 sectioned 조직 위에 실내 온도 폴 리 에틸렌 napthalate (펜) 막 슬라이드는 프랑스에 대 한 보조 모터 피 질 (M2까지 쥐 뇌 아틀라스 12, 섹션 및 수집 뇌 참조 섹션 ) Bregma 5.16 m m에 도달.
	<ol><li>시각적으로 검사 하는 경우 조직 및 10 월 슬라이드에 완전히 녹아 슬라이드에 부착을 보장. 얼룩까지 있는 cryostat 조직 단면도 있는 모든 슬라이드를 저장.</li>
	</ol></li> <li>구분 (aca) 전방 commissure 표시 됩니다 Bregma 1.80 m m에서 지금 명백한 측면 심 (LV) 아래 하나의 완전 한 commissure에 통합 될 때까지 계속.</li>
	<li>Bregma에 aca와 연결 하는 정 맥 주사까지 수집 섹션 표시 0.84 m m.</li>
	<li>FrA를 AcbC 단면을 완료 하면, 탑재 된 조직 블록을 제거 하 고 HP와 SCN을 포함 하는 블록을 바꿉니다.</li>
	<li>는 그리고 병합 됩니다 Bregma에-0.48 m m, 제 3 심 (3V) 명백한 될 때까지 섹션.</li>
	<li>수집 섹션-0.72 m m, supraoptic decussation (sox) 시작 될 때 Bregma까지이 시점에서 SCN. 
	참고: 그것은 그리고를 통해 더 많은 조직 단면도는 SCN은 쉽게 통과 수집 해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>HP 컬렉션에 대 한 섹션까지과 립 세포의 뿔이 이랑 (GrDG) 레이어는 가시 Bregma에 명백한-3.00 m m.</li>
	<li>수집 섹션 hippocampal CA 하위 Bregma에 코로나 섹션 융합 하는 때까지-4.78 m m. 이 세부 craniotomy 부상 사이트에서 해 마의 완전 한 컬렉션에 대 한 수. 
	참고:이 실습에서 이전 간행물 같이, 가장 부상된 셀이이 범위 내에서 명백한 되며 유전자 또는 예측에 관한 식 분석에 적합.</li>
</ol> 2. 프로토콜을 얼룩이 RNase 제거 세제와 화학 증기 두건에서 얼룩 지역 및 <ol><li>이전 모든 얼룩, 세척에 식기. 오염으로 인 한 RNA 저하의 위험을 완화 하는이 준비.</li>
	<li>준비 모든 착 색 시 약 및 nuclease에 솔루션 무료 물.</li>
	<li>는 Cryostat 및 증기 두건에서 장소에 저장 하는 슬라이드의 랙 걸릴. 솔루션 (nuclease 무료 물 준비) 다음과 같이 얼룩으로 그들 30 s. 장소에 대 한 따뜻한 슬라이드 수: 75% EtOH nuclease 무료 1 분 1 분, 1 분 동안 1 %cresyl 바이올렛, 30 nuclease 무료 물 물 s, nuclease 무료 물 30 s 95% EtOH 30 s, 100% EtOH 30 s, 3 분, 크 실 렌 및 크 실 렌 3 분 위한</li>
	<li>선반 증기 두건에서 실 온에서 10 분 더 이상으로 보다에 대 한 건조를 허용 합니다. 또는, 빨리 건조 Rnase 무료 진공 desiccator에 선반 장소. 건조 되 면, LCM에 즉시 진행.</li>
</ol> 3. 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정 LCM 시스템 <ol><li>RNA 분석에 대 한 어떤 LCM 절차를 시작 하기 전에 닦아 컬렉션 영역과 RNase 제거 세제와 100% 장치 주변 EtOH.</li>
	<li>에 IR 레이저 단위를 생성 하는 기본, 현미경을 켜기 전에 전원 스위치를 플립 하 고 시스템 소프트웨어를 바탕 화면에서 시작 하기 전에 초기화을. 
	참고:이 순서로 완료 하지 소프트웨어 인식 하지 것입니다 현미경.</li>
	<li>소프트웨어는 부팅 하 고 그것의 초기화 단계를 통해 실행, 눌러는 &#34; 현재 단계 &#34; 소프트웨어에 단추 &#34; 설치 패널. &#34; 모듈 단계 어디 LCM 매크로 모자와 슬라이드 수 로드 하 고 로드 하는 위치로 이동 합니다.</li>
	<li>오른쪽으로 직면 하 고 반투명 가장자리 펜 막 슬라이드 (최대 한 번에 3) 홀더를 배치. 
	참고: 잘못 된 방향에서 보유자에 배치 하는 경우 소프트웨어 않을 수 있습니다 원하는 적외선 또는 자외선 절단 영역을 제대로 인식할 수.</li>
	<li>클릭은 &#34; Mem &#34;에 체크는 &#34; 모자와 슬라이드 처리 영역 &#34; (즉, A, B 또는 C) 각각 슬라이드 옆. 이 단계는 슬라이드 막 유리 슬라이드 인지 나타냅니다. 다음 먼저 캡처할 원하는 슬라이드를 클릭 합니다.</li>
	<li>조직 위치에 대 한 타일된 이미지와 모자 게재 위치에 대 한 방향 카메라를 만들기 위해 선택 &#34; 이미지 &#34; 선택 하 고 도구 모음에서 &#34; 취득 개요. &#34; 
	참고: 사용자가 수집 되 고 조직에 익숙한 경우이 단계를 생략할 수 있습니다 위치 수동 스크롤 볼을 사용 하 여는 &#34; 지역 센터 &#34; 컬렉션에 대 한.</li>
	<li>타일된 이미지 (또는 타일된 이미지 없이 상대 위치) 영역에 커서를 놓고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 &#34; 장소 모자에서 지역 센터. &#34; 소프트웨어는 자동으로 놓고 모자를 선택한 위치.</li>
	<li>위치 선택. 
	참고: IR 레이저 제대로 정렬 되 고 유일한 지역 관광 명소는 소프트웨어에 의해 누워 있다 데리 러 것입니다 수 있도록 그것은 해야 합니다 있는 진행 하기 전에.
	<ol>
		<li>이동 지역 내의 없는 조직 존재 합니다. 클릭 &#34; 나 &#34;에 &#34; Microdissect 도구 창 &#34; 선택은 &#34; IR 찾기 &#34; 탭. 창에서 화재 IR 레이저 발사 되 고 반점의 크기를 평가 하기 위해 총 IR 테스트.</li>
		<li>커서, IR 자리 및 선택 중간 클릭 마우스 오른쪽 &#34; 있는 IR 자리. &#34; 
		참고: IR 광선의 강도와 크기 바뀔 수 있다 수동으로 변경 하 여는 &#34; 전력, 직경, 또는 기간 &#34; 각 크기 지정자 또는 대화 상자 아래쪽에 슬라이딩 스케일을 이동 하 여. 몇 가지 테스트 샷 적절 한 크기를 위해 해 고 할 수 있습니다. IR 레이저 모자 변경 또는 슬라이드의 위치 전환 때마다 다시 위치 해야.</li>
		<li>UV에 대 한 선택 하 여 UV 레이저를 찾습니다,는 &#34; UV 찾기 &#34; 대화 상자에 탭. 
		참고: UV 레이저와 적외선 레이저 한 마음으로 이동, 이므로 지속적으로 다시 찾아 UV 레이저 위치 변경 때마다 필요가 없습니다.</li>
	</ol></li> <li>선택은 &#34; 자유 그리기 &#34; 옵션은 &#34; 선택 도구 창 &#34;. 터치 스크린 스타일러스를 사용 하 여 터치 스크린 및 스타일러스 머리 사이의 접촉을 잃게 하지 않도록 하면서 관심 영역의 둘레의 주위에 그립니다. 시작 그리고 종점을 함께 연결 확인. 
	참고: IR 관광 명소 것입니다 운영할 수 자동으로 소프트웨어를 통해 하지만 사용자 조직 모자 UV 절삭 수행 된 후으로 준수 되도록 추가적인 관광 명소 누워 하도록 선택할 수 있습니다.</li>
	<li>이용에 대 한 컬렉션 수행 M2 피 Bregma 5.16 m m에 나타날 때까지 대뇌 피 질의 조직의 총 레이저 캡처. 
	참고: 프랑스 또는 특정 셀의 특정 부분만 수집 되도록 수정 될 수 있습니다이 세부.</li>
	<li>위한 AcbC 컬렉션, 레이저 캡처는 aca에 근접에 있는 지역 가까운. 
	코어와 쉘에 AcbC의 다른 기능을 수행 하 고 순수 독특합니다. 따라서 뇌 아틀라스 최대한 가까이 따르는 것이 중요 하다. 더 bregma 0.84 m m, 두 과거에서 수집 하는 것이 좋습니다 오는 아구 너무 밀접 하 게 서로와 연관 된다.</li>
	<li>Hp에 대 한 컬렉션, 레이저 캡처 CA 1, 2, 및 3 hippocampal 하위 Bregma 3.00 m m에서 시작 하 고 형태학 식별에 대 한 물리적 랜드마크로 완전히 구성 된 GrDG를 사용 하 여. 
	참고:이 연구의 목적을 위해 수집 하지 않습니다 Bregma 과거-4.78 m m, 수 수 시각적으로 경계선 지점으로 Hp 하위 융합 되 고 ventrally 포인트. 이 지역 선정 되었다 가장 부상 뉴런 부상 사이트 6 바로 아래 발견 될 수 있다.</li>
	<li>SCN 컬렉션, 먼저 시각적으로 식별 하는 및에 지 앉아서 다음 수집 밀도가 포장된 핵.</li>
	<li>지역 (위에 나열 된)의 컬렉션, 후 이동에 LCM 매크로 모자는 &#34; QC 위치 &#34; UV 컷 조직 시각적으로 함으로써 완전 한 조직의 준수 막에 연결에 대 한 검사. 신속 하 게 캡 ontoan RNase 무료 0.5 mL 얇은 벽으로 둘러싸인된 반응 관 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 µ L를 포함 된 장소.</li>
	<li>소용돌이 샘플 짧게 완전 한 세포를 확인 하 고-80 ° c.에 저장 이 시점에서, LCM을 일시 중지할 수 있습니다 및 샘플 저장 될 때까지 다운스트림 게놈 분석 6.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

포유류 두뇌의 분자 연구, LCM는 필수적인 기법 되고있다. 이 문서에서는 LCM 시스템에 IR 및 UV 절단 레이저의 조합을 사용 하 여 포유류 두뇌의 모든 지역에서 게놈 변화를 캡처할 수 있습니다 보여 줍니다. 이 지역 cresyl 바이올렛 이나 되며, 오신 등 기존의 LCM 호환 얼룩 식별 포함 됩니다. 레이저 캡처 프로세스와 펜 막 슬라이드에 두꺼운 30 µ m 섹션에 LCM을 수행 하는 능력의 속도 뿐만 아니라 충분 한 양의 세포 샘플을 얻을 뿐만 아니라 모든 종류의 다운스트림에 대 한 적합 한 품질의 LCM 샘플에서 RNA를 분리 수 있습니다. 게놈 분석; 이러한 분석 등 microarrays16, PCR 배열17, 양적 실시간 PCR18.
우리의 데이터는 LCM 조직을 활용 하는 연구에 대 한 근거를 제공 합니다. 보면 그 미르-15b upregulated 해 마와 대뇌 피 질 (그림 4) 하지만 핵 accumbens에서 downregulated 이며 생물학적으로 두뇌에 있는 TBI의 차동 효과의 이해에 관련 될 수 있습니다. 이전 연구는 부상으로 대뇌 피 질의 신경 취약성 증가 부정적인 Bcl-219등 프로 생존 유전자를 통제 하는 몇몇 miRNAs의 overexpression에서 결과 제안 했다. 대상 검색 분석 쇼 Bcl-2 미르-15b;에 의해 또한 통제 된다 따라서, 우리의 데이터 제안 왜 기계 설명 두뇌의 특정 지역 (즉,, FCx) 선택적으로 TBI에 취약할 수 있습니다. 그것은 대부분 유전자 여러 miRNAs에 의해 통제 된다 유전자를 특정 대상에 어떤 한 미르에 변화를 상호 연결 하는 것은 어려운 기억 하는 것이 중요. 또한, 이러한 데이터를 나타내는 유전자와 예측에 관한 식에서 특정 변화 지역별 뇌 손상의 생체로 사용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 현재이 데이터 사용 하 여 이러한 연구에서 새로운 신경의 항우울제 특성을 가진 약물 화합물 차동 영향을 미칠 수 정신병 무질서에 연결 된 두뇌 지구에서 유전자와 예측에 관한 식. 우리의 연구의 한 가지 한계는 LCM에 대 한 슬라이드 준비 프로세스의 여러 단계 중 RNA 무결성 있습니다 될 손상입니다. 이 프로토콜 RNA 저하의 위험을 완화 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 또 다른 한계 통계 계산을 위해 사용 되는 상대적으로 작은 샘플 크기입니다. 미래에 연구, 샘플 크기를 늘리면 개별 동물 중에서 유전자와 미르 식 유사의 효과 완화 해야 합니다.
LCM의 혜택은 인간의 질환과 질병 조직20,21,,2223의 동물 모델을 사용 하 여 변환 게놈 연구에서 실현 된다. 특정 세포 인구를 잡으려고 능력 없이 다른 뇌 영역의 transcriptional 프로필 많은 종류의 세포는 알 수 없는 및 undecipherable 믹스 것입니다. LCM 메서드를 사용 하 여 뇌 손상 연구에서 주도하 고 있다 현재 노력 두뇌 지역 특정 생체 윤곽을 그리 다 하 고 어떻게 그들이 TBI의 생체 순환 연관 이해 하.

포유류 두뇌는 너무나 복잡 하 고 셀 유형1의 수천 수백와 함께 이종. 실제로, 인간 연구를 담당, 등의 지역에서 구조 그리고 백색과 회색 문제에 기능적인 차이 고 분기 transcriptional 프로필2에 반영 됩니다. 두뇌가 유전자 표현 데이터를 해석 하는 주요 장애물이 되었습니다와 뇌 손상의 필드. 전 임상 연구에서이 모호성 이후 수백 뇌 부상3에 대 한 치료의 실패 한 임상 시험을 주도하 고 있다.
레이저 캡처 기정 (LCM) 메서드를 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)를 공부 하는 우리-유전자는 쥐 두뇌4, 해 마, 학습 및 메모리5필수적인 뇌 영역에 초점을 맞추고 dysregulation를 유도. 레이저 캡처 모두 죽어가 고 살아남는 신경 세포에 유전자 발현을 분석 하는 기능 TBI6후 결과 (신경 생존) 결정 유전자 발현에서 stochasticity의 역할의 이해를 제공 합니다. LCM 기술은 또한 젊고 노화 생쥐7 또는 쥐8비교할 때 hippocampal 신경에 TBI의 효과 탐험 하는 데 유용 입증 했습니다.
최근 연구에서 우리는 쥐와 인간의 TBI 환자 TBI comorbidities; 고 집행 기능 (즉, 담당9)와 관련 된 분야에 초점을 맞춘 TBI에 의해 부정적인 영향을 쥐 두뇌의 다른 지역 검사 이러한 comorbidities 우울증(예: 핵 accumbens10) 등 circadian 리듬 장애 (suprachiasmatic 핵11). 이전 연구, Huusko 및 Pitkanen12 , Drexel 외. 13 시상과 시상 하 부에 유전자 발현 검사 LCM을 사용. 우리의 학문이 이전 관측을 근간 하 고 4 개의 다른 뇌 영역을 포함. TBI 후 유도 지역별 분자 변화 연구, 식별 하 고 LCM 시스템을 사용 하 여이 영역에서 셀 형식을 취득 전문 지식을 얻을 하는 데 필요한 했다. UV-절단 및 적외선 (IR) 레이저 원하는 뇌 영역의 정확한 서 하실 수 있습니다. 여기, 우리가 어떻게 식별 하 고 차동 실험 유체 타악기 뇌 부상 방법에 의해 영향을 받는 캡처 4 쥐 뇌 영역 레이저 쥐 뇌 아틀라스14, stereotaxic 좌표에 의해 유도이 LCM 시스템 사용 설명 4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsure LCM caps</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0211/LCM0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (Histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
			<td>UTMB Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous Micro- Kit</td>
			<td>Life Technologies (Ambion)</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96 System</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

관심의 특정 뇌 영역을 분리 하는 능력은 그들의 공간 분포를 보존 하지 않는 조직 분열 기법에서에 장애가 될 수 있습니다. 과정 자체 개별 셀에 식 패턴을 변경할 수 있기 때문에 이러한 기술 또한 잠재적으로 유전자 표정 분석을 왜곡. 여기는 수정된 Nissl (cresyl 바이올렛) 얼룩 프로토콜 및 쥐 뇌 아틀라스의 지도 사용 하 여 외상 성 뇌 손상 (TBI)에 의해 영향을 하는 특정 뇌 영역을 선택적으로 수집 하는 레이저 캡처 기정 (LCM) 방법에 설명 합니다. LCM 뇌 영역 그들의 기본 위치와 신분의 각 특정 지역에 대 한 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 기능에 액세스할 수 있습니다. 이 위해, LCM 이전 TBI에 두뇌 지역 특정 유전자 발현 검사에 사용 되었습니다. 이 의정서는 같은 동물 내에서 뚜렷한 뇌 영역에 유전자와 예측에 관한 식에서 TBI 유도 변경의 시험을 허용 한다. 이 프로토콜의 원칙 개정 고 다른 질병 및 동물 모델에서 게놈 식 조사 연구의 넓은 범위에 적용 될 수 있습니다.

그림 1 에서 제시 하는 회로도 특정 뇌 영역 및 잠재적인 다운스트림 분석 응용 프로그램의 인도 아틀라스 LCM의 전체 워크플로 보여 줍니다. 이 연구는 TBI 이상 comorbidities의 개발 하 고 관련 4 개의 두뇌 영역에 초점을 맞춘: FrA, AcbC, SCN, 그리고 Hp. 특정 뇌 영역의 한계 LCM에는 해 부 위치 그림 2 (A, D, G, J)에서 볼 수 있듯이 정의 된 경계의 부족에 의해 가려진 자주는 이다. 단면 안내 및 특정 지역의 캡처 레이저 뇌 아틀라스의 사용 대상 이외의 뇌 영역 샘플 오염의 가능성을 감소 시킨다. 주의 단면 중 고 Nissl 염색 후 조직 랜드마크를 따라 때 LCM 기술은 세포, 핵, 또는 지역15의 개별 인구를 인수 하는 높게 일관 된 수단을 제공할 수 있습니다. 이러한 연구의 장기 목표 유전자와 microRNAs 대리,으로 잠재적으로 사용할 수 있는 비-침략 적 생체 두뇌 지역 특정 상해의 식별 하는. 이 바이오 마커 개발 파이프라인의 첫 단계 실험 TBI 후 조직의 특정 transcriptional 변화의 특성 이다. 이러한 데이터는 biofluids 순환에서 부상 유발 변경 다음 상관 수 있습니다.
제시 절차 통해 양적 실시간 PCR (RT-정량) 전에 총 LCM RNA의 반전 녹음 방송 RNA 분석을 허용 하기 위하여 RNA 저하의 위험을 줄이기 위해 최적화 되었다. (를 포함 하 여 크고 작은 RNA 종) 총 RNA 격리 된 개별 뇌 영역에서 레이저 캡처 했다 조직에 열 기반 격리 방법을 사용 하 여 했다. 격리 절차 후 RNA 무결성, 품질 및 수량 평가, RNA 샘플 짧게 70 ° C에서 변성 되었고 RNA 분석기에서 실행. 질적 측정 포함 18 및 28s rRNA 밴드 (그림 3), 전반적인 저하의 대표 될 수 있는의 피크 진폭을 분석 하 고 번호를 사용 하는 "RNA 무결성" (린). 경우 주의 RNase 무료 기술을 사용 하 여, RNA 격리 LCM 샘플에서 일반적으로 6-8에서 신장에 결과. 더 낮은 린 RNA 품질을 암시 할 수 있다 하 고 잠재적으로 유전자와 예측에 관한 식 분석의 정확성을 줄일 수 있습니다. 반대로, 높은 린 RNA 분석에서 생성 된 결과의 타당성에 신뢰를 높일 수 있습니다.
실시간 정량 Pcr 뇌관/프로브 세트를 사용 하 여 개별 유전자와 microRNAs (그림 4)에 대 한 수행 했습니다. 약 1 ng 총 RNA의 cDNA에 리버스 변하게 되었고 미리 증폭 정량 제조 업체의 프로토콜에 따라 수행 하기 전에. 상해 관련 유전자 연구에서 평가 포함 BCL2 연결 X, Apoptosis 레 귤 레이 터 (Bax), B-세포 CLL/림프 종 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related 시스테인 Peptidase (Casp3) 두뇌 파생 된 Neurotrophic 요인 (Bdnf), 그리고 캠프 응답 요소 단백질 1을 묶는 (Creb). 미르-15b 개별 죽어가는 신경 세포에 실험 TBI 후 변경할 표시 되었습니다 때문에 선정 되었다. 그것은 또한 있다 실험적으로 유효성을 검사 하 고 bioinformatically 유전자 대상 프로 생존 기능 (게시 되지 않은 데이터)를 예측 했다. 정규화 된 배-변경 비율 TBI 동물 및 내 인 성 유전자 (Gapdh) 또는 작은 RNA (U6), 정규화 순진한 컨트롤에서 유전자와 예측에 관한 식 레벨을 각각 비교 하는 ΔΔCt 방법에 의해 계산 되었다. 1 위의 배 변경 해당 유전자 또는 예측에 관한, 전반적인 upregulation 나타내고 반대로, 겹 변경 1 나타냅니다는 downregulation 보다 낮은. 통계 분석이 보여주었다 중대 한 변화 TBI와 순진한 제어 (p ≤ 0.05) 유전자 발현에 뇌 영역을 의존 했다. 미르-15b 식에 중요 한 변경 TBI와 순진한 제어 감지 했다 하지만 뇌 영역 종속 패션에 높고 낮은 식으로 동향. 이러한 데이터는 추가 최적화는 예측에 관한 식에서 변화를 평가 하는 데 필요한 것이 좋습니다. 그것은 또한 가능한 샘플 크기는 너무 작아서 식에서 고유의 가변성 때문에 통계적 의미를 얻을 수입니다. 미래 연구는 그 유전자를 위해 운영 하는 가짜 동물 포함 됩니다 그리고 예측에 관한 식 변화는 TBI 하 고 수술 준비 때문.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 다운스트림 게놈 분석에 대 한 아틀라스 기반 LCM의 워크플로. (A-F) 다운스트림 정량 분석에서 동물 준비 절차: (A) 성인, 남성 Sprague Dawley 쥐 (나이 및 무게 300 g ~ 6 주) 취, 유체 타악기 TBI, 대상이 고 부상 후 24 h를 고통 없이 안락사. (B) 직렬 섹션 (30 µ m) 신선한 냉동된 두뇌의 기반으로하 Paxinos와 왓슨의 쥐 두뇌 아틀라스에서 특정 뇌 영역 (FrA, AcbC, Hp, SCN)의 좌표. (C) 섹션은 고정, Nissl 스테인드 (1 %Cresyl 바이올렛), 탈수, 건조 공기. (D). LCM에 LCM 시스템 뇌 영역을 식별. (E) LCM 매크로 모자는 RNase 무료 0.5 mL 튜브 세포 세포의 용 해 버퍼의 100 μ에 전송 하 고 RNA 격리 다운스트림 게놈 분석까지-80 ° C에 저장. RNA 다음 TBI 후 또는 관심 (F)의 두뇌 지구 사이 분자 별로의 차동 식 검사 유전자 또는 예측에 관한 실시간 정량 분석을 위한 역 복사할 수 있습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
그림 2입니다. LCM TBI의 영향을 받는 뇌 영역. 조직 단면도의 수집 동측 측에서 IR와 UV 부상 사이트의 대표 이미지 레이저 LCM 시스템에 (A-나). 조직은 cryostat (30 µ m)에 구분 되었고 펜 막 슬라이드에 수집. 섹션 다음 고정, Nissl-물 들일 cresyl 바이올렛 (1%), 그리고 해부학 적 랜드마크 Paxinos와 왓슨의 The 쥐 뇌 아틀라스에서 참조에 따라 특정 뇌 영역을 식별 하는 탈수. (A-C) 정면 연결 피 질 (GrDG)가 뇌의과 립 층의 완전히 형성된 뿔 옆에 있는 해 마 (Hp)의 CA1, CA2, CA3 피라미드 계층의 구성 요소 (FrA) (D-F) 의 영역. (G-나) 핵 accumbens 공동의 영역(AcbC) 다시 인접 하 고 rostral 전방 commissure (aca). (J-K) 핵 Suprachiasmatic (SCN) rostral supraoptic chiasm (그리고). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
그림 3입니다. RNA 품질의 대표 검사. 대표 electropherograms와 LCM에서 파생 하는 RNA의 관련된 젤 이미지 수집 조직 (A-D). Electropherograms 및 관련된 젤 이미지 그대로 RNA 18s와 28s rRNA 봉우리와 젤 밴드의 모습에 따라 표시 됩니다. 이 RNA는 모든 게놈을 포함 하 여 다운스트림 응용 프로그램 및 proteomic 분석에 적합 합니다. (A) 전 협회 피 (FrA) RNA 6.1 린입니다. (B) 년 해 마 (Hp) RNA 4.4 린입니다. (C) 핵 accumbens 코어 (AcbC) RNA. 7.3 린입니다. (D) Suprachiasmatic 핵 (SCN) RNA 린 7.6입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 두뇌 지역 특정 유전자와 예측에 관한 식을 통해 RT-정량의 다운스트림 분석. 관심 (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb)의 유전자와 관심 (미르-15b)의 예측에 관한 개별 실시간 정량 TBI 후 레이저 캡처 두뇌 지역에서 수행 되었다 (Hp와 AcbC n = 5, FrA n = 4) 손상 되지 않은 순진한 동물에 비해 (n = 4). Hp, AcbC, FCx. 데이터 정규화 된 배 변경 비율 순진한 제어 뇌 영역에 비해 서 제시는 TBI 병 인에 관련 된 유전자의 분석 수행 했다 (웰 치의 보정 ± SEM;와 짝이 없는 t 테스트 * p ≤ 0.05) (A). 서로 다른 뇌 영역에 미르-15b의 차동 식 순진한 제어 (± SEM)에 비해 표준화 된 배 변경으로 제공 됩니다 (B). SCN에서 데이터 (n = 2) 포함 되지 않습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K 조회수.  University of Texas Medical Branch. 우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.

비디오: Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

측면 유체 타악기 : 마우스의 외상성 뇌 손상 모델

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

총 RNA의 분리 및 다운 스트림 차세대 시퀀싱 및 유전자 발현 프로 파일링에 대한 개별 마우스 뇌 영역의 Microdissection 아닌 레이저 캡처 현미경 접근법

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

외상성 뇌 손상 후 뉴런 또는 유전자 발현 분석을위한 단일 뉴런의 강화 인구의 레이저 캡처 Microdissection

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

모델을 새로운 시험관에 폭발 외상 성 뇌 손상의

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

가압된 설치류에 폭발을 이용한 Neurotrauma의 효과 중간 대뇌 동맥

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...