Elizabeth Sumner bu el yazması düzenleme onun yardımını kabul etmek istiyoruz. Bu proje için finansman kısmen Moody Project tarafından translasyonel travmatik beyin hasarı araştırma ve RO1NS052532 için HLH için sağlandı.

Not: Bütün hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Texas Tıp Şubesi, Galveston, Texas Üniversitesi tarafından Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri tarafından bakımı ve kullanımı için yönetmen olarak onaylanır Laboratuvar hayvanlarının (8 Edition, Ulusal Araştırma Konseyi).
 1. doku toplanması, bölge kimliği ve Sectioning <ol><li>Konu yetişkin, erkek, Sprague-Dawley Rat, yaklaşık altı haftalık ve 250-300 g, deneysel sıvı perküsyon yaralanma, Shimamura ve ark içinde açıklandığı gibi. 4.</li> <li>24 saat sonra deneysel Tby, insanca ötenazi hayvanlar bir isoflurane konsantrasyon derin anestezi kadar % 4 ile bir odaya yerleştirerek. Ölüm tarafından işten çıkarma sağlamak, beyin tüketim ve hemen toz kuru buzun içinde dondurma. -80 ° C dondurucu beyinlerinde kesit kadar donmuş mağaza.</li>
	<li>Önceden transkripsiyon analizi, içerir LCM yordami için kirlenme ve RNA bozulması riskini azaltmak için deterjan ortadan kaldırarak RNase ile tüm yüzeyler temiz. 
	Not: Bu temizliğin, nerede doku kesitli, cryostat boyama için kullanılan alan ve LCM aygıt çevresini içerir.</li>
	<li>Beyin dokusu içine bir cryostat-20-soğutmalı Muhafazası ve yer almak ° c ~ 10 dakika süreyle cryostat Oda sıcaklığı için equilibrate için izin ver beyin</li>
	<li>Cryostat sahne üzerine gazlı bez sayfadaki kadar beyin ventral yanına koyun. Bir temiz, RNase free tıraş bıçağı ile arka bölümü için beyincik sadece rostral kesmek (kaydedilen atılır veya) ve optik hemisferlerine (och) anterior bölümü.</li>
	<li>En uygun kesme sıcaklık (OCT) orta küçük bir miktar iki ayrı cryomolds yerleştirin. (Ön Birliği korteks (FrA) ve nucleus accumbens çekirdek (AcbC) cryomolds ön tarafı aşağı içeren) beyin yerleştirin. Doku karşılamak için yeterli OCT orta ekleyin.
	<ol><li>Beyin dokusu Hipokampus (Hp) ve suprachiasmatic çekirdeği (SCN) içeren bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Tamamen cryostat ~ 20 min için dondurmak OCT orta izin.</li>
	</ol></li> <li>Bu doku ve OCT orta tamamen donmuş bir kez küçük bir miktar, Ekim bir montaj kafa sıkmak ve montaj baş üzerine doku içeren dondurulmuş cryomolds tuşuna basın. OKT'yi şekilde tamamen dondurma doku içeren kalıp başından sıkıca takılı izin.</li>
	<li>Baş ek parça montaj için güvenli ve vidasını sıkın. Cryostat bıçak ile ilgili olarak kesme açısı bölümleri kesilir eşit emin olmak için ayarlama kolları ile ayarlamak.</li>
	<li>Bölüm kalınlığı 30 µm için ayarlayın. FrA ve AcbC içeren doku blok kesit, ilk beyin korteksi belirgin olana kesit ve sonra başlangıç toplama başlar.</li>
	Yavaşça oda sıcaklığında polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar kesitli doku üstüne FrA için ikincil motor korteks (M2 kadar yanında duvar ilanı başvuru sıçan beyin Atlas 12, bölüm ve toplamak beyin <li>bölümleri ) Bregma 5,16 mm ulaştı.
	<ol><li>Görsel olarak bağlılık doku ve OCT tamamen slayt erimiş Eğer inceleyerek slayt sağlamak. Boyama kadar cryostat doku bölümleri ile tüm slaytları depolama.</li>
	</ol></li> <li>Kadar anterior komissür (aca) görünür hale gelir ve Bregma 1,80 mm şimdi belirgin lateral ventrikül (LV) altında bir tam komissür içine birleştiren kesit devam.</li>
	<li>Toplama simgeler LVs kadar aca Bregma yönü ile bağlanmak için 0.84 mm.</li>
	<li>FrA ve AcbC için kesit tamamlandıktan sonra bağlı doku blok kaldırmak ve HP ve SCN (sahne) içeren blok ile değiştirin.</li>
	<li>Üçüncü ventrikül (3V) belirgin hale geldiğinde och-0.48 mm, Bregma düzleştirilir kadar bölüm.</li>
	<li>Toplamak bölümleri için bu noktadan Bregma kadar-0.72 supraoptic decussation (sox) başladığında mm, SCN (sahne). 
	Not: SCN kolayca üzerinden geçti gibi daha fazla doku bölümleri och boyunca toplamak gerekli olabilir.</li>
	<li>HP koleksiyonu için granül hücre boynuzları dentat gyrus (GrDG) katman kadar bölüm Bregma gözle görülür belirgin-3.00 mm.</li>
	<li>Toplamak bölümleri Hipokampal CA alt alanlar Bregma, koronal bölümlerde erimiş kadar-4.78 mm. Hippocampus kranyotomi ve yaralanma sitesi altında tam koleksiyonu bu ayrıntı sağlar. 
	Not: Bu Laboratuarı'ndan önceki yayınlarda gösterildiği şekilde en yaralı hücre aralığı içinde belli olacak ve gen veya mikroRNA ifade analizi için uygun.</li>
</ol> 2. İletişim kuralı boyama <ol><li>rahip için boyama, yıkama tüm dishware ve kimyasal duman kukuIeta RNase ortadan kaldırarak deterjan ile boyama alanında. Bu hazırlık açığının RNA bozulması nedeniyle kirlenme riski.</li>
	<li>Tüm boyama reaktifler ve nükleaz çözümlerinde ücretsiz su hazırlayın.</li>
	<li>Bir raf cryostat ve duman hood yerde saklanan slayt al. Slaytlar için 30 s. yer onları (nükleaz boş su ile hazırlanmış) çözümleri aşağıdaki gibi boyama içine ısıtmak izin: 1 dk, nükleaz ücretsiz için alkol % 75 su 1 dk, %1 Kresil mor 1 dk, nükleaz boş su 30 s, nükleaz boş su 30 s , % 95 alkol 30 s, %100 30 s, 3 dk Ksilen ve Ksilen 3 dakika süreyle alkol</li>
	<li>Raf duman başlıklı oda sıcaklığında en fazla 10 dakika kurumasını sağlar. Alternatif olarak, daha hızlı kurutma için raflar Rnase free vakum desiccator içine yerleştirin. Kurutulmuş sonra hemen LCM için devam.</li>
</ol> 3. Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon OKEK sistemi ile <ol><li>RNA analizi için herhangi bir LCM yordama başlamadan önce toplama alanı ve cihazın RNase ortadan kaldırarak deterjan ve % 100 ile çevresini aşağı silin alkol.</li>
	<li>Mikroskobunun temel açmadan önce birim oluşturma IR lazer üzerinde güç anahtarı çevirmek ve bilgisayar yazılımı--dan okul sırası başlamadan başlatmak sistem izin. 
	Not: Eğer bu sırada tamamlanmadı, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı mikroskop tanımaz.</li>
	<li>Yazılım çizme ve onun başlatma adımları çalıştırmak sonra Ready &#34; mevcut sahne &#34; düğme içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı &#34; kurulum paneli. &#34; modüler sahne nerede OKEK makro kapaklar ve slaytlar yüklenebilir ve Afganların pozisyona hareket edecek.</li>
	<li>Yer kalem membran slaytlar içine (en çok üç teker) sahipleri ile buzlu cam kenarına Droitisation karşı karşıya. 
	Not: sahibi yanlış yönde koymuş gerekir yazılım düzgün istenen IR veya UV kesim alanını tanımak mümkün olmayabilir.</li>
	<li>Tıklama &#34; Mem &#34; onay kutusu &#34; kap ve slayt alanını işleme &#34; ilgili slayt (örneğin, A, B veya C) yanında. Bu adım slayt bir membran cam slayt olup olmadığını gösterir. Sonra ilk yakalanması için istediğiniz slaytta'ı tıklatın.</li>
	<li>Doku konumu için döşenmiş bir resmi alıp kap yerleşimler, kullandığı yöndür kamera yapmak seçin &#34; görüntü &#34; araç çubuğu ve seçin &#34; edinme genel bakış. &#34; 
	Not: toplanmakta doku ile tanıdık bir kullanıcıysa, bu adımı konumlandırmak için el ile kaydırma topu kullanarak atlanabilir &#34; Bölge Merkezi &#34; koleksiyonu için.</li>
	<li>Alan Çinili görüntü (veya kiremitli görüntü olmadan göreli konumu) üzerine imleci getirin, sağ tıklatın ve seçin &#34; yer kap, Bölge Merkezi. &#34; yazılım otomatik olarak bir kap üzerinde Seçili pozisyon koyacağını.</li>
	<li>Bir yerde seçin. 
	Not: IR laser düzgün uyumlu ve sadece alanları nerede noktalar yazılım tarafından koyulur almak emin olmak için bu devam etmeden önce yer almalıdır.
	<ol>
		<li>Hiçbir doku mevcut nerede bir kap içinde alana taşıyın. Tıklatın &#34; ben &#34; içinde &#34; Microdissect Araçlar bölmesinde &#34; basıp &#34; kızılötesi bulun &#34; sekmesini. Bölmesinden bir IR testi nerede IR lazer ateş ediyor ve nokta boyutunu değerlendirmek için çekim yangın.</li>
		<li>İmleç, doğru tıkırtı IR ortasında nokta ve seçme &#34; yer alan IR Spot. &#34; 
		Not: Boyut ve IR ışın yoğunluğunu el ile değiştirerek değiştirilebilir &#34; güç, çapı veya süresi &#34; altında her nokta boyutu göstergesi veya değişken ölçek iletişim kutusunun altındaki hareket ettirerek. Birkaç test fotoğrafları uygun nokta boyutu sağlamak için ateş gerekir. IR lazer kap değişiklikleri veya slayt konumunu açık her zaman yeniden yer almalıdır.</li>
		<li>İçin UV kesme, UV lazer seçerek bulun &#34; UV bulun &#34; iletişim kutusunda sekmesini. 
		Not: çünkü UV lazer ve IR lazer büyük bir uyum içinde hareket, sürekli UV lazer konumu değişti her zaman yeniden bulmak için gerek yoktur.</li>
	</ol></li> <li>Seç &#34; serbest el çiziminin &#34; içinde seçenek &#34; Araçlar bölmesinde seçin &#34;. Bir dokunmatik ekran kalemi kullanarak, dokunmatik ekran ve stylus baş arasında temas kaybetmemek emin yaparken ilgi bölgesinin çevresini çizin. Başlangıcı ve endpoints birbirine bağlamak emin olun. 
	Not: IR noktalar otomatik olarak yazılım aracılığıyla belirtilen ama kullanıcı aşağı ek noktalar doku UV kesme gerçekleştirildikten sonra kap yapıştırılır sağlamak için koymak tercih edebilirsiniz.</li>
	<li>İçin FrA koleksiyonu, gerçekleştirmek ne zaman Bregma 5,16 mm M2 korteks görünür kadar kortikal doku brüt lazer yakalanması. 
	Not: FrA veya belirli hücre tipleri yalnızca belirli bölümlerine toplanır öyle ki bu ayrıntı tadil.</li>
	<li>İçin AcbC koleksiyon, bir alanını kapatmak aca bir mesafede lazer yakalama. 
	AcbC bir kabuk ve çekirdek farklı işlevleri yerine ve fizyolojik olarak benzersizdir. Böylece mümkün olduğunca yakın olarak beyin atlas izlemeniz önemlidir. Bu geçmiş bregma 0,84 mm, iki daha fazla toplamak için tavsiye edilir Milletlere de birbirleri ile yakından ilişkili olmak.</li>
	<li>Hp için koleksiyon, lazer yakalama CA 1 Bregma 3.00 mm başlayan ve tamamen kurulan GrDG morfolojik tanımlama için fiziksel bir dönüm noktası kullanarak 2 ve 3 Hipokampal alt alanlar. 
	Not: Bu çalışmanın amacı gereği,-4.78 mm, hangi görsel olarak noktası olarak demarcated zaman Hp alt dallar erimiş ve ventrally gelin Bregma toplamıyoruz. Bu alanda en yaralı olarak sinir hücreleri doğrudan yaralanma sitesi 6 altında keşfedilen seçildi.</li>
	<li>SCN koleksiyonu için görsel olarak och dorsal oturup sonra toplamak yoğun paketlenmiş çekirdeklerin tanımlar.</li>
	<li>(Yukarıda listelenen) bölgesi koleksiyonu sonra OKEK makro kapaklar için hareket &#34; QC pozisyon &#34; ve UV kesip doku görsel olarak sağlayarak tam doku uyumu membran için bağlı olduğu için denetleme. Hızlı bir şekilde yer kap ontoan 100 µL hücre lizis arabelleği içeren RNase free 0.5 mL ince duvarlı tepki tüp.</li>
	<li>Kısaca tam lizis sağlamak ve-80 ° C'de depolamak için girdap örnekleri Bu noktada, LCM durdu ve örnekleri depolanan aşağı akım genom analizi 6 için kullanana kadar.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+gene+networks+to+brain+networks.">From gene networks to brain networks.</a> Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).</li><li>Mills, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+transcriptome+patterns+of+the+white+and+grey+matter+corroborate+structural+and+functional+heterogeneity+in+the+human+frontal+lobe.">Unique transcriptome patterns of the white and grey matter corroborate structural and functional heterogeneity in the human frontal lobe.</a> PLoS One. 8 (10), e78480 (2013).</li><li>Doppenberg, E. M., Choi, S. C., Bullock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+in+traumatic+brain+injury:+lessons+for+the+future.">Clinical trials in traumatic brain injury: lessons for the future.</a> J Neurosurg Anesthesiol. 16 (1), 87-94 (2004).</li><li>Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+analysis+of+amplified+antisense+RNA+from+distinct+cell+populations+of+the+young+and+aged+rat+brain:+effect+of+traumatic+brain+injury+on+hippocampal+gene+expression.">Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression.</a> Mol Brain Res. 122 (1), 47-61 (2004).</li><li>Bast, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+integrative+perspective+on+hippocampal+function:+from+the+rapid+encoding+of+experience+to+adaptive+behavior.">Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior.</a> Rev Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).</li><li>Rojo, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stochastic+gene+expression+on+the+cell+survival+rheostat+after+traumatic+brain+injury.">Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 6 (8), e23111 (2011).</li><li>Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+age-specific+responses+to+traumatic+brain+injury+in+mice.">Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice.</a> Exp Gerontol. 41 (11), 1201-1205 (2006).</li><li>Shearer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+fluctuations+in+gene+expression+in+aging+hippocampal+neurons+could+be+exacerbated+by+traumatic+brain+injury.">Stochastic fluctuations in gene expression in aging hippocampal neurons could be exacerbated by traumatic brain injury.</a> Aging Clin.Exp.Res. 28 (2), 363-367 (2015).</li><li>Caeyenberghs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+structural+networks+and+executive+deficits+in+traumatic+brain+injury+patients.">Altered structural networks and executive deficits in traumatic brain injury patients.</a> Brain Struct.Funct. 219 (1), 193-209 (2014).</li><li>Bewernick, B. H., Kayser, S., Sturm, V., Schlaepfer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+nucleus+accumbens+deep+brain+stimulation+in+treatment-resistant+depression:+evidence+for+sustained+efficacy.">Long-term effects of nucleus accumbens deep brain stimulation in treatment-resistant depression: evidence for sustained efficacy.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (9), 1975-1985 (2012).</li><li>Karatsoreos, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Circadian+Disruption+on+Mental+and+Physical+Health.">Effects of Circadian Disruption on Mental and Physical Health.</a> Curr.Neurol.Neurosci Rep. 12 (2), 218-225 (2012).</li><li>Drexel, M., Puhakka, N., Kirchmair, E., H&#246;rtnagl, H., Pitk&#228;nen, A., Sperk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GABA+receptor+subunits+in+the+hippocampus+and+thalamus+after+experimental+traumatic+brain+injury.">Expression of GABA receptor subunits in the hippocampus and thalamus after experimental traumatic brain injury.</a> Neuropharmacology. 88, 122-133 (2015).</li><li>Huusko, N., Pitkanen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin+immunoreactivity+and+expression+of+GABAA+receptor+subunits+in+the+thalamus+after+experimental+TBI.">Parvalbumin immunoreactivity and expression of GABAA receptor subunits in the thalamus after experimental TBI.</a> Neuroscience. 267, 30-45 (2014).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-7 (2012).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+analysis+reveals+common+pro-survival+mechanisms+of+metyrapone+and+carbenoxolone+after+traumatic+brain+injury.">Pathway analysis reveals common pro-survival mechanisms of metyrapone and carbenoxolone after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 8 (1), e53230 (2013).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-focused+PCR+array+profiling+of+enriched+populations+of+laser+capture+microdissected+hippocampal+cells+after+traumatic+brain+injury.">Pathway-focused PCR array profiling of enriched populations of laser capture microdissected hippocampal cells after traumatic brain injury.</a> PLoS.One. 10 (5), e0127287 (2015).</li><li>Boone, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury-induced+Dysregulation+of+the+Circadian+Clock.">Traumatic Brain Injury-induced Dysregulation of the Circadian Clock.</a> PLoS.One. 7 (10), e46204 (2012).</li><li>Truettner, J. S., Motti, D., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+overexpression+increases+cortical+neuronal+vulnerability+to+injury.">MicroRNA overexpression increases cortical neuronal vulnerability to injury.</a> Brain Res. 1533, 122-130 (2013).</li><li>Hellmich, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+hypotension+suppress+neuroprotective+gene+expression+in+injured+hippocampal+neurons.">Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons.</a> Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).</li><li>Ginsberg, S. D., Alldred, M. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+CA1+pyramidal+neuron+and+regional+hippocampal+dissections+in+Alzheimer's+disease.">Gene expression levels assessed by CA1 pyramidal neuron and regional hippocampal dissections in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol.Dis. 45 (1), 99-107 (2012).</li><li>Elstner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson's+disease+and+aging+links+transcriptional+dysregulation+of+energy+metabolism+to+cell+death.">Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death.</a> Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+tissue+preparation+for+laser+capture+microdissection:+application+for+cell+type-specific+miRNA+expression+profiling+in+colorectal+tumors.">Improvement of tissue preparation for laser capture microdissection: application for cell type-specific miRNA expression profiling in colorectal tumors.</a> BMC.Genomics. 11, 163 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Memeli beyin moleküler çalışmalar için bir temel tekniği LCM haline gelmiştir. Bu makalede, IR ve UV kesme lazerler LCM sisteminde kullanarak herhangi bir memeli beyin bölgesinin genomik değişiklikleri yakalayabilir gösterilir. Bu bölgeler dahil olanlar Kresil mor veya Hematoksilen Eozin gibi geleneksel LCM uyumlu lekeleri ile tanımlanabilir. Sadece hücre örnekleri yeterli miktarda elde etmek için aynı zamanda RNA tüm tip-in aşağı akım için uygun bir kalite LCM örneklerinden izole etmek için lazer-yakalama işlemi ve yeteneği daha kalın 30 µm bölümlerinde kalem membran slaytlarda LCM gerçekleştirmek için hızını sağlar Genom analizi; Bu analizler microarrays16, PCR diziler17ve nicel gerçek zamanlı PCR18içerir.
Bizim veri LCM doku kullanmak çalışmaları için bir gerekçe sağlamak. Biz o miR-15b upregulated Hipokampus ve korteks (şekil 4) ama downregulated nucleus accumbens içinde ve fark Tby beyindeki etkileri anlayış biyolojik olarak uygun olmayabilir bulabilirsiniz. Bir önceki çalışma artar'nı kortikal nöronal yaralanma için olumsuz yanlısı hayatta kalma genler, Bcl-219gibi düzenleyen birkaç miRNAs overexpression sonucu önerdi. Hedef tarama analizi gösterir Bcl-2 de miR-15b tarafından düzenlenmiş; Böylece, mekanik bir açıklama neden bizim verileri göstermektedir beynin belirli bölgeler (yani, FCx) Tby için seçmeli olarak etkilenebilir. Çoğu genlerin birden çok miRNAs tarafından düzenlenir ve belirli hedef gen için herhangi bir miRNA değişiklikler birleştiriliyor zordur hatırlamak önemlidir. Ayrıca, bu verileri mikroRNA ve gen ifadesinde bazı değişiklikler bölgeye özgü beyin hasarı biyolojik kullanılabileceğini belirtmek. Nitekim, şu anda bu veri çalışmalarda kullanıyor nasıl yeni nöroprotektif uyuşturucu bileşikler antidepresan özellikleri ile differentially nöropsikiyatrik bozukluklar için bağlı beyin bölgeleri mikroRNA ve gen ifadesinde etkileyebilir. Bir çalışmamız slayt hazırlama işlemleri LCM için birden çok adımı sırasında RNA bütünlüğü tehlikeye haline kısıtlamasıdır. Bu iletişim kuralı RNA bozulması riskini azaltmak için gerekli adımları açıklar. İstatistik hesaplaması için kullanılan nispeten küçük örnek boyutu başka bir kısıtlamadır. Gelecekte örnek boyutunu artırma çalışmaları, gen ve miRNA ifade çeşitleri bireysel hayvanlar arasında etkilerini azaltmak gerekir.
LCM yararına insan hastalık ve hastalıklı dokuları20,21,22,23hayvan modelleri kullanarak translasyonel genomik çalışmalar gerçekleştirilmektedir. Belirli hücre popülasyonlarının yakalama yeteneği, farklı beyin bölgelerini transkripsiyon profilleri-cekti var olmak pek çok hücre tipleri bilinemez ve undecipherable bir karışımı. LCM yöntemlerle beyin yaralanması çalışmalarda şimdiki çabalar için beyin bölgesi belirli biyolojik betimlemek için ve nasıl onlar Tby biyolojik dolaşan ile ilişkilendirmek anlamaya neden olmuştur.

Son derece karmaşık ve farklı hücre türleri1binlerce yüzlerce ile memeli beynidir. Nitekim, insan çalışmaları frontal korteks gibi bölgelerde yapısal göstermiştir ve işlevsel farklılıklar beyaz ve gri konuda ayrı ve farklı transkripsiyon profilleri2' de yansıtılır. Beyin heterojenite gen ifadesi verileri yorumlamak için büyük bir engel oldu ve beyin hasarı alanında. Bu belirsizlik içinde preklinik çalışmalar daha sonra başarısız olan klinik tedaviler beyin yaralanması3için yüzlerce neden olmuştur.
Travmatik beyin hasarı (TBY) incelemek için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemleri kullanın-gen bozukluk sıçan beyin4hipokampüs, öğrenme ve hafıza5için esastır bir beyin bölgesi odaklanan, indüklenen. Yakalama lazer ve hem ölüyor ve nöronlar hayatta gen ekspresyonu analiz yeteneği bize Tby6' dan sonra stochasticity (nöronal hayatta kalma) sonucu belirlemede gen ifadesinde rolünün daha büyük bir anlayış verir. LCM teknikleri de genç ve atma fareler7'yi veya fareler8karşılaştırırken Hipokampal nöronlar Tby etkilerini keşfetmek için yararlı kanıtlanmış.
Son çalışmalarda, sıçan beyin olumsuz fareler ve yönetim işlevi (Yani frontal korteks9) ve Tby comorbidities ile ilişkili olan insan Tby hastalarda odaklanarak Tby tarafından etkilenen diğer bölgelerinde incelendiğinde; Bu comorbidities depresyon (nucleus accumbens10)numaralar›n› ve sirkadiyen ritim bozuklukları (suprachiasmatic çekirdeği11) içerir. Önceki çalışmalar, Huusko ve Pitkanen12 ve Drexel vd. 13 LCM gen ekspresyonu talamus ve hipotalamus incelemek için kullanılan. Bizim çalışma önceden bu gözlemler oluşturur ve dört diğer beyin bölgeleri içerir. Tby sonra indüklenen bölgeye özgü moleküler değişiklikler çalışmaya, belirlenmesi ve hücre tipleri bir LCM sistemini kullanarak bu bölgelerde elde uzmanlık kazanmak için gerekli. UV-kesme ve kızılötesi (IR) lazerler istenen beyin bölgeleri kesin mikrodiseksiyon için izin. Burada, biz nasıl sıçan beyin atlas14, stereotaksik koordinatları belirlemek ve differentially deneysel sıvı-perküsyon beyin yaralanması yöntemi tarafından etkilenen yakalama dört sıçan beyin bölgeleri lazer rehberliğinde bu LCM sistem kullanım tarif 4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arcturus Laser Capture Microdissection System</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arcturus PEN Membrane Glass Slides&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsure LCM caps</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>LCM0211/LCM0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl Violet Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (Histological grade)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof (Histological grade)</td>
			<td>UTMB Pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous Micro- Kit</td>
			<td>Life Technologies (Ambion)</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Gene Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman microRNA Expression Primer/Probes</td>
			<td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td>
			<td>A25576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightcycler 96 System</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic atlas-guided laser capture microdissection of brain regions affected by traumatic injury

Yeteneğini belirli beyin bölgeleri ilgi izole etmek mekansal dağılımı korumaz doku ayırma teknikleri içinde engellemiştir. Sürecin kendisi ifade desenleri tek tek hücreleri içinde değiştirebilirsiniz çünkü bu tür teknikler da potansiyel gen ifade analizi eğ. Burada seçerek travmatik beyin hasarı (TBY) tarafından değiştirilmiş bir Nisl Protokolü ve sıçan beyin atlas rehberliğinde boyama (Kresil mor) kullanarak etkilenen belirli beyin bölgeleri toplamak için lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yöntemi açıklanmaktadır. LCM beyin bölgelerinde yerel konumlarını ve anatomik yerler belirli her bölgenin kimliği için kullanma yeteneği erişim sağlar. Bu amaçla, LCM daha önce beyin bölgesi belirli bir gen ifadesinde Tby incelemek için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı Tby kaynaklı değişikliklere incelenmesi farklı beyin bölgeleri içinde aynı hayvan gen ve mikroRNA ifadede izin verir. Bu iletişim kuralı prensipleri tadil ve genomik ifade diğer hastalık ve/veya hayvan modelleri inceleyerek çalışmalar geniş bir uygulanır.

Şekil 1 ' de sunulan şematik destekli atlas LCM belirli beyin bölgeleri ve potansiyel aşağı akım çözümleme uygulamaları genel iş akışı gösterilmektedir. Bu çalışma odaklı dört beyin bölgelerinde ilgili Tby patofizyolojisi ve comorbidities gelişimi: FrA, AcbC, SCN (sahne) ve Hp. Bir LCM içinde mevcut belirli beyin bölgeleri anatomik Mekanlar kez tanımlanmış sınırları eksikliği tarafından Şekil 2 (A, D, G, J)görüldüğü gibi gizlenmiş olduğunu kısıtlamasıdır. Bir beyin atlas kesit rehberlik ve yakalama, özel bölgelerin lazer kullanımı beyin bölgeleri dışında hedef ile örnek bulaşma olasılığını azaltır. Bakım kesit sırasında ve sonrasında Nisl boyama doku işaretlerini, izlemeye alınır, LCM teknoloji hücre, hücre çekirdeği veya bölgeleri15ayrı nüfus edinme için son derece tutarlı bir yol sağlar. Genler ve vekil olarak hizmet verebilir mikroRNA'lar beyin bölgesi belirli yaralanma non-invaziv biyolojik tanımlamak için bu çalışmaların uzun vadeli hedefleri vardır. Bu biyomarker geliştirme boru hattı ilk adımda deneysel Tby sonra doku özgü transkripsiyon değişikliklerin karakterizasyonudur. Bu veriler daha sonra biofluids dolaşan yaralanma kaynaklı değişiklikler ile ilişkili olabilir.
Sunulan yordamları RNA analizi nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) önce toplam OKEK RNA'ın ters transkripsiyon yoluyla izin vermek için RNA bozulması riskini azaltmak için optimize. Toplam RNA (küçük ve büyük RNA türler de dahil olmak üzere) bireysel beyin bölgelerden lazer yakalanan doku üzerinde bir sütun tabanlı yalıtım yöntemiyle izole edildi. RNA bütünlüğü, kalite ve miktar yalıtım yordamlar sonra değerlendirmek için RNA örnekleri kısa bir süre 70 ° C'de denatüre ve üzerinde bir RNA Çözümleyicisi'ni çalıştırma. Nitel ölçümleri en yüksek genlikleri 18s ve 28s rRNA gruplarından () genel yıkımı temsilcisi olabilir, hangişekil 3), analiz ve "RNA bütünlük numarasını" (RIN) kullanarak dahil. Eğer dikkatli RNase free teknikleri kullanarak, RNA LCM örnekleri 6-8 arasında RINs sonuçlarında genellikle izole. Daha düşük bir RIN RNA kalitesiz ima ve potansiyel olarak mikroRNA ve gen ifade analizi doğruluğunu azaltabilir. Buna karşılık, daha yüksek bir RIN RNA çözümleme oluşturulan sonuçlar geçerliliğini güven geliştirin olabilir.
RT-qPCR astar/sonda kümeleri kullanarak bireysel genler ve mikroRNA (şekil 4) için gerçekleştirildi. Yaklaşık 1 Toplam RNA'ın ng cDNA ters transkripsiyonu ve qPCR üretici protokole göre gerçekleştirilmesi için önce önceden güçlendirilmiş. Bu çalışmada değerlendirildi yaralanma ile ilgili genler dahil BCL2 ilişkili X, Apoptozis regülatörü (Bax), B-hücre CLL/Lenfoma 2 (Bcl-2), Caspase 3, Apoptosis-Related sistein peptidaz (Casp3) , (Bdnf) Nörotrofik faktör beyin türetilen ve Protein 1 bağlayan kamp duyarlı öğe (Creb). Çünkü bireysel ölen nöronlar içinde deneysel Tby sonra değiştirilecek gösterilmiştir miR-15b seçildi. Ayrıca deneysel olarak geçerliliği ve bioinformatically gen hedefleri yanlısı yaşam fonksiyonları (yayınlanmamış veri) ile tahmin. Normalleştirilmiş kat-değişim oranları sırasıyla Tby hayvanlar ve saf denetimleriyle normalleştirme endojen gen (Gapdh) veya küçük RNA (U6), gen ve mikroRNA ifade düzeylerinin karşılaştırılması ΔΔCt yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu gen veya mikroRNA genel bir upregulation 1 yukarıda bir kat değişiklik gösterir ve bunun tersi olarak, bir kat değiştirmek 1 bir downregülasyon gösterir daha düşük. İstatistiksel analiz önemli değişiklikler Tby ve saf kontrolü (p ≤ 0,05) arasında gen ifadesinde bu beyin bölgesi bağımlı olduğunu gösterdi. Herhangi bir önemli değişiklik miR-15b ifade Tby ve saf denetimleri arasında algılandı, ancak eğilimleri doğru bir beyin bölgesi bağımlı moda yüksek ve düşük ifade edildi. Bu veriler o daha fazla en iyi duruma getirme değişiklikleri mikroRNA ifadesinde değerlendirmek için gerekli olduğunu gösteriyor. Örnek boyutu ifade doğal değişkenlik nedeniyle kısmen istatistiksel anlamlılık kazanmak için çok küçük mümkündür. MikroRNA ifade değişiklikleri Tby ve cerrahi hazırlık nedeniyle değil atfedilen ve gelecekteki çalışmalar o gen emin olmak için sahte ile çalışan hayvanlar yer alacak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Şekil 1. İş akışını, Atlas güdümlü OKEK aşağı akım genom analizi için. (A-F) Hayvan hazırlık yordamlardan aşağı akım qPCR analiz için: (A) yetişkin, erkek Sprague Dawley Rat (~ 6 hafta-in yaş ve 300 gr ağırlığında) anestezi, sıvı perküsyon Tby tabi ve insanca euthanized 24 saat sonra yaralanma. (B) seri bölümlerini (30 µm) taze donmuş beyin Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas belirli beyin bölgeleri (FrA, AcbC, Hp, SCN (sahne)) koordinatlarını temel alır. (C) bölümler sabit, Nisl lekeli (%1 Kresil Menekşe), susuz ve kuru hava. (D). LCM üzerinde gerçekleştirilen bir OKEK sistemiyle beyin bölgeleri tespit. (E) OKEK makro kapaklar RNase free 0.5 mL tüp 100 μL hücre lizis arabelleği ile üzerine transfer ve aşağı akım genomik analiz için RNA izolasyonu kadar-80 ºC depolanır. RNA moleküler hedef Tby sonra ve/veya faiz (F)beyin bölgeleri arasında fark ifade incelemek için gen veya mikroRNA RT-qPCR analizi için ters transkripsiyonu olabilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Şekil 2. Tby OKEK etkilenen beyin bölgeleri. Doku toplanan Ipsilateral taraftan yaralanma sitesi bölümlerini IR ve UV ile temsilcisi görüntüleri lazer LCM sistem işlevleri (A-Ben). Doku bir cryostat (30 µm) kesitli ve kalem membran slaytlar üzerinde toplanır. Bölümler vardı sonra sabit, Nisl Kresil ile Menekşe (% 1) lekeli ve anatomik yerler Paxinos ve Watson'ın sıçan beyin Atlas içinde başvurulan temel alan belirli beyin bölgeleri tanımlamak için susuz. (A-C) Frontal Birliği korteks (FrA) (D-F) bileşenleri dentat gyrus (GrDG) granül tabakası tam biçimli boynuzları yanında bulunan hippocampus (Hp) CA1, CA3 ve CA2 piramit kat alanı. (G-ı) Nucleus accumbens co yüzölçümü(AcbC) yeniden proksimal ve rostral anterior komissür (aca) için. (J-K) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) supraoptic hemisferlerine (och) rostral. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Şekil 3. RNA kalite temsilcisi taranmasını. Temsilcisi electropherograms ve LCM türetilmiş RNA görüntülerini ilişkili jel doku (A-D)toplanan. Electropherograms ve ilişkili jel görüntüleri 18s ve 28s rRNA tepeler ve jel Grup temel sağlam RNA göster. Bu RNA tüm genomik dahil olmak üzere aşağı akım uygulamaları ve proteomik analizleri için uygundur. (A) ön Birliği korteks (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) , (AcbC) RNA Nucleus accumbens çekirdek. RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic çekirdeği (SCN) RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Şekil 4. Aşağı akım analizi beyin bölge-özgül gen ve mikroRNA ifade üzerinden RT-qPCR. Bireysel RT-qPCR genler (Bax, Bcl-2, Bdnf, Casp3, Creb) ilgi ve mikroRNA (miR-15b) ilgi için Tby sonra yakalanan lazer beyin bölgeleri üzerinde gerçekleştirilen (Hp ve AcbC n = 5, FrA n = 4) ve zarar görmemiş naif hayvanlar için karşılaştırıldığında (n = 4). Tby patogenezi ile ilgili genlerin analizi gerçekleştirilen saf kontrol beyin bölgelerine göre normalleştirilmiş kat değişim oranları olarak sunulan Hp, AcbC, FCx. verilerin için (Unpaired t test Welch düzeltme ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). MiR-15b farklı beyin bölgelerindeki farklı ifade (± SEM) saf denetimine göre normalleştirilmiş kat değişiklikler olarak sunulmaktadır (B). SCN verilerden (n = 2) dahil değildir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury at JoVE.com

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

stereotactic-atlas-guided-laser-capture-microdissection-brain-regions

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Görüntüleme.  University of Texas Medical Branch. Lazer yakalama mikrodiseksiyon farklı beyin bölgelerini mikroRNA ve gen analizi için farklı hücre popülasyonlarının örnekleri almak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bu teknik travmatik beyin hasarı sıçan beyin belirli bölgelerinde farklı etkileri bir çalışma sağlar.

Video: Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Nörobilim

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Yanal Akışkan Perküsyon: Travmatik Beyin Hasarı Farelerde Modeli

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Travmatik Beyin Hasarı Sonrası Nöronlar veya gen ekspresyon analizi için Tek Nöron zenginleştirilmiştir Populasyonlarının Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Kültür farklılaştırılmış insan Neuroprogenitor Hücreler Nöronlar Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or between the same cell type in health and disease or following pharmacologic treatments.&#160;In the spinal cord, such preparation from motor neurons, the target of interest in many neurologic and neurodegenerative diseases, is complicated by the fact that motor neurons represent &#60;10% of the total cell population.&#160;Laser capture microdissection (LMD) has been developed to address this problem.&#160;Here, we describe a protocol to quickly recover, freeze, and section mouse spinal cord to avoid RNA damage by endogenous and exogenous RNases, followed by staining with Azure B in 70% ethanol to identify the motor neurons while keeping endogenous RNase inhibited.&#160;LMD is then used to capture the stained neurons directly into guanidine thiocyanate lysis buffer, maintaining RNA integrity.&#160;Standard techniques are used to recover the total RNA and measure its integrity.&#160;This material can then be used for downstream analysis of the transcripts by RNA-seq and qRT-PCR.

High-quality total RNA has been prepared from cell bodies of mouse spinal cord motor neurons by laser capture microdissection after staining spinal cord sections with Azure B in 70% ethanol.&#160;Sufficient RNA (~40-60 ng) is recovered from 3,000-4,000 motor neurons to allow downstream RNA analysis by RNA-seq and qRT-PCR.

Lazer Yakalama Mikroseksiyonu ile Fare Omurilik Motor Nöron Hücre Gövdelerinden Transkriptomik Analiz için RNA Üretimi

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the detonation of explosive devices, however, the mechanisms that underlie the brain damage resulting from blast overpressure exposure are not entirely understood and are believed to be unique to this type of brain injury. Preclinical models are crucial tools that contribute to better understand blast-induced brain injury. A novel in vitro blast TBI model was developed using an open-ended shock tube to simulate real-life open-field blast waves modelled by the Friedlander waveform. C57BL/6N mouse organotypic hippocampal slice cultures were exposed to single shock waves and the development of injury was characterized up to 72 h using propidium iodide, a well-established fluorescent marker of cell damage that only penetrates cells with compromised cellular membranes. Propidium iodide fluorescence was significantly higher in the slices exposed to a blast wave when compared with sham slices throughout the duration of the protocol. The brain tissue injury is very reproducible and proportional to the peak overpressure of the shock wave applied.

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

This paper describes a novel model of primary blast traumatic brain injury. A compressed-air driven shock tube is used to expose in vitro mouse hippocampal slice cultures to a single shock wave. This is a simple and rapid protocol generating a reproducible brain tissue injury with a high throughput.

Patlama travmatik beyin hasarı roman Vitro modeli

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Serebral arterler patlama kaynaklı Neurotrauma etkilerini basınçlı kemirgen orta

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...