우리는 Quinnipiac University의 Keller와 Magie 연구소의 모든 구성원에게 도움이되는 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 특히 Keller Lab에서이 부상 분석법을 개발 한 Barron L. Lincoln II에 감사드립니다. 우리는 또한 LC Keller에게 수여 된 Quinnipiac University of Arts and Science Grant-In-Aid에 감사드립니다.

1. 시약 및 장비 준비 <ol><li> 1x 절개 버퍼 (70 MM NaCl, 5 MM KCl, 0.02 MM CaCl 2 , 20 MM MgCl 2 , 10 MM NaHCO 3 , 115 MM 자당, 5 MM 트레 할 로스, 5 MM HEPES, pH 7.2)를 준비합니다. </li><li> 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)을 준비하십시오. </li><li> 0.01 % Triton X-100 1x PBS를 사용하여 1x PBT를 준비하십시오. </li><li> 과일 주스 한천 접시를 준비하십시오. 14, 간단히, H 2 O 압력솥 700 mL에 30g의 아가를 섞는다. 메틸 파라벤 0.5 g을 에탄올 10 mL에 녹이고 과즙 (포도 또는 사과) 300 mL에 넣는다. 농축 물을 고압 가압 멸균 한천 용액에 섞고 10mm x 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 부으십시오. 참고 : 포도 한천 전원 premix는 여러 회사에서 구입할 수도 있습니다 ( 재료 표 참조). </li><li> 유충을 기계적으로 손상시키는 크기 5 포셉을 얻습니다. </li><li> 표준 Drosophila CO 2를 사용하십시오. </sub&gt; 기반 마취 장치. </li></ol> 2. Drosophila Larvae의 선택 <ol><li> 25 ° C에서 배양 한 방랑하는 제 3 기성 유충이 들어있는 약병 또는 병에 넣은 Drosophila 를 가져갑니다. </li><li> 외관에 따라 10 개의 개별 2 번째 또는 3 번째 체아 유충을 선택하십시오. 제 3 기 애벌레는 앞쪽에 분지 된 기둥 모양으로 나타나며, 제 2 기 애벌레는 작아지고 클럽 모양의 앞쪽에있는 기둥이 더 많습니다. 참고 : 애벌레 단계도 타이밍에 따라 식별 할 수 있습니다. 25 ℃에서 부화 후 약 2 시간 후 두 번째 유충이 나타나고, 약 24 시간 후에 3 번째 유충이 탈피한다. NMJ에서 신경 퇴행을 검사하는 데 관심이 있다면, 두 번째 instar 애벌레가 부상 당할 필요가있다. </li></ol> 3. 기계 상해를위한 Drosophila Larvae 준비 <ol><li> 조심스럽게 집게 또는 페인트 붓으로 개별 유충을 선택하십시오.어쨌든 압축하지 마라. </li><li> 차가운 1X PBS 또는 해부 완충액이 들어있는 유리 접시에 10 개의 애벌레를 직접 놓아 음식 잔해물을 제거하고 애벌레의 운동성을 감속시킵니다. </li></ol> 4. Drosophila Larvae의 기계적 상해 및 치료 <ol><li> 공동 2 마취 장치에 각각의 유충을 놓는다. </li><li> 절개 현미경 아래에서 큐티클을 통해 분절 신경을 시각화하기 위해 각 유충을 등쪽에 조심스럽게 굴립니다. </li><li> 위치 크기 5 포셉은 입 갈고리에서 시작 유충의 길이를 약 1 / 2 ~ 2 / 3 방법. 일단 위치, 크기 5 포 셉를 가진 segmental 신경을 포함하는 복부 표피의 약 1/3을 집어. <ol><li> 유충의 분절 신경이 손상되었는지 확인하려면 분열 신경을 분쇄하는 데 충분한 힘을 가하고 큐티클은 그대로 두십시오. 정확한 양의 힘을 결정하려면 10 개의 유충을 분쇄하고5 시간 후의 사망률은 50 % 미만이다. </li></ol></li><li> 부상 후 약 0.5 g의 효모 페이스트가 들어있는 과일 주스 한천 플레이트에 애벌레를 조심스럽게 옮깁니다. 각 유충을 앞쪽 끝이 효모 페이스트에 놓 이도록하여, 방해받은 운동성에도 불구하고 계속 먹이십시오. 참고 : 애벌레 분절 신경이 손상되었는지 확인하기 위해 한천 플레이트로 옮긴 후 분열 된 애벌레 운동성을 관찰 할 수 있습니다. 부상당한 유충은 부상 부위 뒤쪽에서 효과적으로 마비되지만 구강 후크와 사료를 움직일 수 있습니다. 부상 후 동물의 사망률이 높기 때문에 실험에 필요한 것보다 20-50 % 이상의 동물을 다치는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 빈 100x15mm 페트리 접시 바닥에 효모 붙여 넣기와 부상당한 유충 10 개가 들어있는 한천 플레이트를 놓습니다. 종이 타월이 애벌레 나 한천 플레이트에 닿지 않도록 젖은 종이 타월로 한천 플레이트에 부상당한 유충이 들어있는이 페트리 플레이트를 덮습니다. 이것을 배치하십시오RT에서 더 큰 기밀 용기에 페트리 접시. </li><li> 부상당한 후 일정 기간 (6, 12 또는 24 시간) 후에 해부학 검사를하십시오. 참고 : axonal cytoskeleton에 손상의 즉각적인 영향을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 직후 해부 수 있습니다. axonal 수송 결함을 검사하기 위해, 애벌레는 부상 후 약 6 시간 후에 해부 될 수 있습니다. 손상 후 약 12 ​​시간 후에 유비퀴틴 화 된 단백질의 축적이 관찰 될 수 있으며 손상 후 24 시간 후에 NMJ에서 운동 뉴런의 퇴행이 관찰 될 수있다. </li></ol> 5. NMJ에서의 신경 퇴행 분석 <ol><li> 앞서 설명한대로 Drosophila larval NMJ를 해독하십시오. 해부 버퍼의 드롭에 핀 (15, 16) 등쪽면을 따라 절단 한 짧게하는 실 가드 판 위에 핀 유충 및 필렛 체벽 근육을 노출시킨다. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 또는 Bouin &#39;s Solution 중 유충을 항생제에 따라 고정뉴런과 근육을 시각화하는 데 사용되는 신체. 참고 : 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질 태그가 Bouin의 고정액이 너무 거칠 수 있으므로 시각화해야하는 경우 PFA 고정을 사용해야합니다. </li><li> 이전에 11 , 13 , 16 , preynaptic 모터 뉴런과 인접 postsynaptic (SSR) 근육 주름을 표시하기 위해 설명한 immunofluorescence을 수행합니다. 형광 결합 conjugated 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 (HRP) (1시 300 분) 17 presynaptic 막 및 axons을 시각화하고 활성 영역은 anti-Bruchpilot (Brp) 항체 (nc82; 1 : 100, Developmental Studies Hybridoma Bank)를 사용하여 염색 될 수 있습니다. anti-Dics Large (Dlg) 항체 (1 : 10,000)로 시냅스 후 근육을 동시에 라벨링합니다. 18 </li><li> 이전에 설명한대로 NMJ에서 신경 퇴화를 정량화하기위한 확립 된 분석을 수행하십시오. 8 </sup&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 간단히 시냅스 전후의 구획에 대해 개별 NMJ를 동시에 시각화하십시오. postsynaptic 마커로 표시되었지만 presynaptic 마커로 표시되지 않은 모든 부음은 신경 퇴화 부위를 나타냅니다 ( 그림 1 ). 동물당 NMJ 당 평균 부 턴수와 평균 NMJ 수를 정량화 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

앞에서 설명한 신경 손상은 여기에서 입증되었는데 Drosophila 유충의 분절 신경에서 상해 / 스트레스를 유도하는 데 사용될 수 있습니다. 4, 5, 6, 14이 실험 기술은 신경 퇴행을 초래하는 이벤트의 시간적 순서를 해부뿐 아니라 부상을 올리는 운동 신경 세포체에 전사 변화를 조사하기 이전에 사용되어왔다. 5 (14) 또한,이 기술은 관찰 초파리 유충에서 축삭 변성 및 재생을 연구하기 위해 마이크로 유체 칩과 관련하여 기술되었다. 이 기술의 7 제한으로 인해 부상의 도입 동안 표피의 천자에 유충의 죽음을 포함한다. 그러나, 많은 수의 애벌레가 쉬에 분쇄 될 수 있습니다.높은 유생 사망률을 극복하기위한 기간. 우리가 포함시킨 수정은 부상 후 24 시간에 발생하는 NMJ에서 운동 신경 세포의 퇴행을 시각화하는 데 중요한 두 번째 instar 또는 초기 3 번째 instar larvae의 손상입니다. 여기서 우리는 뉴런 기계적 손상이 NMJ에서 운동 신경 세포의 퇴행을 연구하는데 활용 될 수 있음을 보여줍니다. 우리는 신경 세포와 관련 단백질이 인접한 근육보다 더 빨리 퇴행한다는 사실을 이용하여 신경 퇴행을 정량화하는 확립 된 방법을 사용합니다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 퇴행이 관찰을 정량화하기 위해서는 NMJ이 동시에 프리 시냅스 및 마커 염색하는 것이 중요하다. 여기, 우리는 d활성 영역 마커 Brp와 postsynaptic 마커 Dlg의 사용을 보여 주지만, NMJ에서 신경 퇴행을 연구하기 위해 이용 될 수있는 다른 pre- 및 postsynaptic 마커가 존재한다. 또한, 형광 태그가 붙은 분자가 신경 퇴행 과정에서의 효과를 연구하기 위해 사용될 수 있습니다. 1) 2) 대부분의 초파리 실험실은 이미 필요한 장비가 매우 저렴하고, 3) 조직이 너무 고정되어 같은 미세 유체 역학 (7) 등의 축삭 손상 후 변성을 연구하는 더 복잡한 방법이있다, 그러나 우리의 방법은 몇 가지 장점이 있습니다 기존의 형광 현미경 검사는 상해 후 신경 퇴행성 사건을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜이 부상 후 신경 퇴행과 관련된 광범위한 세포 및 분자 메커니즘을 검사하기 위해 적용될 수 있다고 생각합니다. 특히, 이러한 방법은 행동을 검사하는 데 사용될 수 있습니다.뉴런 손상 및 운동 신경 세포 퇴행 및 재생 전후의 형광 표지 된 단백질의 특이도.

신경 세포의 퇴행은 정상적인 발달 중에 발생하며 자연 노화 과정, 상해, 스트레스 또는 질병 상태에 의해 유발 될 수 있습니다. 초파리 인 Drosophila melanogaster 는 뉴런의 퇴행을 유발하는 분자 메커니즘의 현저한 유사성으로 인해 신경 퇴화를 연구 할 수있는 간단하고 강력한 모델 유기체를 제공합니다. 이러한 유사점은 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %가 Drosophila 동족체를 가지고 있다는 사실에 의해 강조됩니다. (1) 또한, 많은 분석과 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하는 기술 도구 개발 및 초파리에 활용되고있다. 2 , 3 Drosophila 내에서, 신경근 접합부 (NMJ)는 세포 및 전기 생리 학적 성질의 분석을 가능하게하며, 눈에 보이는 n으로 인해 신경근 질환을 연구하는 중요한 시스템임이 입증되었다euron-muscle 연결. (2) 본 연구에서는 분절 신경의 재현 부상을 허용 초파리 유충의 생체 신경 세포의 손상 분석을 설명합니다. 이 motoneuron 부상 NMJ 24 시간 부상에서 neurodegeneration의 결과 세포 조건의 일시적인 결과가 발생합니다. 신경 퇴행을 유발하는 운동 신경 세포를 재현성있게 손상시키는 능력은 퇴행성 과정에 필요한 특정 유전자의 확인, 신경 손상에 대한 전사 반응의 해부 및 보호 신호 전달 계통의 분석과 같은 다양한 용도를 갖는다. 4 , 5 , 6 이 방법은 살아있는 동물의 신경 변성과 재생을 연구하기 위해 미세 유체와 함께 사용되었습니다. 7 우리는 모터 뉴런 degenerat을 검사하기 위해 정량 분석을 사용합니다이온은 기계적 부상 후 Drosophila NMJ에서 발견된다. 이 분석은 시냅스 후 막과 단백질의 손실이 postsynaptic 근육 막 폴드로 특징 지어진 subynaptic reticulum (SSR)의 해체에 선행한다는 사실에 근거합니다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 이시 험은 시냅스 전의 뉴런이 인접한 시냅스 후 근육에 연결을 잃은 &quot;시냅스 발자국&quot;의 정량화를 허용합니다. 퇴행성 과정 유생 (12)에 걸쳐 점진적인 것으로 도시되었으며, 변경된 시냅스 개발 또는 발아에 의해 설명 될 수 없다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 광고기존의 돌연변이보다 기계적 상해를 사용하는 유리한 점은 NMJ에서 신경 퇴행으로 이끄는 세포 사건의 시간 순서를 해부 할 수 있다는 것이다. 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

뉴런의 퇴행은 정상적인 발달과 상해, 스트레스 및 질병에 대한 반응으로 발생합니다. 신경 세포 변성의 세포 특징은 인간과 무척추 동물에서 이러한 과정을 유도하는 분자 메커니즘과 현저하게 유사합니다. 초파리 Drosophila melanogaster 는 강력하지만 단순한 유전 모델 유기체로서 신경 퇴행성 질환의 세포 복잡성을 연구합니다. 실제로 질병 관련 인간 유전자의 약 70 %는 Drosophila 상 동체를 가지고 있으며 인간의 신경 퇴행성 질환을 연구하기 위해 파리를 사용하여 과다한 도구와 분석법이 기술되었습니다. 더 구체적으로 Drosophila 의 신경근 접합점 (neuromuscular junction, NMJ)은 신경 세포와 근육 사이의 구조적 연결을 분석 할 수 있기 때문에 신경근 질환을 연구하는 효과적인 시스템으로 입증되었습니다. 여기, 우리는 Drosophila의 생체 내 운동 신경 손상 분석에 대해보고합니다.재현 가능하게 24 시간까지 NMJ에서 신경 퇴행을 유도한다. 이 방법론을 사용하여 우리는 운동 신경 세포의 퇴행을 초래하는 세포 사건의 시간 순서를 기술했다. 부상 방법은 다양한 응용 분야를 가지고 있으며, 신경 퇴행에 필요한 특정 유전자를 확인하고 신경 손상에 대한 전사 반응을 해부하기 위해 활용되어왔다.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 우리는 기계적 신경 상해가 신경 퇴행성 사건의 일시적인 해부를 허용한다는 것을 증명했습니다. 14 , 18 사건의 순서는 이전에 특징 지어졌고 세포 골격의 즉각적인 붕괴, 축색 성 인신 매매 결함, ubiquitinated 단백질의 축적, 그리고 후속 적으로 24 시간의 신경 손상 이후에 시작된다. 손상되기 전에, WT NMJs는 전체 NMJ ( 그림 1A )에 걸쳐 postsynaptic 마커 Dlg에 apposition에 presynaptic 활성 영역 마커 Brp를 보여줍니다. 분절 신경의 기계적 손상은 중등도에서 중증의 신경 변성을 유도 할 수 있는데, Dlg로 염색 된 부음에는 현재 시냅스 활성 영역 단백질 Brp가 결핍되어 있습니다 ( 그림 1B ). Dlg로 염색되었지만 Brp 염색이없는 모든 부은 &quot;syn&quot;로 간주됩니다aptic 풋 프린트 &quot;를 카운트하고, 신경 변성 이벤트로 정량화 할 수있다. 전술 한 바와 같이, 주파수 및 퇴행성 신경 표현형의 심각성 모두 정량화 할 수있다. (11) <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> 그림 1 : 기계적 신경 손상은 근육 6/7의 NMJ에서 신경 퇴화를 유도합니다. ( A ) 손상되지 않은 NMJs는 전체 시냅스 마커 Dlg (red)와 함께 전 시냅스 활성 영역 마커 인 Brp (녹색)를 표시합니다. ( B ) 신경계의 기계적 부상은 Dlg 염색 된 부텐 (적색)이 나타내는 신경 퇴화를 Brp의 상실과 함께 유도한다. 화살촉은 신경 퇴행의 개별 부위를 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>이 그림.

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다.

학습 할 간단한 신경계 상해 방법론<em&gt; Drosophila</em&gt; 모터 뉴런 변성

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K 조회수.  Quinnipiac University.  여기에 우리는 세 번째 instar 애벌레의 neuromuscular 접합 (NMJ)에서 모터 뉴런의 신경 퇴화를 시각화하고 계량하기 위해 초파리 유충의 분절 신경을 손상시키는 간단하고 널리 액세스 할 수있는 방법을 설명합니다. 

비디오: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

의 레이저 캡처 Microdissection Drosophila 주변 뉴런

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

연구

신경과학

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

폐쇄 머리 외상성 뇌 손상을 입힐 수있는 방법<em&gt; 초파리</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

사용 보상 추구 행동의 변화를 측정하는 간단한 방법<em&gt; 노랑 초파리</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Sciatic 신경 호감 상해의 쥐 모형에 있는 기능 평가를 위한 3D 운동학 분석

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

신경변성과 관련하여 성인 Drosophila에서 시냅스 퇴성을 시각화

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...