Wir danken allen Mitgliedern der Keller und Magie Labs an der Quinnipiac University für hilfreiche Anregungen. Insbesondere möchten wir uns bei Barron L. Lincoln II für die Entwicklung dieses Verletzungsassays im Keller Lab bedanken. Wir danken auch der Quinipiac University College of Arts und Science Grant-In-Aid, die an LC Keller verliehen wurden.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Geräten <ol><li> 1 × Dissektionspuffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl 2 , 20 mM MgCl 2 , 10 mM NaHCO 3 , 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2) herstellen. </li><li> 40 Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zubereiten. </li><li> Vorbereitung von 1x PBT mit 1x PBS mit 0,01% Triton X-100. </li><li> Fruchtsaft-Agarplatten vorbereiten. 14 Mischen Sie 30 g Agar in 700 ml H 2 O und Autoklav. 0,5 g Methylparaben in 10 ml Ethanol auflösen und 300 ml Fruchtsaftkonzentrat (Traube oder Apfel) zugeben. Konzentrieren Sie das Konzentrat in eine autoklavierte Agarlösung und gießen Sie in die Deckel von 10 mm x 35 mm Petrischalen. HINWEIS: Traube Agar Power Premix kann auch von verschiedenen Firmen gekauft werden (siehe Tabls of Materials ). </li><li> Erhalten Sie Größe 5 Pinzette, die es erlaubt, die Larven mechanisch zu verletzen. </li><li> Verwenden Sie Standard Drosophila CO 2 </sUb&gt; basierte Anästhesiegeräte. </li></ol> 2. Auswahl von Drosophila- Larven <ol><li> Nehmen Sie eine Durchstechflasche oder eine Flasche Drosophila mit wandernden dritten Larven, die bei 25 ° C kultiviert wurden. </li><li> Wählen Sie zehn Einzel 2. oder 3. Larvenstadium anhand von Aussehen. Dritte Larven der Larven können durch das Auftreten von anterioren verzweigten Spiralen identifiziert werden, während die Larven der zweiten Larven kleiner sind und mehr klumpenartige vordere Spiralen haben. HINWEIS: Larval Stufen können auch durch Timing identifiziert werden. Bei 25 ° C erscheinen die Larven der zweiten Larven nach dem Schraffur etwa 48 h und die Larven der dritten Larven etwa 24 h später. Wenn es darum geht, die Neurodegeneration am NMJ zu untersuchen, müssen die Larven der zweiten Larven verletzt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung von Drosophila- Larven auf mechanische Verletzungen <ol><li> Sorgfältig einzelne Larven mit Pinzette oder einem Pinsel abwischen, vorsichtig seinUm es nicht zu komprimieren. </li><li> Direkte Platzierung von zehn Larven in Glasschale mit kaltem 1X PBS oder Dissektionspuffer, um jeglichen Nahrungsmittelschutt zu entfernen und die Larvenmotilität zu verzögern. </li></ol> 4. Mechanische Verletzung und Behandlung von Drosophila- Larven <ol><li> Legen Sie jede einzelne Larve auf eine CO 2 -Anästhesierungsvorrichtung. </li><li> Unter einem Seziermikroskop rollen Sie jede Larve sorgfältig auf ihre dorsale Seite, um die Segmentnerven durch die Nagelhaut zu visualisieren. </li><li> Positionsgröße 5 Pinzette ca. 1/2 bis 2/3 Weg nach unten die Länge der Larve beginnend an den Mundhaken. Sobald sie positioniert sind, kneifen Sie etwa 1/3 der ventralen Nagelhaut, die die Segmentnerven mit der Größe 5 Pinzette enthält. <ol><li> Um sicherzustellen, dass die Larvensegmentnerven verletzt werden, wenden Sie sich genügend Kraft an, um die Segmentnerven zu zermalmen, aber die Nagelhaut intakt zu lassen. Um die richtige Menge an Kraft zu bestimmen, 10 Larven zerkleinern und sicherstellenDie Sterberate nach 5 h liegt bei 50%. </li></ol></li><li> Nach der Verletzung sorgfältig Larven auf eine Fruchtsaft-Agarplatte mit etwa 0,5 g Hefepaste übertragen. Lege jede Larve so, dass ihr vorderes Ende auf der Hefepaste ist, für die fortgesetzte Fütterung trotz gestörter Motilität. HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Larvensegmentnerven verletzt worden sind, kann nach der Übertragung auf die Agarplatte eine gestörte Larvenmotilität beobachtet werden. Verletzte Larven sind wirksam hinter dem Ort der Verletzung gelähmt, können aber trotzdem ihre Mundhaken bewegen und füttern. Eine hohe Sterberate von Tieren nach Verletzung ist üblich, so ist es am besten, 20-50% mehr Tiere zu verletzen, als es für ein Experiment notwendig ist. </li><li> Legen Sie Agarplatten mit Hefepaste und 10 verletzten Larven in den Boden einer leeren 100 x 15 mm Petrischale. Bedecken Sie diese Petrischale, die jetzt die verletzten Larven auf einer Agarplatte mit einem feuchten Papiertuch enthält, um sicherzustellen, dass das Papiertuch die Larven oder die Agarplatten nicht berührt. PlatzierenPetrischale in einen größeren luftdichten Behälter, bei RT. </li><li> Holmer Larven zur Sezierung nach bestimmten Zeiträumen (6, 12 oder 24 h) nach der Verletzung abrufen. HINWEIS: Um sofortige Auswirkungen der Verletzung auf das axonale Zytoskelett zu untersuchen, können Larven direkt nach Verletzung seziert werden. Um axonale Transportfehler zu untersuchen, können Larven etwa 6 h nach Verletzung seziert werden. Etwa 12 h nach Verletzung kann ein Aufbau von ubiquitinierten Proteinen beobachtet werden, und 24 h nach Verletzung kann eine Degeneration von motorischen Neuronen am NMJ beobachtet werden. </li></ol> 5. Analyse der Neurodegeneration am NMJ <ol><li> Dissektil- Drosophila- Larven-NMJ, wie zuvor beschrieben. 15 , 16 Strömen Sie die Larven auf eine Sylgard-Platte, schneiden Sie entlang der dorsalen Oberfläche und füllen Sie mit Stiften in einem Tropfen Dissektionspuffer, um die Körperwandmuskulatur freizulegen. Fixieren Sie Larven in entweder 4% Paraformaldehyd (PFA) oder Bouins Lösung je nach AntiKörper verwendet, um Neuronen und Muskeln zu visualisieren. HINWEIS: Die PFA-Fixierung sollte verwendet werden, wenn fluoreszierende Protein-Tags wie Green Fluorescent Protein (GFP) sichtbar gemacht werden sollen, da Bouins Fixativ zu hart sein kann. </li><li> Führen Sie die Immunfluoreszenz durch, die zuvor beschrieben wurde 11 , 13 , 16 , um gleichzeitig präsynaptische Motorneuronen und benachbarte postsynaptische (SSR) Muskelfalten zu markieren. Visualisierung von präsynaptischen Membranen und Axonen mit fluoreszenz konjugierter Meerrettichperoxidase (HRP) (1: 300) 17 und aktive Zonen können mit einem Anti-Bruchpilot (Brp) Antikörper (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank) gefärbt werden. Gleichzeitig markieren Sie post-synaptische Muskeln mit einem Anti-Dics Large (Dlg) Antikörper (1: 10.000). 18 </li><li> Führen Sie einen etablierten Test zur Quantifizierung der Neurodegeneration am NMJ wie oben beschrieben durch. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 In kurzer Zeit visualisieren wir gleichzeitig einzelne NMJs sowohl für vor- als auch post-synaptische Kompartimente. Alle mit postsynaptischen Markern markierten Boutons, aber nicht präsynaptische Marker weisen auf Neurodegeneration hin ( Abb. 1 ). Die durchschnittliche Anzahl der Boutons pro NMJ sowie die durchschnittliche Anzahl der NMJs pro Tier kann quantifiziert werden. </li></ol>

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophilia,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li><li>Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).</li><li>Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).</li><li>Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactic+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactic is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).</li><li>Eaton, B. A., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM+Kinase1+controls+synaptic+stability+downstream+of+the+type+II+BMP+receptor.">LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor.</a> Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).</li><li>Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+spectrin+is+essential+for+synapse+stabilization.">Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization.</a> Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).</li><li>Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+Ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+or+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).</li><li>Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+enhance+synapse+stability+despite+persistent+disruption+of+the+spectrin/ankryin/microtubule+cytoskeleton.">Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton.</a> J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).</li><li>Lincoln, B. L., Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+immunohistochemistry.">Drosophila larval NMJ immunohistochemistry.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Smith, R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+imaging+of+active+zones+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebene neuronale mechanische Verletzung kann hier verwendet werden, um Verletzungen / Stress in den Segmentnerven der Drosophila- Larven zu induzieren. 4 , 5 , 6 , 14 Diese experimentelle Technik wurde bisher verwendet, um die zeitliche Abfolge von Ereignissen, die zur Neurodegeneration führen, zu sezieren, sowie die Transkriptionsänderungen in den motorischen Neuronzellkörpern nach Verletzungen zu untersuchen. 5 , 14 Darüber hinaus wurde diese Technik in Verbindung mit Mikrofluidik-Chips beschrieben, um die axonale Degeneration und Regeneration in Drosophila- Larven zu beobachten und zu untersuchen. 7 Einschränkungen dieser Technik sind der Tod der Larven aufgrund der Punktierung der Nagelhaut während der Einführung der Verletzung. Allerdings kann eine große Anzahl von Larven in einem sh zerkleinert werdenOrt Zeit, um eine hohe Larval-Sterberate zu überwinden. Eine Änderung , die wir aufgenommen haben , ist die Verletzung des 2. Larvenstadium oder frühen 3. Larvenstadium, die kritisch zu Motoneurondegeneration an der NMJ zu visualisieren, die 24 h nach der Verletzung auftritt. Hier zeigen wir, dass neuronale mechanische Verletzungen genutzt werden können, um die motorische Neurondegeneration am NMJ zu untersuchen. Wir verwenden eine etablierte Methode zur Quantifizierung der Neurodegeneration, die von der Tatsache profitiert, dass Neuronen und ihre assoziierten Proteine ​​schneller degenerieren als der angrenzende Muskel. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Um die Neurodegeneration zu beobachten und zu quantifizieren, ist es entscheidend, dass der NMJ gleichzeitig sowohl für prä- als auch postsynaptische Marker gefärbt wird. Hier haben wir dUnterstreicht die Verwendung des aktiven Zonenmarkers Brp und des postsynaptischen Markers Dlg, aber es gibt eine Fülle von anderen prä- und postsynaptischen Markern, die zur Untersuchung der Neurodegeneration am NMJ verwendet werden können. Zusätzlich können fluoreszenzmarkierte Moleküle der eigenen Wahl verwendet werden, um ihre Wirkungen während des neurodegenerativen Prozesses zu untersuchen. Es gibt kompliziertere Methoden, um Degeneration nach axonaler Verletzung zu untersuchen, wie zB Mikrofluidik 7 , aber unsere Methode hat mehrere Vorteile: 1) es ist sehr preiswert, 2) Die meisten Drosophila- Labore haben bereits die notwendige Ausrüstung und 3) das Gewebe ist so fixiert Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um neurodegenerative Ereignisse nach Verletzung zu quantifizieren. Wir stellen vor, dass dieses Protokoll angepasst werden kann, um eine breite Palette von zellulären und molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit Neurodegeneration nach Verletzung zu untersuchen. Insbesondere könnten diese Methoden verwendet werden, um das Verhalten zu untersuchenAvior von jeglichem fluoreszierend markierten Protein vor und nach neuronaler Verletzung und motorischer Neurondegeneration und Regeneration.

Neuronale Degeneration tritt während der normalen Entwicklung auf und kann durch den natürlichen Alterungsprozess, die Verletzung, den Stress oder die Krankheitszustände verursacht werden. Drosophila melanogaster , die gemeinsame Fruchtfliege, bietet einen einfachen und leistungsfähigen Modellorganismus, um die Neurodegeneration aufgrund der bemerkenswerten Ähnlichkeiten in den molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Degeneration von Neuronen antreiben. Diese Ähnlichkeiten werden durch die Tatsache hervorgehoben, dass etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog haben. 1 Darüber hinaus wurden zahlreiche Assays und technologische Werkzeuge zur Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen in Drosophila entwickelt und genutzt. 2 , 3 Innerhalb von Drosophila erlaubt der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) die Analyse sowohl der zellulären als auch der elektrophysiologischen Eigenschaften und hat sich als ein wichtiges System erwiesen, um die neuromuskuläre Erkrankung aufgrund des sichtbaren n zu untersuchenEuron-Muskel-Verbindungen. 2 In dieser Studie beschreiben wir einen in vivo Neuronenverletzungsassay in Drosophila- Larven, der die reproduzierbare Verletzung der segmentalen Nerven ermöglicht. Diese Motoneuron-Verletzung führt zu einer zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen, die zu einer Neurodegeneration bei der NMJ 24 h nach der Verletzung führen. Die Fähigkeit zur reproduzierbaren Verletzung von Motoneuronen, die zu einer Neurodegeneration führen, hat vielfältige Anwendungen, wie die Identifizierung spezifischer Gene, die für den degenerativen Prozess erforderlich sind, die Sezierung von Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen und die Analyse von schützenden Signalkaskaden. 4 , 5 , 6 Diese Methode wurde auch in Kombination mit Mikrofluidik verwendet, um neuronale Degeneration und Regeneration bei lebenden Tieren zu untersuchen. 7 Wir verwenden einen etablierten quantitativen Assay, um den motorischen Neuron degenerat zu untersuchenIon bei der Drosophila NMJ nach mechanischer Verletzung. Dieser Assay basiert auf der Tatsache, dass der Verlust der präsynaptischen Membran und der Proteine ​​der Zerlegung des subsynaptischen Retikulums (SSR) vorangeht, das durch die postsynaptischen Muskelmembranfalten charakterisiert ist. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Dieser Assay erlaubt die Quantifizierung von &quot;synaptischen Abdrücken&quot;, bei denen das vor-synaptische Neuron die Verbindung zum benachbarten postsynaptischen Muskel verloren hat. Der degenerative Prozeß hat sich in der Larvenentwicklung 12 als fortschrittlich erwiesen und kann nicht durch eine veränderte Synapsenentwicklung oder Keimung erklärt werden. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Die AnzeigeVorteil der mechanischen Verletzung über bereits vorhandene Mutationen ist, dass es die Sezierung der zeitlichen Abfolge von zellulären Ereignissen ermöglicht, die zur Neurodegeneration am NMJ führen. 13

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Micro-dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Air Tank</td>
			<td>Tech Air</td>
			<td>UN 1013</td>
			<td>Various tank sizes can be purchased/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Anesthetizing Apparatus</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel pins, size 0.1</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>To pour dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT 10132-1L</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>FLY-8030-20</td>
			<td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#39;s and PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Stereo MIcroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1BZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>HL150-AY-220V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- nc82 antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AF3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td>
			<td>One can you Alexa Fluor&#174; 488, 594 or 647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-484C</td>
			<td>Used to create humid chamber for larval recovery</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

Die Degeneration von Neuronen tritt während der normalen Entwicklung und als Reaktion auf Verletzungen, Stress und Krankheit auf. Die zellulären Merkmale der neuronalen Degeneration sind bei Menschen und Invertebraten bemerkenswert ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse antreiben. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster , bietet einen mächtigen, aber einfachen genetischen Modellorganismus, um die zellulären Komplexität neurodegenerativer Erkrankungen zu untersuchen. Tatsächlich haben etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog und eine Fülle von Werkzeugen und Assays wurden beschrieben, indem sie fliegt, um menschliche neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Genauer gesagt hat sich der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) in Drosophila als wirksames System erwiesen, um neuromuskuläre Erkrankungen zu untersuchen, da die Fähigkeit besteht, die strukturellen Verbindungen zwischen dem Neuron und dem Muskel zu analysieren. Hier berichten wir über einen in vivo motorischen Neuronenverletzungsassay in DrosophilaReproduzierbar neurodegeneration am NMJ um 24 h induziert. Mit dieser Methodik haben wir eine zeitliche Abfolge von zellulären Ereignissen beschrieben, die zu einer motorischen Neuronendegeneration führen. Die Verletzungsmethode hat vielfältige Anwendungen und wurde auch verwendet, um spezifische Gene zu identifizieren, die für die Neurodegeneration erforderlich sind, und die Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen zu zerlegen.

Mit dem hier vorgestellten Verfahren haben wir gezeigt, dass mechanische neuronale Verletzungen eine zeitliche Dissektion von neurodegenerativen Ereignissen ermöglichen. 14 , 18 Die Reihenfolge der Ereignisse wurde zuvor charakterisiert und beginnt mit einer sofortigen Unterbrechung des Zytoskeletts, gefolgt von axonalen Menschenhandlungsdefekten, einer Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen und anschließender Neurodegeneration 24 h nach der Verletzung. Vor der Verletzung zeigen WT NMJs den präsynaptischen aktiven Zonenmarker Brp in Apposition zum postsynaptischen Marker Dlg während des gesamten NMJ ( Abbildung 1A ). Die mechanische Verletzung der segmentalen Nerven kann eine mäßige bis schwere Neurodegeneration hervorrufen, bei der mit Dlg gefärbte Boutons nun das präsynaptische aktive Zonenprotein Brp fehlen ( Abbildung 1B ). Jeder Bouton, der mit Dlg gefärbt ist aber fehlt Brp Färbung gilt als &quot;synaptic Fußabdruck“und kann gezählt und als neurodegenerative Ereignis quantifiziert werden. Sowohl die Häufigkeit und Schwere der neurodegenerativen Phänotyp quantifiziert werden können , wie zuvor beschrieben. 11 <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> Abbildung 1: Mechanische neuronale Verletzung induziert Neurodegeneration am NMJ des Muskels 6/7. ( A ) Unverletzte NMJs zeigen den prä-synaptischen aktiven Zonenmarker, Brp (grün) in Apposition mit dem postsynaptischen Marker, Dlg (rot) während des gesamten NMJ. ( B ) Neuronale mechanische Verletzung induziert die Neurodegeneration, die durch Dlg-gefärbte Boutons (rot) mit dem Verlust von Brp angezeigt wird. Pfeilspitzen zeigen einzelne Orte der Neurodegeneration an. Maßstab = 10 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen</a>diese Figur.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration at JoVE.com

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren.

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

5.5K Aufrufe.  Quinnipiac University.  Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren. 

Serie: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Visualisierung der synaptischen Degeneration bei erwachsenen Drosophila in Verbindung mit Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

Ein

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

In Vivo Elektrophysiologische Messungen der zusammengesetzten Muskel Aktionspotential aus die Vorderbeine in Maus-Modellen der Motor Neuron Degeneration

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Visualisierung der synaptischen Degeneration bei erwachsenen Drosophila in Verbindung mit Neurodegeneration