파지 디스플레이를 사용하여 E3 리개아제용 유비퀴틴 변종 변종 변조기 개발

파지 디스플레이는 임상적으로 중요한 효소의 결합 특성을 조사하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 이러한 효소및 해당 질병에 대한 변조기를 개발하는 데 도움이됩니다. 파지 디스플레이는 다양한 표적 단백질을 위한 새로운 바인더를 개발하는 데 사용될 수 있으며 다른 기존의 디스플레이 방법보다 더 쉽게 수행할 수 있다. 이 절차는 반복적인 행동을 많이 포함, 그래서 열쇠는 자동 조종하지 않고 전체에 초점을 유지하는 것입니다.

종자 문화의 200 마이크로 리터와 함께 2YT 테트라 사이클린 국물의 30 밀리리터를 접종하여 시작합니다. 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 약 3 시간 동안 배양하십시오. 플레이트에서 도장 용액을 싱크대에 버리십시오.

종이 타월로 부드럽게 말리십시오. 그런 다음 코팅된 각 버퍼에 200마이크로리터의 PB 버퍼를 추가합니다. 접시에서 PB 버퍼를 버리고 종이 타월에 말리십시오.

플레이트의 각 코팅 된 웰에 PB 버퍼의 또 다른 200 마이크로 리터를 추가합니다. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오. 파지 라이브러리를 얼음 위에 해동한 다음 PBS의 라이브러리 다양성을 100배로 희석시킵니다.

폴리에틸렌 글리콜 나트륨 염화나트륨 용액을 희석된 라이브러리 볼륨의 5분의 1에 넣고 30분 동안 얼음에 용액을 배양합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30분 동안 11, 000배 G의 원심분리합니다. 상체를 버리고 원심분리기를 2분 더 남기고 남은 상체를 끌어내리고 파지 펠릿을 농축합니다.

분석할 대상 단백질당 PBT 버퍼의 1밀리리터에서 파지 펠릿을 부드럽게 재중단하여 분석할 수 있으며, 전형적으로 총 4개. 컨트롤 플레이트에 잘 코팅된 각 파지 라이브러리에 100 마이크로리터를 추가합니다. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오.

대상 플레이트에서 PB 버퍼를 싱크대에 넣고 종이 타월에 접시를 말리십시오. 제어판에 파지 라이브러리의 100마이크로리터를 모두 대상 플레이트의 각 코팅된 웰로 옮기. 300 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 실온에서 배양하십시오.

다음으로, 플레이트에서 파지 라이브러리를 제거하고 PT 버퍼로 코팅 된 우물을 네 번 세척합니다. 접시를 반전하고 버퍼의 마지막 방울을 제거하기 위해 종이 타월을 누릅니다. 파지를 잘 코팅한 각 에 0.1 개의 어금니 염산 100 마이크로 리터를 추가합니다.

300 RPM 궤도 흔들림으로 5분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 그 후, pH 11의 12.5 마이크로리터를 코팅한 각 에 1개의 어금니 트리스 염산염을 첨가하여 pH를 중화한다. 8개의 우물에서 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 용출된 파지를 전달합니다.

파이펫은 전송 하는 동안 위아래로 파이펫 용액 균질 하 게 하 고 우물에서 모든 액체를 흡인. 10%BSA를 발출된 파지에 추가하여 최종 농도를 1%까지 섭씨 4도에 마이크로센트심분리기 튜브를 저장합니다. 이것은 라운드 1 출력입니다.

한천 판에서 분리된 E.coli 콜로니와 함께 2YT 테트라사이클린 종자 배양 5마리를 접종하여 다음 선발을 위한 파지 입력을 배양하기 위한 종자 문화를 준비한다. 200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 적당한 양의 PBS로 2라운드와 3개의 튜브에서 표적 단백질을 희석시 희석시다.

다음 라운드를 위한 96웰 결합 플레이트에서 2라운드와 3회 튜브 및 4개의 우물을 96웰 레스트 플레이트에 넣습니다. 다음으로, 라운드 1 출력의 절반을 사용하여 미드 로그 상 셀의 3밀리리터를 접종합니다. 200 RPM 궤도 흔들림으로 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.

밀리리터당 100억 PFU의 최종 농도에 M13KO7 도우미 파지를 추가합니다. 200 RPM 궤도 흔들림으로 한 시간 동안 섭씨 37도에서 다시 배양하십시오. 한 시간 후, 문화의 전체 3 밀리리터를 2YT 카베니실린 카나마이신 용액의 30 밀리리터로 옮기.

200 RPM 궤도 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 성장합니다. UBE4B에 대한 유비퀴틴 변형 선택에 대한 대표적인 결과는 여기에 표시됩니다. UBV는 가장 높은 주파수에서 가장 낮은 주파수로 주문되었습니다.

시퀀스는 모든 무작위 잔류물이 있는 UBV의 다양한 유비퀴틴 영역을 나타냅니다. 바인더의 상대적 결합 친화성은 야생형 표적 단백질, 돌연변이 표적 단백질, 뿐만 아니라 오프타겟 단백질은 효소-연결된 면역흡혈구 분석기 또는 ELISA에 의해 측정된다. 모든 ELISA 흡수는 평균 96개의 BSA ELISA 점수와 96개의 평균 GST ELISA 점수에 대해 정규화되었습니다.

녹색이 더 어둡게 표시되는 것은 더 강한 상대 바인딩을 나타냅니다. GST는 표적 단백질이 GST 태그되기 때문에 비특이적 결합을 위한 대조군으로 포함되었다. ELISA 결과는 여기에 그래픽으로 표시됩니다.

x축은 UBV를 나타내고 y축은 해당 정규화된 흡광도를 나타냅니다. 이 절차를 시도할 때 염산을 추가한 후 플레이트에 용액을 버리지 않는 것이 중요합니다. 이제 파지 솔루션에서 일시 중단되고 후속 농축 최종 분석 또는 둘 다 수행할 수 있도록 이러한 작업을 유지하려고 합니다.

이 절차에 따라 UBV 주파수를 결정하기 위해 시퀀싱을 수행해야 합니다. ELISA 및 IC50 에세이는 각각 결합 효능및 억제 효능을 결정하고 더 특징을 가지는 UBV를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.