그들의 도움과 유용한 토론에 대해 Brian Weselowski와 Alexander W. Eastman에게 감사드립니다. 우리는 또한 Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui, Greg Thorn의 도움을 받았고 유용한 토론과 원고를 읽었습니다. 이 연구는 농업 및 농업 식품 캐나다 (Agriculture and Agri-Food Canada), Growing Forward-AgriFlex (RBPI 번호 2555) 및 Growing Forward II 프로젝트 번호 1670의 자금 지원을 받아 작성되었습니다. 이 연구는 또한 ZC Yuan에게 수여 된 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 RGPIN-2015-06052에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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뿌리 분비의 점진적인 특성을 감안할 때, planta에서 생산 된 독성 유발 화학 물질의 농도와 역동적 인 식물 - 미생물 상호 작용에 미치는 영향은 공간적 및 시간적 변화에 따라 발생합니다. 이 수경 재성 공동 재배 시스템에는 미생물 독성이나 식물 방어를 유도하는 합성 식물 호르몬이나 화학 물질이 보충되지 않습니다. 대조적으로, 종래의 접근법을 사용하여, 아세토 독 온온 (acetosyringone)과 같은 합성 화학 물질의 첨가는 갑작스러운, 인위적인 농도의 스파이크를 생성한다. 따라서이 수경 공동 배양 시스템은 미생물 및 숙주 식물이 공간적 및 시간적 매너를 인식하고 반응하는 자연 환경을보다 가깝게 모방합니다. 여기에서 Agrobacterium 독성 유전자가 Arabidopsis 와의 공동 배양시에 활성화되었음을 입증 할 수 있었다. 이것은 천연 식물 유래 화학 물질이 아그로 박테 리움 독성을 유도 함을 시사한다. 미래 전자ffort는 이러한 화학 물질을 확인하고 독성을 유발하는 화합물 acetosyringone이 그 중 하나인지 여부를 확인하는 데 필요합니다. 또한, 애기 루트 유전자 발현에 상당한 변화와 secretome 프로파일은 식물 미생물 상호 작용하는 동안 식물 숙주 반응과 분비 프로파일을 연구하는 수경 공동 배양 시스템의 잠재력을 보여주는, 아그로 박테 리움와 공동 배양에 관찰되었다. 사실, 수경법 공동 배양 기술을 사용하여, 식물 숙주의 유전자 발현 및 분비 프로파일은 미생물 상호 작용까지의 모든 단계에서 연구 될 수 있으며, 이러한 전사 또는 분비 변화가 후속 식물 - 미생물 상호 작용을 촉진 또는 억제하는 방법을 밝히는데 도움이 될 것이다 . 아라비돕시스 - 아그로 박테리아 신호 전달을 연구하는 것 외에도, 수경 공생 배양 시스템은 다른 중요한 식물 미생물 시스템을 연구하는데 적용될 수 있습니다. 그것은에 익숙하다.개별적으로 또는 집단적으로 행동하는 다양한 병원성 또는 유익한 미생물에 대한 식물 반응을 밝히고 상대적으로 &quot;자연적인&quot;조건에서 다른 식물 숙주에 대한 미생물 부착 및 반응을 연구한다. 전형적인 묘목 형태의 유지는 분자 식물 - 미생물 상호 작용을 명확히하기 위해 중요합니다. 다른 박테리아, 곰팡이, 또는 herbivory 병원체의 경우, 공동 양분 동안 미생물 성장을 돕기 위해 추가 영양분을 보충 할 수 있습니다. 그러나, 다른 식물 미생물 시스템과 함께 공동 배양하기 위해 고려해야 할 몇 가지 매개 변수가 있습니다. 종자의 크기와 뿌리 형태에 따라 더 큰 종자와 묘목의 경우 큰 구멍을 가진 금속 메쉬와 더 큰 성장 컨테이너가 필요할 수 있습니다. 이는 뿌리 구조가 메쉬 표면 아래로 완전히 발달하고 위의 조직이 번식하도록합니다. 설치 프로그램을 상위 플랫폼을 포함하도록 변경해야 할 수도 있습니다. 이것은 달성 될 수 있었다 by 큰 사각형의 메쉬를 자르고 모서리에서 더 멀리 구부리거나, 메쉬 표면을 컨테이너 바닥에서 높이 올리거나, 그리스 십자 모양으로 메쉬를 자르고 움푹 패인 곳에서 각 플랩을 구부리십시오. 물론, 모든 시스템에는 한계가 있으며 여기에 제시된 것은 더 긴 기간 동안 재배되는 대형 식물 ( 예, 성숙한 옥수수)에는 유용하지 않습니다. 또한, 일부 유기체는이 시스템을 사용할 때 떨리는 것보다 많은 폭기가 필요할 수 있습니다. 틀림없이 자연에서 발생하는 역동적 인 미생물 상호 작용을 정확하고 완벽하게 복제하는 시스템을 실험실에서 설계하는 것은 매우 어렵거나 불가능합니다. 수경 공동 배양이 뿌리 구조와 식물 형태학이있는 개념 상 적어도 근원의 자연 조건을 더 잘 나타내지 만 시스템에 토양 또는 토양 미생물은 존재하지 않습니다. 그러나이 시스템을 적용 할 수 있습니다.통제 가능한 환경에서 미생물을 연구하고 식물이나 미생물이 다른 생물학적 또는 비 생물 적 자극을 감지하고 반응하는 방법을 배우는 것과 같이 다양한 요구를 충족시킬 수 있습니다. 이 수경 공동 배양 시스템은 또한 수경법 또는 생태계에서의 미생물 및 그 기능에 대한 이해를 용이하게 할 수있다. 이는 수경 온실 산업의 질병 관리 및 식물 건강 또는 식물과 미생물의 수생 생태계에 매우 중요합니다. 또한,이 hydroponic cocultivation 시스템 bioremediation을 공부하고 미생물이나 식물의 관련 대사 과정과 규제 경로를 명료하게 적용 할 수 있습니다. 또한,이 수경 공동 배양 시스템은 미생물 또는 식물 숙주에 대한 기존의 (알로 화 학물) 및 / 또는 적용 (합성) 영양물 및 화학 신호 / 화합물의 영향에 대한 조사를 용이하게합니다 44 . 간접적으로 식물 조직에 영향을 미치는가?0; 잎, 싹)은 수경 식물 공동 처리와 같은 다른 식물 방어 과정을 탐구 할 수있는 기회를 제공하며,이 신호가 어떻게 전달되는지에 대한 정보를 제공합니다. 이 공동 재배 시스템의 가장 중요한 부분은 오염을 방지하는 것입니다. 특히 반고체 배지에서 탱크로의 식물 이동은 수 문계 배지의 오염을 막기 위해 매우 조심스럽게 이루어져야한다. 그러므로이 실험 단계는 생체 안전 캐비닛에서 멸균 조건 하에서 수행되어야하며 실험자는 실험을 위해 미생물을 접종하기 전에 이동 후 2-3 일을 기다려야합니다. 요약하면, 수경 공동 배양 시스템은 실험 과정 전반에 걸쳐 전형적인 식물 형태 및 식물 뿌리 구조의 완전성을 유지함으로써 종래 접근법의 다양한 한계를 개선한다. 또한, 시스템은 보충을 피합니다.식물 호르몬이나 방어 / 독성을 유발하는 화학 물질과 같은 합성 화학 물질을 사용합니다. 따라서 미생물과 숙주 식물이 공간적, 시간적 매너를 인식하고 반응하는 자연 환경을보다 밀접하게 모방합니다. 이 cocultivation 시스템은 endophytic 또는 epiphytic 미생물을 포함하여보다 &quot;자연적이고&quot;다루기 쉬운 조건에서 다른 식물 미생물 시스템을 연구하기 위해 적용될 수 있습니다. pathogenesis, symbiosis, 또는 plant growth promotion과 같은 planta에서 의 상호 작용의 다양한 양상을 조사 할 수있다. 수경 공동 배양 시스템은 식물과 미생물의 생리적, 생화학 적 및 분자 적 반응에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 특정 시점 / 간격 또는 성장 단계에서 수경 공동 배양 시스템에서 성장하는 박테리아 또는 식물은 식물 및 미생물 전 사체, 식물 및 미생물 대사 체, 식물 및 미생물 분비 원 및 생물 리간드를 비롯한 다양한 &quot;오믹 (omics)&quot;분석을 위해 개별적으로 샘플링 할 수 있습니다에. 또한,이 수경 공동 공동 배양 시스템은 제어 가능한 환경에서 식물 숙주와 미생물 간의 상호 작용을 연구하는데 적용될 수있다. 요약하면, 수경 공생 (hydroponic cocultivation)의 이점은 분자 식물 - 미생물 상호 작용 및 신호 전달을 밝히기위한 우수한 시스템을 예증합니다.

식물과 관련된 미생물은 생물 지구 화학적 순환, 생물학적 복원, 기후 변화 완화, 식물 성장 및 건강, 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 대한 식물 내성에 중요한 역할을한다. 미생물은 식물 세포 벽 접촉을 통해 간접적으로 화학 분비 및 신호 1 , 2 , 3을 통해 식물과 상호 작용합니다. 침착성 유기체로서 식물은 병원균에 의한 감염을 막기위한 직접 및 간접적 인 기작을 개발해 왔습니다. 직접 방어에는 구조적 방어와 방어 단백질의 발현이 포함되지만 간접 방어에는 2 차 식물 대사 산물 생성 및 침입 병원체에 대항하는 유기체의 인력이 포함됩니다 4 , 5 . 식물에서 추출한 뿌리 삼출물, 분비물, 점액, 점액 및 용 해물은 rhizosphere의 물리 화학적 성질을 변화시켜 끌어들이거나 밀어 낸다.그들의 숙주에 대한 미생물 6 . 뿌리 분비물의 화학적 조성은 종 특이 적이며, 이로 인해 rhizosphere에서 이러한 화합물을 인식 할 수있는 특정 미생물을 허용하는 선택 필터 역할을합니다 6 . 따라서, 호환 가능한 미생물 종은 자극되어 식물 숙주 1 의 이익 또는 손상에 대한 그들의 결합을 활성화시키고 향상시킬 수있다. 근권에서 식물 - 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 미생물 및 화학 물질 노출의 대부분이 뿌리 구조와 토양 - 공기 경계 2 , 6 , 7 , 8 에서 발생하기 때문에 식물 생산성과 생태계 기능을 향상시키는 데 중요합니다. 그러나 지하 식물의 미생물 상호 작용과 상호 반응에 대한 조사는 흥미롭게도<html> 복잡하고 역동적 인 성질 및 단단히 조절 가능한 성장 조건 하에서의 천연 뿌리 구조 및 식물 형태와 적합한 실험 모델의 결여. 가장 많이 연구 phytopathogens 중 하나 인 아그로 박테 리움 체리, 사과, 배, 포도를 포함한 농업과 원예 중요성, 식물의 넓은 범위를 감염, 9 상승했다. 아그로 박테리아 는 식물 - 병원체 상호 작용을 이해하는 중요한 모델 유기체이며 식물 형질 전환 및 식물 공학 10 , 11 , 12 , 13 , 14 에서 강력한 도구입니다. 분자 공장 - 아그로 박테 리움 상호 작용은 물론, 수십 년 동안 연구 및 아그로 박테 리움의 병원성의 현재 이해는 9 광범위 한F &quot;&gt; 11, 15, 16. 아그로 병원성은 대부분 17 센싱 그 독성 프로그램 및 세포 간 통신의 미세 조정의 결과, 식물 유래의 신호를 지각의 발전 능력에 소위 정수를 때문이다. 아그로 박테 리움 독성 프로그램은 rhizosphere에서 이용 가능한 몇 가지 신호에 의해 조절되며 ChvG / I 시스템과 VirA / G 시스템의 2 가지 세트로 구성된다. rhizosphere의 산성 조건은 chvG / I , virA / G 의 전사를 활성화시킨다 , virE0 , virE1 , virH1 , virH2 및 VI 형 분비 시스템 (T6SS) 18의 유전자를 포함한 Agrobacterium 병원성에 관여하는 여러 다른 유전자를 포함한다. 아세토 오손 (acetosyringone) (4&#39;- 히드 록시 -3 &#39;, 5 &#39;- 디메 톡시 아세토 페논), V인산화 신호 전달 메커니즘을 통한 irA / G 2- 성분 시스템 19 . VirA / G는 전체 vir 레 귤론을 활성화시켜 종양 유도 (Ti) 플라스미드에서 전사 핵 (T-DNA)으로 알려진 ~ 20kb의 박테리아 DNA 조각을 식물 핵 16 으로 옮기고 통합시킵니다. T-DNA는 식물 호르몬 인 indole -3-acetic acid (IAA) ( iaaM 과 iaaH )와 cytokinin ( ipt )의 합성에 관여하는 유전자를 가지고 있으며 일단 식물 세포에서 발현되면 많은 양의 식물 호르몬이 생산됩니다. 이것은 비정상적인 조직 증식과 식물 종양 발달을 일으키는데 이는 크라운 담즙병 (crown gall disease)으로 알려져 있으며 이는 식물 9 , 11 , 20 의 만성적이고 재발적인 문제입니다. IAA는 아그로 독성을 억제하거나 감소 Agrobacteriu 살리실산 및 감마 - 아미노 부티르산으로 집단적 행동<html> m 쿼럼 감지 (QS) ( 17 , 21 , 22) . 이 억압 카운터, T-DNA는 아그로 병원성을 촉진 아그로 정수 감지를 활성화하고, 또한 병원체 22, 23 영양원 역할 의견을 갖다 생합성을위한 유전자를 운반한다. 아그로 박테 리움 - 식물 간 상호 작용에 대한 전반적인 깊은 이해와 식물 숙주로의 T-DNA 전달로 인해 초기 상호 작용에서 복잡한 신호 전달 사건이 덜 잘 이해된다. 이것은 Agrobacterium -plant signaling을 조사하기위한 기존의 접근법의 한계로 인해 부분적으로 발생합니다. 식물 세포 현탁 배양 및 인공 사이트 별 상처는 일반적으로 분자 식물 - 미생물 상호 작용 (24)을 연구하는 데 사용됩니다. EF &quot;&gt; (26), (27)는 그러나, 세포 현탁액은 일반적인 식물의 형태를 부족, 특히 식물 서스펜션 세포가 미생물 화성 및 독성 (28), (29) 활성화를위한 매우 중요한 루트 구조와 뿌리 삼출물을하지 않아도 식물 형태의 유지 보수. 루트 구조는 직접 감염된 식물 조직 (30), (31)에 의한 식물 방어 관련 유전자의 검출 결과, 사이트 별 감염을 용이하게 인위적으로 상처를 입는 식물에 의해 해결되었습니다. 그러나, 인공 상처는 자연의 병원균 감염 큰 차이가 특히 상처가 자스몬 산 (JA) 축적을 유도하여 천연 식물 신호 전달 및 방어를 체계적으로 방해한다 .26 또한 합성 화학 물질은 인공적으로 식물 숙주 반응을 유도하는데 사용된다또는 병원체 독성. 란타에서의 반사 농도와 같은 화학 물질의 보충이 가능하지만, 이러한 보충 서서히 미생물 (28), (32)에 의해 감지 화성 구배를 생성 주변 근권로 루트 배설물의 확산을 고려하지 않는다. 식물 - 미생물 상호 작용, 정확성과 방해하고 제한 될 수 얻은 데이터의 깊이, 그리고 란타에서 직접 번역하지 않을 수 있습니다 기존의 접근 방식에서 생성 된 지식을 연구하는 기존의 접근 방식의 한계를 감안할 때. 식물 - 아그로 박테 리움 신호 전달의 많은 양상은 아직 완전히 이해되지 않았는데, 특히 질병 증상이 아직 나타나지 않은 초기 상호 작용 단계에서 그렇다. 종래의 접근법의 한계를 수정하기 위해,이 연구는 저렴하고, 단단히 조절 가능하며, 유연한 수경 첨가제 인 c연구원이 분자 식물 - 미생물 상호 작용의 초기 단계에서 복잡한 신호 전달 및 반응 경로에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있도록하는 시스템입니다. 수경법은 식물 영양소, 뿌리 삼출물, 성장 조건 및 식물에 금속 독성의 영향을 연구하기 위해 널리 사용되었습니다 33 , 34 . 작은 공간 요구 사항, 다양한 식물 조직의 접근 가능성, 영양 / 환경 조건의 엄격한 제어 및 해충 / 질병 통제를 포함하여 수경법 모델의 몇 가지 장점이 있습니다. 수경 시스템은 한천 / 피토 아르 (phytoagar) 도금 기술과 비교하여 식물 생장을 제한하지 않으며, 2-3 주 후에 성장을 제한합니다. 중요한 것은, 전체 공장 구조의 유지 보수는 미생물 화성 및 독성 유도 (8), (29)에 필요한 천연 루트 분비를 촉진한다. 시스템 설명여기 침대는 대안 33 , 34 보다 간단하고 노동 집약적입니다. 더 적은 부품을 사용하고 표준 가위 이외의 도구를 필요로하지 않습니다. 이 제품은 식물 성장에 대한 강력한 지지제이자 미생물 성장을 지원하기위한 흔들림을 통한 멸균 조건 하에서의 단순 통기 방법 인 금속 망 (나일론 33 과 대조적으로)을 사용합니다. 또한이 시스템은 뿌리의 너비를 제한하지 않으면 서 다양한 식물 종을 수용 할 수있는 식물 성장을 지원하기 위해 다양한 크기의 금속 망을 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 수경 공동 배양 시스템에서, 식물은 접종 된 박테리아의 성장을지지하는 유기 화합물을 식물 뿌리가 분비하는 무균 수경계에서 재배된다. 이 공동 배양 시스템에서는 식물 세포 내 호르몬, 방어력 유발 물질 또는 독성 유발 화학 물질과 같은 인공 화학 물질이 보완되지 않으며 자연 세포를 반영합니다식물 - 미생물 상호 작용 동안 신호 항상성. 이 수경 공동 배양 시스템에 의해, 동시에 유전자를 아그로 박테 리움에 의한 감염에 따라 애기 장대 골-0 뿌리 조직에서의 발현뿐만 아니라, 애기 장대와 공동 배양시 아그로 유전자의 활성을 결정할 수 있었다. 이 시스템은 아그로 박테 리움 ( Agrobacterium )과 동시 배양 (감염)시 식물 뿌리의 분비 프로파일뿐 아니라 식물 뿌리에 대한 아그로 박테 리움의 부착을 연구하는데 적합하다는 것이 추가로 증명되었다 ( 그림 1 ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" /> 그림 1 : 샘플 분석과 함께 수경 공동 배양 시스템의 개요. 식물은 메쉬 (메쉬 위의 ​​싹)의 꼭대기에서 자랍니다. 수경 재배액에 담근 다음 뿌리를 수경 재배 배지에 넣고 박테리아 f또는 공동 배양. 식물 조직과 박테리아는 동시에 추출 및 분석을 위해 분리됩니다. 이 수치는 참고 35 에서 수정되었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0)</td>
			<td style="width:163px;">Arabidopsis Biological Resource Centre</td>
			<td style="width:119px;">CS7000</td>
			<td style="width:167px;">https://abrc.osu.edu/order-stocks</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58)</td>
			<td style="width:163px;">University of Washington</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">labeled bacteria</td>
			<td style="width:163px;">in-house</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">vortex</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">microcentrifuge</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5% sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">double distilled water</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">autoclave</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">micropipette&#160;</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70 % ethanol</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Murashige and Skoog (MS) basal salts</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5524</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sucrose</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">MES</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">B5 vitamin mix</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">phytoagar</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">deep Petri dishes</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">stainless steel mesh</td>
			<td style="width:163px;">Ferrier Wire Goods Company Ltd</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">grade: 304; mesh count: 40 &#215; 40; wire DIA: 0.01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">micropore tape, 1 inch</td>
			<td style="width:163px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1530-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">diurnal growth chamber</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">cylindrical glass tanks, 100 &#215; 80 mm&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3250</td>
			<td style="width:167px;">other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">flow hood</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">forcepts</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">yeast extract</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">tryptone</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:215px;">MgSO4</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">shaking incubator</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NaCl</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">shaker</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">scissors</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">fluorescence microscope</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">nail polish</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bacterial RNA extraction kit</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit)</td>
			<td style="width:163px;">Qiagen</td>
			<td>74903 or 74904</td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">material and equipment for RT-qPCR</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">material and equipment for microarray analysis</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">mortar and pestle</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">0.2 &#181;m pore filter</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">sealable test tubes</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">ethyl acetate</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">nitrogen gas</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">material and equipment for HPLC</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">material and equipment for ESI-TOF-MS</td>
			<td style="width:163px;">(various)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">optional, depends on downstream analyses</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydroponic co-cultivation system for simultaneous and systematic analysis of plant/microbe molecular interactions and signaling

복잡한 식물 - 미생물 신호 처리 과정을 묘사하기 위해서는 자연 식물 - 미생물 상호 작용을 모방 한 실험 설계가 매우 중요합니다. 애기 장대 - Agrobacterium tumefaciens 박테리아의 병인 및 식물 상호 작용을 연구하기위한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 식물 - 아그로 박테 리움 상호 작용에 대한 이전의 연구는 주로 식물 세포 현탁 배양, 식물의 인공 상처 또는 합성 화학 물질에 의한 미생물 독성 인자 또는 식물 방제 의 인공 유도에 크게 의존해왔다. 그러나 이러한 방법은 식물과 미생물이 공간적, 시간적 방식으로인지하고 반응하는 식물의 자연 신호 와 구별된다. 이 작품은 손상되지 않은 식물이 금속 메쉬 스크린에 의해지지되고 아그로 박테 리움 과 함께 배양되는 수경 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 공동 배양 시스템에서, 합성 피토 호르몬 또는 micr을 유도하는 화학 물질obial 독성 또는 식물 방어는 보충된다. hydroponic cocultivation 시스템 은 planta의 자연 식물 - 미생물 상호 작용 및 신호 항상성과 매우 유사합니다. 식물 뿌리는 아그로 박테 리움을 함유하는 배지로부터 분리 될 수 있고, 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물의 신호 및 반응은 동시에 체계적으로 조사 될 수있다. 특정 시점 / 간격에서, 식물 조직 또는 박테리아는 다양한 &quot;omics&quot;분석을 위해 별도로 수확 될 수있어이 시스템의 효능과 효과를 입증합니다. 수경 공동 배양 시스템은 1) 다양한 식물 미생물 시스템의 상호 신호 전달, 2) 식물 숙주와 여러 미생물 종 ( 예 : 미생물 협회 또는 미생물) 간의 신호 전달, 3) 영양소와 화학 물질의 관련성 연구 4) 미생물이 식물 숙주와 어떻게 상호 작용하고 생물학적 인 o에 대한 식물 내성에 기여하는지r 비 생물 적 스트레스.

수경 재배 동시 재배 시스템의 성장 A. tumefaciens C58의 성장 곡선은 초기 16 시간의 동시 배양에서 유의 한 지연 단계를 나타내었고, A. thaliana Col-0과 공동 재배 할 때 매우 안정한 성장을 보였으며, 최대 OD 600 은 48 h postinoculation. 대조적으로 A. thaliana가 없는 대조 배양에서는 본질적으로 박테리아 성장이 관찰되지 않았다 ( 그림 4 ). 이러한 결과는 인위적으로 공급되는 추가 영양소없이 식물 뿌리 분비 화합물이 수경법 공동 배양 시스템에서 아그로 박테 리움 성장을 지원할 수 있음을 시사한다. 공동 배양의 초기 16 시간 동안의 유의 한 지연 단계는 병원체와의 공동 배양시 다소 복잡한 숙주 지각 및 점진적인 뿌리 분비로 인한 것일 수있다 &lt;/ p&gt; 공동화 된 A. thaliana 식물은 A. tumefaciens 의 부재하에 성장한 대조군 식물과 비교하여 처음 3 일 동안 질병 증상을 나타내지 않았다 ( 그림 5a , 5b ). 그러나, 5 일간의 공동 배양 후에, 점차적으로 차이점이 보였고, 모의 처리 된 대조 식물은보다 푸르고 건강 해졌다. 아그로 박테 리움 과의 7 일간의 공동 배양 후, 식물 조직은 조기 개화뿐만 아니라 염색과 괴사를 보였다 ( 그림 5c, 5d ). Arabidopsis 에서 일찍 꽃 피는 것은 계통 발생 학적으로 다른 병원균에 의한 감염의 일반적인 결과입니다 41 , 42 . 식물 뿌리에 Agrobacterium 부착의 현미경 시각화 A. tumefaciens 는 전형적인 막대 모양 또는 필라멘트 모양을 가진 식물 뿌리 구조에 국한되었다. 폭은 0.5 μm, 길이는 3-5 μm입니다 ( 그림 6 ). 박테리아 세포의 대부분은 수직으로 이전의 연구 결과에 따라, 루트 세포 벽의 표면에 부착 된 그 극성 패션 (32)의 셀 벽에 아그로 박테 리움 바인드가. 이러한 결과는 수경 공동 배양 시스템이 뿌리 구조에의 부착 및 감염 과정과 같은 planta에서 박테리아 역학을 실시간으로 연구하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 사실, 다른 미생물이 없다면,이 공동 배양 시스템은 planta에서 박테리아 - 식물 부착의 직접 관찰을위한 잡음이없는 플랫폼을 제공한다. </p&gt; Agrobacterium 독성 전 사물의 활성화 공동 배양 8 시간 후, A. tumefaciens 세포를 RNA 분리를 위해 수확하고, 대표적인 독성 유전자의 전사 수준을 qRT-PCR로 평가 하였다 ( 도 7 ). 발현 유전자 ropB, virA, virD1, virH1, virE0 및 chvG의 발현은 A. thaliana가 없는 대조군과 비교하여 식물 숙주와의 공동 배양 중에 상당히 증가되었다. 구체적으로, mRNA의 존재 량은 virD1 이 70 %, virA 가 94 %, virE0 가 40 %, ropB 가 330 %, virH1 이 48 % 증가하여 chvG가 100 % 증가했다. 이 결과는 suppleme없이합성 독성 유발 화학 물질과 함께, 수경 공동 배양 시스템에서 화학 물질을 분비하는 식물은 아그로 박테 리움 독성 프로그래밍을 활성화시킬 수있다. Agrobacterium 독성 유전자의 유도는 수경 공동 배양 시스템에서 식물 유래 신호에 대한 Agrobacteria 반응을 나타낸다. 이는 이전의 연구는 이러한 유전자 아니라 시린하여 산성 조건 (18)에 의해 유도 된 것을 나타낼 같이 아그로 ropB 및 chvG는 애기 장대와 공동 배양시 유발되는 매우 흥미 잘 알려진 독성 - 유도 화합물 19. 이 결과는 Arabidopsis 뿌리에서 확인되지 않은 화합물이 ropB 및 chvG 발현을 유도 할 수 있음을 시사한다. 그러나 그러한 독성을 유발하는 화학 물질은 더 확인되어야합니다. <img alt="그림 7" class = &quot;xfigimg&quot;src = &quot;/ files / ftp_upload / 55955 / 55955fig7.jpg&quot;/&gt; 그림 7. 수경 공동 배양 시스템에서 Agrobacterium Virulence의 활성화. 6 개의 Agrobacterium 독성 인자의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 정량적으로 측정 하였다. 병독성 인자 전 사체의 양은 16S rRNA 전 사체의 것으로 정규화되었다. 데이터는 3 번의 생물학적 반복의 평균 ± 표준 편차 (오차 막대)를 나타내며, 학생의 t- 검정에 의해 얻어진 P 값으로 나타냅니다. 식물 전사 물의 발현 qRT-PCR 분석은 이전에 A. thaliana (미공개 자료)에서 차별적으로 발현 된 것으로 보이는 5 개의 유전자에 대해 수행되었다. 예상대로, qRT-PCR은 AGP 30 (AT2G33790)과 NAS 1 (AT5G04950)이 각각 97 &amp; 89 %만큼 다운 컨버전스 된 반면 HSP3 대조군 각각에 대해 21 (AT4G27670), PGIP1 (AT5G06860) 및 ELIP1 (AT3G22840)이 각각 3,800,540 및 510 % 상향 조절되었다 ( 도 8 ). <img alt="그림 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig8.jpg" /> 도 8 : A. thaliana 뿌리 대장의 qRT-PCR. 각 mRNA 전 사체의 양은 ACTIN II 전 사물의 양으로 정상화되었다. 데이터는 학생의 t- 검정에 의해 얻어진 P 값 과 함께 3 번의 생물학적 복제의 평균 ± 표준 편차 (오차 막대)이다. 분비 프로파일을 변경하는 방법 뿌리 유래 화합물은 식물 종 사이에서 크게 다른 것으로 나타났습니다 6 , 8 . 로삼출물에는 식물 - 미생물 상호 작용 동안 다양한 신호 반응을 이끌어내는 분자 신호가 포함된다 1 , 43 . 그 루트 분비 화합물 유익한 박테리아 (29)의 흡착에 필수적이다 제외 그러나, 미생물의 작용은 다음 시간에 따른 호스트 분비 프로필 진보적 차이는 훨씬 덜 이해된다. A.와 공동 배양 72 시간을 다음 A. 장대 골-0 secretome 프로파일의 차이 즉, 아그로 박테 리움의 부재 (비 접종 A. 장대 골-0 양이온 모드 LC-MS 분석 및 비교를 사용하여 설정 하였다 C58을 메파 ). 아밀로 박테 리움 접종의 결과 새로운 화합물이 나타남에 따라 분비물의 분명한 변화가 관찰되었습니다 ( 그림 9 ). 아그로 박테 리움 (Agrobacterium) 접종 계획의 분비물에서 35 종의 화합물이 상대적으로 강화되었다반면에 76 개는 비 접목 식물의 분비물에서 강화되었다 ( 그림 9 ). 후자는 A. tumefaciens C58이 감염되기 전에 접하게되는 화합물을 나타내는 것으로 보인다. 이러한 화합물이 확인되지 않았고 특정 뿌리 - 파생 화합물의 분화가이 연구의 맥락에서 결정되지는 않았지만, secretome 분석은이 hydroponic cocultivation 시스템을 사용하여 숙주 분비 프로파일의 검출 가능한 차이를 입증했다. <img alt="그림 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig9.jpg" /> 그림 9 : A. thaliana Col-0 루트 시크릿 분석. A. thaliana Col-0 secretome profiles의 분석은 모의 접종 및 접종 시료에 대해 3 번으로 완료되었다. 각 치료군의 분비 프로파일에서 발견 된 138 개의 독특한 질량 신호 (화합물)에 대한 피크 면적을 평균화하고,검출 가능한 화합물의 차이를 시각화하기 위해 평균값을 각 화합물 (모의 접종 마이너스 접종)의 존재 량의 차이를 계산하기 위해 사용 하였다. 큰 음성 차이 값을 갖는 화합물은 접종 된 식물의 분비물에서 더 풍부하고, 양성 차이가 큰 화합물은 모의 접종 된 식물의 분비물에서 더 풍부했다.

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A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

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13.9K 조회수.  Agriculture & Agri-Food Canada.  기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다. 

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Zebrafish의 유충 루시 페라 제 리포터 시스템과 글루코 코르티코이드 신호에 대한 화학적 스크리닝 절차

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

세포 단일 층의 기계적 자극에 의​​한 칼슘 웨이브 전파 : 소 각막 내피 세포의 예

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...