<ol>
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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-&#223;-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics.">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-&#223;-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li><li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling,+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins.">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li><li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity.">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li><li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco.">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li><li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation.">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li><li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li><li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco.">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li><li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites.">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li><li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants.">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation.">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li><li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry.">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li><li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID,+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos.">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li><li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StatQuant:+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry.">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li><li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+wants+cRacker:+Automated+standardized+data+analysis+of+LC/MS+derived+proteomic+data.">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li><li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+of+remorins,+a+plant-specific+protein+family:+Evolutionary+and+functional+perspectives.">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li><li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondetergent+isolation+of+rafts.">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li><li>Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method.">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li><li>Macdonald, L. J., Pike, L. 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S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics.">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li><li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins.">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 저자되었습니다 Witold Szymanski는 분자 식물 생리학의 맥스 플랑크 연구소의 직원입니다. 저자는 트라우트 슐츠는 호헨 하임 대학, 독일의 직원입니다.

본 논문에서 제시하는 프로토콜은 여러 단계를 포함하고, 그들 모두는 세제 저항 막 및 세제 용해 분수에 식물 세포막의 순수하고 대표 분별을 얻을 매우 중요합니다. 따라서 지침에 따라 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 비 - 이온 성 세제 (단계 3.2)와 세포막 분획의 치료는 막 마이크로 도메인 분획의 품질에 강한 영향을 미친다. 상이한 제제 사이 재현 가능한 결과를 얻기 위해, 그리고 동일한 실험에서 서로 다른 샘플을 비교할 수 있도록, 그것이 정확하게 세포막에서 단백질의 농도를 평가하고, 단백질 함량에 대해 동일한 비율을 항상 세제를 적용하는 것은 매우 중요 항상 같은 최종 농도. 실제로, 그것은 때때로 높은 단백질 농도를 가진 샘플을 희석하거나 다른 농도의 주식을 사용할 필요가 있다는 것을 의미트리톤 (Triton) X-100. 생화학 적 연구에서, 최근에는 막 마이크로 도메인 28-30의 분리를위한 세제가없는 방법을 사용하는 연구자들 경향이 있었다. 이러한 방법은 프랑스어 압력 셀 프레스 유사 극소 바늘을 통해 전단에서 세포막의 기계적 파괴에 기초한다. 이 절차가 성공적으로 막 마이크로 도메인이 풍부 포유 동물 세포 배양에 적용되었지만, 유기체 (효모, 식물 세포)를 포함하는 세포 벽 응용 프로그램은보고되지 않았습니다. 메틸-β-시클로 덱스트린과 같은 스테롤 중단시키는 작용제와 함께 정량 프로테오믹스를 사용하여,이 식물 세포막으로부터 제조 DRM 분획 막 마이크로 도메인 (11)을위한 마커이다 단백질을 함유 않는 것으로 나타났다. 질량 분석 정량의 최종 결과에 대해서는, 그림 6에 나타낸 전형적인 결과에 이상적인 상황을 나타냅니다레이블과 레이블이 지정되지 않은 펩타이드의 대부분의 이온 강도는 동일 가까이에있다. 그러나 경우에 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 세트 사이 생물학적 변이의 특정 정도가 관찰 될 수있다. 따라서, 생물학적 처리하기 전에 레이블 또는 레이블이없는 세포 배양이 레이블과 레이블이 지정되지 않은 대조군 세포의 혼합물의 분석을 수행 하나, 모두 어떤 처리하지 않고, 하나의 상황에 이상적인 하나에서 발산 비율이 펩티드를 식별 할 수 있습니다. 분기 비율이이 단백질은 생물학적 변화를 표시합니다. 생물학적 변화의 구별 치료 효과의 도전을 극복하기 위해, 우리는 따라서 쌍 실험 (20)의 상호 표시를 사용하도록 제안한다. 역수 실험 구성에서,도 1에 제시된 것처럼 실험의 두 변형이 수행되고, 설명 된 프로토콜의 단계가 따른다. 그리고, P의 이온 강도 비를 비교이온 강도 비 사이의 차이가 생물학적 변동이나 도포 처리의 영향 등으로 인해 경우에 상호 실험 모두에서 roteins, 하나는 구별 할 수있다. 치료 효과 및 생물학적 변형을 구별하는 문제를 해결하기위한 또 다른 방법은 모든먼트 (31)에 대한 기준으로서 내부 표지 된 표준의 사용이다. 이 접근법에서, 표지되지 않은 제어 및 생물학적 처리를 받아야 표지되지 않은 세포를 동일한 배치에서 오는 무거운 표지 된 대조군 세포의 동일한 양으로 혼합된다. 그것은 14 N-제어 / 15 N-제어 및 14 N 처리 / 15 N-제어의 이온 강도의 비율이 현저하게 다른 경우 단백질이 중요한 것으로 간주되기 때문에, 펩타이드 비율에 생물학적 변화의 영향을 제거 할 수 있습니다. 표시 기준은 모든 경우에 동일한 같이이 가능합니다. 하나의 DR여기서 설명한 DRM 농축 절차 awbacks는 세제 저항 막 분획에서 식별 될 수 CO 정화 단백질이다. 저밀도 세제 저항 막 분획에서 식별 된 단백질의 목록에서, 우리는 정기적 리보솜 단백질의 다수를 관찰 할 수있다. 때문에 리보솜 단백질의 상대적으로 낮은 농도로, 이들은 자당 구배 스테롤 종속 막 단백질과 동일한 분획에서 이동한다. 그것은 리보솜 단백질이 명확하게 막 마이크로 도메인 (11)의 성분없는 의심없이 표시했다. 이러한 사실은 세제 저항 저밀도 막 분획과 관련이없는 다른 공동 정화 단백질을 제외하려면, 우리는 또한 두에서 낮은 덱스 트란 단계에서 추출 할 수있는 세포의 세포막 (IM)의 프로테오믹스 구성을 분석하는 제안 상 시스템과 내막과 DRM 간의 추정 오염물의 풍부한 비율을 비교할분수 (그림 5의 예 참조). DRM-공동 정화 단백질은 모두 분수 (IM 및 DRM)에 유사한 풍부함이 있어야합니다. 세포 추출물 및 막 마이크로 도메인 분획은 프로테옴 분석 (32)에 대해 샘플에서 복잡도를 줄이는 일반적인 방법이다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜은 식물 세포의 원형질막에 신호 전달 프로세스의 모든 연구에 유용하다. 생물학적 애플리케이션은 스트레스 반응뿐만 아니라 세포막 조성 및 막 단백질 14, 15의 변형 예에 변화를 유도하는 큰 정도 모든 병원체 감염 연구에있다. 스트레스 반응을 연구 외에, 다른 막 분획의 단백질 개체수의 정량 크게 아직 알 수없는 단백질 33 (34, 35)의 주석을 도움이 될 수 있습니다.

1972 년, 조나단 가수와 거스 니콜슨은 일반적으로 1960 년대 초에 허용 된 단백질 지질 단백질 샌드위치 모델을 교체, 유체 모자이크 모델에게 세포막의 구조 모델을 제안했다. 가수 니콜슨은 생체막 모든 지질 및 단백질 분자는 자유롭게하고 쉽게 확산 5 이차원 액체로서 고려 될 수 있음을 가정했다. 그때 이후로, 막 조성의 세포막 및 지식의 구조 모델은 더 복잡하게되었다. 특히, 세포막 내에 그러한 단백질 복합체 및 지질 / 스테롤 기반 구조적 무질서 같은 마이크로 도메인 구조를 관찰 할 수있다. 인공 모델 막을 6,7에서 스테롤과 스핑 고리 피드 가로 방향으로 변형 된 신체 기능과 영역을 형성하기 위해 다른 지질 종에서 분리 할 수 있습니다. 세포막 내에서이 분리는 주로 스테롤 높은 SA의 자기 연관 특성에 의해 발생합니다phopsho 및 스핑 고지 8 turated 탄화수소 사슬. 특히, 강성 스테롤 반지 엄격한 및 똑바로 포화 지질 종과 이들의 상호 작용이 막 두께와 경도를 증가, 더 확장 된 입체 형태로 이웃 탄화수소 사슬을 강제로와의 상호 작용을 선호. 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인의 일반적으로 관찰 된 기능 중 하나는 비 이온 계면 활성제 등의 트리톤 (Triton) X-100 BRIJ (35) 치료에 따라 자신의 불용성했다. 이 분획을 막 마이크로 도메인과 동일한 것으로 생각하고, 그들의 생화학 제조 방법 2에 따라 세제 저항 막 (DRM)라고했다. DRM 추출시 비이 온성 세제의 사용은 생화학 DRM 준비가 직접 사는 셀 (9) 내에서 특정 막 칸에 해당하지 않을 수 있으므로 약간의 비판을 받았다. 특히, 단백질의 비율 세제 등 준비에 중요한 것의 다른 세제뿐만 아니라 다른 세제 양의 세제 저항 막 분획 (10)의 다른 구성을 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 단백질의 종류는 특히 이러한 세포 스테롤이 풍부한 막 도메인과 연결하고,이 단백질이 잘 세제 저항 막 분수 (11)의 생화학 적 준비에 충실하는 증거가있다. 식물 DRM 분획에서 발견되었고,의 DRM에 존재 종속 스테롤했다하는 단백질의 핵심은, 이러한 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄 단백질 (FLAs) 및 SKU 단백질 가족의 일원으로, 특히 GPI-고정 단백질이었다. 또한 수용체 같은 키나제 또는 포스 포 리파제 등 일부 신호 단백질은 11 발견되었다. 이러한 결과는 포유류 막 마이크로 도메인 12,13 많은 프로테오믹스 연구와 일치한다. 또한 식물에 스트레스 반응 (14)의 맥락에서 막 마이크로 도메인의 역할에 대한 증거가 증가하고있다 -16. 여기에 설명 된 프로토콜은 세포막 분획의 마이크로 도메인을위한 강력한 방법을 제공하고, 특히주세요 스테롤 풍부한 세포막 구획 4,11,14의 스트레스 유도 변화를 묘사 할 수의 세제 농도의 단백질을 사용한다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

세포막 마이크로 도메인은 지질 및 스테롤 환경의 물리적 특성에 기초하여 기능하고 신호 전달 프로세스에서 특정 역할이있다. 프로테옴 분석을 위해 식물 세포에서 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인을 추출하면 여러 준비 단계 및 다른 세포 구획에서의 오염 물질에 대한 소스에 주로 어려운 작업입니다. 세포막은 식물 세포에있는 멤브레인의 단지 대략 5-20 %에 구성하고, 따라서 고순도 세포막 분획의 분리 도전적이다. 자주 사용하는 방법은 95 % (1)의 순도 세포막 소포를 산출 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스 트란의 수성 두 단계의 분할을 포함한다. 세포막 내 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인은 알칼리 pH에서 차가운 비 이온 계 계면 활성제 치료에 불용성이다. 이 세제 저항 막 분획은 초 원심 분리에 의해 대량 세포막으로부터 분리 될 수있다ucrose 그라데이션 2. 이어서, 단백질은 메탄올 / 클로로포름 침전 자당 구배 저밀도 대역으로부터 추출 될 수있다. 추출 된 단백질은 소화 탈염 마지막 LC-MS/MS 분석 트립신됩니다. 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인에 대한 우리의 추출 프로토콜은 애기 장대의 세포 배양에서 청소 세제 저항 막 분수의 준비를 위해 최적화되어 있습니다. 우리는 또한 3의 생물학적 처리 다음과 같은 정량적 인 비교 프로테오믹스 연구를위한 유일한 질소원으로 K 15 NO 3와 애기 장대 서스펜션 세포 배양의 전체 신진 대사 라벨을 사용합니다. 조인트 단백질 추출을위한 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 동등한 비율을 혼합하여 최종 정량 결과의 준비 단계의 영향은 최소로 유지된다. 또한 추출 중 물질의 손실은 제어와 같은 방법으로 처리 샘플 모두에 영향을 미칠 것이다D 따라서 빛과 올림 펩타이드의 비율이 일정하게 유지됩니다. 제안 된 방법으로 표시하거나 다른 컨트롤 4 역할을하면서 레이블이없는 세포 배양은 생물학적 처리를 거쳐 하나.

대사 적으로 표지 된 애기 세포 배양을 이용하여 제시된 프로토콜로는 식물 조직 (STEP2가, 2 및도 4)에서 원형질막을 분리하고, 세포막 내에 세제 저항 막 분획에 대한 풍부 할 수있다 (단계 3, 4 및도 5). 이어서, 프로토콜은 수있는 세제 저항 막 분획 (단계 4) 및 비교 프로테옴 분석 (단계 5)에 대한 단백질의 소화로부터 단백질의 추출. 마지막으로, 포스 포 (8 단계)의 선택적 농축은 세포 신호 전달 과정을 공부에 특히 흥미 롭다. 마지막 단계는 레이블과 레이블이없는 세포 배양에서 막 분획의 단백질 풍부 비율의 정량적 데이터 분석 (9 단계, 그림 6)입니다. 2 상 시스템 (단계 2) 및 이후 원심 혼합 후 전형적인 결과는 투명 착색 상부 위상 및 아르녹색은 낮은 단계 (그림 2) 색깔. 녹색 엽록체 및 다른 실내 막에서 막 소포가 낮은 덱스 트란 상에 통합하는 동안 플라즈마 막 소포는 우선적으로, 상부 PEG 단계로 연결합니다. 색 분리가 관찰 될 수없는 경우에, 2 단계가 제대로 수행되지 않았고 원형질막 내부 멤브레인 상당량의 오염 될 것이다. 세포막 단백질의 농축은 2 상 시스템의 하부 상에있는 세포막 분획 및 단백질의 작은 분취 량의 프로테옴 해석에 의해 도시 될 수있다. 하부상은 세포의 내막을 포함한다. 예를 들면, 수용체 키나아제 단백질로서 특히 대표적인 알려진 세포막 단백질은, 세포막 분획 (PM) 및 내부 멤브레인 (IM)를 함유하는 하층 분획 (도 4A)에서 낮은 풍부 높은 풍부 하였다. 높은 endoplasmatic 그물 쇼의 차례로, 알려진 단백질이너 막 분획의 풍부함은 세포막 분획 (도 4b)에서 관찰되지 않았다. 세제 저항 막 분수 (3 단계)의 후속 농축 이상적인 경우 저밀도 막 소포 튜브 높이의 약 2 / 10 일 (그림 3)의 우유 링의 형성에 발생합니다. 단백질 비율 (단계 3.2)에 트리톤 X-100의 농도 또는 세제의 조정이 세제 내성 및 세제 수용성 분획으로 분리를위한 최적의 경우에, 추가로 고리 그라데이션의 하부 부분에서 관찰 될 수 있고, 또한 멤브레인 클럼프있을 것이다 저밀도 밴드. 이러한 경우에, 단백질 비율 또는 전체 세제 양 세제 개의 멤브레인 도메인 분획의 분리를 재현하기 위해 필요한 임계 미셀 농도는 다르다. 단백질의 비율로 최종 세제 농도와 세제를 사용하여의 Enr에게, 여기에 설명같은 remorin 전형적인 마이크로 도메인 단백질의 ichment은 (AT3G61260) (27)는 DRM 분율의 비교 질량 분광 분석, 세제 가용 (단계 3.8)뿐만 아니라 미분 획 세포막 내부 막에 의해 확인 될 수있다. (그림 6A) 예상대로 remorin 단백질의 최고 풍부은 DRM 분수에서 발견되었다. 이러한 ABC 운송업자의 AT1G59870 (그림 6B)와 막 마이크로 도메인에 존재하지 단백질, DRM 분율의 증가 풍요를 표시하지 않습니다. 이러한 60S 리보솜 (그림 6D)에서 ATP 아제 F0 복합체 (그림 6C)와 리보솜 단백질 (At1G001100)에서 미토콘드리아 단백질 (AT2G07707) 등 또한 일반적인 오염 물질은 DRM의 분수에 풍부한 풍요를 표시하지 않는 최소한의 금액은 할 수 있지만 아직 확인 될 수있다. 혈장 단백질 인산화 상태를 질량 분석, 단백질 존재비 비율 야간레이블과 레이블이없는 세포 배양의 막 분획을 정량적으로 (그림 6)를 구별 할 수 있습니다. MSQuant (전형적인 결과 <a href="http://msquant.sourceforge.net/" target="_blank">msquant.alwaysdata.net</a> ) 정량 창은 확인 된 펩티드 (그림 6A)의 대부분을위한 1-1의 이온 강도 비율을 표시해야합니다. 이온 강도 비율이 크게 1:1 ~ 일탈과 그 펩티드는 차이가 레이블과 레이블이없는 세포 배양 사이에 규제로 간주, (그림 6C) 적용 처리에 의해 영향을받는 단백질에 일치하는 후보는있다. 성공적인 대사 라벨의 좋은 품질 관리의 공동 용출입니다 표지와도 6B와 D에 나노 HPLC 분리 (9 단계)에서 단일 피크 라벨이없는 펩타이드 버전을 그림과 같이 두. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig1.jpg"/&gt; 그림 1. 완전히 대사 레이블과 레이블이없는 A. thaliana의 세포 배양을 사용하여 실험적인 디자인의 두 가지 변종의 신진 대사 라벨링 실험 전략. 도식 표현. 실험 반대의 생물학적 처리 또는 받아야 제어 (대사 표시) 15 N 세포로 (레이블이없는) 14 N 세포를 사용하기로 결정 할 수 있습니다. 상호 실험 설계에서 두 변종은 병렬로 수행됩니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2.jpg" /> 그림 2. 엽록체 및 기타 인테리어 막은 BOTT와 연관된 반면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 덱스 트란에 기초하여 수성 개의 상 시스템에서 식물 막 소포의 분리를위한 워크 플로우. 세포막 소포가 상부 PEG 단계로 구분원심 분리 후 톰 덱스 트란 단계. 상부 상 밖의 세정 나은 정화를 달성 할 수 있고, 또한 재료 손실이 증가된다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3.jpg" /> 그림 3. 저밀도 막 분획을 농축 저밀도 세제 저항 막 분획의 농축을위한 자당 구배. 표현. 저밀도 막 소포 밴드 밤새 원심 분리 후 예상 위치가 표시된다. <img alt="그림 4" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4.jpg" /> 그림 4. 두 개의 상 시스템에서 정제 후 세포막 단백질의 농축. 노멀라이징원형질막 (PM) 및 내부 멤브레인 (IM) 분획으로 측정하고 단백질에 대한 단백질 이온 강도. (A) 원형질막의 전형적인 알려진 성분은 IM 분획에 비해 PM 분획에서 훨씬 더 풍부를 보여준다. 내부 막 (B) 천연 알려진 구성 요소 반대의 동작을 보여줍니다. 정상화의 경우, 각 단백질에 대한 이온 강도 합은 샘플 당 총 이온 강도의 분수로 표현 된 다음 회 반복 사이에 평균. 총 이온 강도의 분획은 다음 두 가지 치료법들 사이의 평균을 기준으로 표현 하였다. 오차 막대가 독립적으로 성장 세포 배양에서 세 가지 준비의 표준 편차를 나타내는 것은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig5highres.jpg" sRC = &quot;/ files/ftp_upload/50535/50535fig5.jpg&quot;/&gt; 그림 5. . 측정 분수 내에서 표준 단백질 마커의 풍부한 플롯은 특정 세포 내 구획을 선택 단백질 마커 (- 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인, PM - 세포막, IM - 내부 세포막, SP - 수용성 단백질 DRM)의 정규화 된 단백질 이온 농도의 분포를 나타냅니다. (A) remorin 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인에 대한 마커로, (B) ABC 형 수송 가족 단백질 스테롤 의존하지 단백질의 대표로서, (C)의 미토콘드리아 F0 복합체의 서브 유닛 (D) 60 년대의 풍요 패턴 일반적인 공동 정화 오염 물질 등의 리보솜 소단위. 정상화의 경우, 각 단백질에 대한 이온 강도 합은 샘플 당 총 이온 강도의 분수로 표현 된 다음 회 반복 사이에 평균. 총 이온 강도의 분획은 다음 두 개의 누 사이의 평균을 기준으로 표현되었다tments. 오차 막대가 독립적으로 성장 세포 배양에서 세 가지 준비의 표준 편차를 나타내는 것은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig5large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6.jpg" /> 그림 6. 분명히 펩타이드 DNNLLGK의 레이블과 레이블이없는 애기 장대 세포. (A) 전체 검사 스펙트럼에서 단백질 추출물의 1:1 혼합물로부터 펩타이드의 예상 1시 1분 이온 강도 비율을 보여주는 MSQuant에서 양적 단백질 질량 분석. 스크린 샷의 예상 결과 분리 (오른쪽 피크) 표시 및 M / Z 축에 펩티드의 레이블 (왼쪽 피크) 버전. 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 질량과 최초의 동위 원소는 파란색 표시로 표시됩니다. (B) 레이블 (블루)나노 HPLC 크로마토 그래피 동안 단일 피크로 펩타이드 공동 용출의 D 레이블 (빨간색) 버전. (C) 차등 규제 단백질 후보로 1:5 이온 강도 비와 펩타이드의 전체 검사 스펙트럼. (D ) 또한 역상 크로마토 그래피 1:1 공동 용출 다른 비율과 단백질. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

14.0K 조회수.  Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology.  여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다. 

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Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot 분석

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

연구

생물학

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

에서 초기 단계의 배아의 효율적이고 신속한 분리<em&gt; 애기 장대</em&gt; 씨앗

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...