우리 감사는 연구소에서 Silke Classen 생태계 분석 및 평가 (gaiac), RWTH 아 헨이이 프로토콜에 사용 되는 그룹-특정 뇌관 세트의 설립에 있는 그녀의 원조에 대 한. 우리는 또한 감사 피터 마틴과 협력에 대 한 Kiel의 대학에서로 라 Schynawa 물 진드기 실험에. 우리는 또한 원활 하 게 실행 하 고 회사와 카탈로그 번호의 등록을 준비 하 고 실험실 유지에 대 한 기술 실험실 조 수를 감사 합니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG; 프로젝트 GE 2219/3-1)에 의해 지원 되었다.

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저자는 공개 없다.

여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 피하기 위해 결정적 이다. 크로스-샘플 오염 먹이 DNA의 거짓인 긍정적인 탐지를 이어질 수 있습니다, 하는 동안 창 소재는 거의 실종으로 이어질 수도 있습니다 콘텐츠 손실 먹이 종의 소비. 각 소 단위 및 분석 (제 2의 프로토콜) 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성에 속하는 rDNA의 존재의 확인은 소비 하는 먹이 대 한 대표적인 정보 수집을 위한 필수적입니다. 이것은 특히 중요 한 소비자 먹이로 되어 먹이 그룹의 아무 DNA 검출된25,27수 경우에. 또한 PCRs (3.1, 5.1.1, 5.1.2 단계)를 준비할 때 그 혼합물 및 정확 하 게 사용 하는 프로토콜 각각 뇌관 taxa의 특정 그룹에 지정 된 조건에 맞는 결정적 이다. 그렇지 않으면, PCR 반응 내에서 DNA의 증폭, 완전히 실패할 수 있습니다 하거나 하지 대상으로 하는 taxa의 DNA도 증폭 될 수도 있습니다. 따라서, 그것은 긍정적인 사용 의무 고 각 PCR 부정적인 컨트롤 실행 보장 PCR 반응에 근무 하 고 아무 오염 발생. 또한, 각 PCR 실행에 대 한 샘플의 배열 각각 소비자 견본을 소비 하는 먹이의 정확한 할당 수 있도록 정확 하 게 문서화가 필요 하다. 이 작업에 대 한 특정 주의 자동된 조각 분석 (5.2.3 단계)를 통해 여러 먹이 그룹의 병렬 검출을 위한 PCR 제품을 풀링 하는 동안 이동 해야 합니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 (3.2 및 3.3 단계) agarose를 사용 하 여 증폭 된 파편의 탐지를 위해 젤 가능한 얇은 고 낮은 시각 해상도 조각 누락 방지 하려면 이미지의 시각적 검사를 관리 했다. 결과 소비자에 의해 먹이 소비에 대 한 적절 한 결론, 그것도 거의 소비 먹이 taxa를 인식 되 고 있다 중요 하다. 두꺼운 agarose 젤 먹이 DNA의 잠재적으로 낮은 금액의 가시성을 축소 하 고 이렇게 거의 소비 먹이 놓치지 소개 분석에서 도출 하는 결론에 불확실성을 확률을 감소 시킨다. 또한, 건강의 관점에서는 젤을 얼룩이 지기 위한 ethidium 평범한 사람 보다 덜-또는 비-독성 대안을 사용 하 여 수 있습니다 것이 좋습니다. 이후 추가 분석을 위해 하류 SSCP 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여를 통해 증폭 된 파편의 프로토콜 특정 주의 하 여 수행 해야 하는 몇 가지 단계가 포함 됩니다. 그것은 중요 한 조립 젤 카세트 누출 방지 (4.1.3 단계) 이며 polyacrylamide 솔루션은 완전히 유해를 충분 한 시간을 부여 (4.1.6 단계). 카세트를 너무 일찍 열기 액체 아크릴 솔루션을 유출 하 고, 준비, 광범위 한 청소도 할 수 있어야부터에서 시작 하는 사실에도 불구 하 고 이어질 것입니다. 또한, 얼룩 목욕 (단계 4.7)으로 UV 테이블 (단계 4.8) 요구 해야 할 매우 신중 하 게 이러한 젤의 불안정성 때문에 거기에서 polyacrylamide 젤을 전송 합니다. 그렇지 않으면, 젤 수 찢 어 하 고 절차를 반복 하는 필요성에 이르게 조각 중단 될 수 있습니다.
성공적으로 자동화 된 조각 분석에서 받은 데이터를 처리에 대 한 주요 요구 사항 중 하나는 샘플의 내부 크기 표준에 일치 크기 표준 패턴의 결정 수 있도록 (단계 5.3.3) 제조 업체에 의해 주어진 그는 적절 한 조각 길이입니다. 그렇지 않으면, 다른 조각, 같은 형광 염료, 얼룩으로 표시 잘못 먹이 taxa에 할당 될 수 및 따라서 약탈자 먹이 상호 작용의 완전 한 오판으로 이어질 때문에 특히 중요 한 방법입니다. 또한, electropherograms는 종종 배경 잡음을 표시합니다. 해석에 자신감을 설정 하기 위해 내부 크기 표준의 봉우리는 샘플의 배경 잡음 보다 상당히 높은 필수적 이다. 따라서, 각 마커/뇌관에 대 한 봉우리 배경 잡음 보다 크게 높은 경우 계산만 한다.
내 관심의 다양 한 소비자의 먹이 taxa의 여러 그룹을 감지 하이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 명백 하 게, 그룹-특정 뇌관 않을 수 있습니다 이미 관심의 모든 잠재적인 먹이 taxon에 사용할 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그룹-특정 뇌관 여러 민물 macroinvertebrate taxa28, 뿐만 아니라 다른 taxa의 광범위 한 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 여러 해양 macroinvertebrate taxa16,30 과 일반적인 taxa31곤충 비행). 따라서, 그룹 특정 뇌관의 선택 세트 주어진된 taxon의 모든 먹이 종의 DNA 증폭에 적합 하지만 하지이 taxon에 속하는 종에서 DNA의 증폭에 성공, 필수32하지 않습니다. 사용할 수 있는 많은 그룹-특정 뇌관 taxa (예를들면, 라인 시스템28에 일반적인 민물 macroinvertebrates의 130 taxa)의 주어진된 범위에 지정 되었습니다. 따라서, false 네거티브 또는 허위-긍정적인 결과 방지 하려면 같은 뇌관의 특이성 해야 될 다시 확인 대상 taxa 및 소비자에 대 한 taxa의 범위에 포함 되지 않습니다에 대 한 그들의 응용 전에 관심의 생태계에서 일반적인 taxa의 범위에 대 한 이 프라이 머를 설립 했다. 또한, 그 분자 분석은과 결합 될 경우 위장의 정확한 동일한 개별, 해 부의 다른 분석 생략 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고, 더 큰 표본의 위장을 해 부 또한 너무 많은 재료 때문에 DNA 추출의 실패를 방지 하 고 소비자-DNA 샘플 추출에서의 존재를 감소. 그러나, 연구는 특정 차단 뇌관을 사용 하는 소비자의 DNA를 연결 하 고 그로 인하여 차단, PCR 반응에 대 한 효과적으로 향상 시킬 수 있는 혼합된 샘플33에서 희소 한 순서 증폭 나타났습니다. 따라서 위장의 해 부 피할 수 있습니다, 더 큰 소비자 표본 처리 하는 경우에 특정 차단 뇌관의 사용에 의해. 병렬 검색 amplicons 자동된 조각 분석을 통해 여러 그룹 특정 뇌관 세트에서 파생 된의 레이블로 염료를 얼룩이 지기의 선택에 배려를가지고 한다. 따라서, 뇌관 세트 대략 동일한 길이의 단편 증폭 명확 하 게 구별할 수 형광 염료 이라는 한다. 또한, 여러 제조 업체에서 사용할 수 있는 모 세관 전기 이동 법 시스템의 범위가 있다. 이러한 시스템 중 일부는 살 일 걸 요도 난다 염료를 통해 여러 조각의 결정을 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜 수 쉽게 감지 시스템의 증폭 된 파편을 조정할 수 있습니다. 그 외에, t에 필요한 시간을 줄이기 위해그 분석, 최적화 하는 동시에 조각 하나의 분석 배치의 먹이 그룹의 DNA를 증폭 한 멀티플렉스 PCR 분석 실험 수 있을 것 이다 (예를 들어, 동시 증폭 12 먹이 생물 딱정벌레34 의 또는 6 비행의 곤충 taxa31)입니다.
단점이 직감 콘텐츠 분석 일반적으로, 그리고 그러므로 또한이 프로토콜에서 설명 하는 분석은 낮은 시간적 해상도. 이러한 방법으로 단일 먹이 유기 체2의 중요성에 불확실성으로 이어질 수도 있는 최근에 섭취 유기 체를 식별 수는. 그러나, 우리는이 프로토콜에 따라 유전자 분석은 정확한 동일한 소비자 표본25,27의 안정 동위 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 쉽게 결합 될 수 있다 설명 했다. 한 시간 통합 자연 추적기 약탈자 먹이 상호 작용의 안정 동위 원소 분석은 식품 웹 구조1, characterise에 자주 사용 하지만 종종 다른 먹이 종에서 잠재적인 겹치는 동위 원소 값 방해는 정확한 약탈자 먹이 상호 작용2의 정의입니다. 따라서 식품 웹 및 영양소 또는 에너지 플럭스와의 관계에 대 한 우리의 이해 더 각 방법의 단점을 극복 하 안정 동위 원소 분석에 유전자 분석을 위해이 프로토콜 사용.

약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 1. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계2사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물3의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)4의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.
영양 관계를 추적 하는 것은 어려운 복잡 한 시스템에서 이후 몇 가지 방법은 설립 되었습니다를 사용 하는 필드5에 있는 상호 작용을 먹이의 평가. 전통적으로, 조사 분야에서 상호 작용을 먹이 기의 해 부 용기에 먹이 남아의 시각적 식별에 기반 하 고 형태 론 적 먹이 다양성에 대 한 광범위 한 지식이 필요로. 비주얼 직감 콘텐츠 분석 소비자 (예: 계절 변화 다이어트에 랍스터6 와 물고기7,8 또는 먹이 환경 설정의 copepods의)의 여러 그룹의 리소스 사용에 대 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 소화의 물리적 과정 시각 직감 콘텐츠 분석 어려운 만들고 일반적으로 소프트 바디 먹이 유기 체9를 그리 워 합니다. 액체 섭취에 의해 먹이 종에 대 한 또는 집중적으로 그들의 음식 섭취, amphipods, 같은 전에 comminute 몇몇 무척 추 동물 소비자에 대 한 본질적인 내용에 먹이 종의 시각적 식별 불가능 한10입니다. 이러한 제한으로 인해 분자 분석 유망한 대안을 제공합니다.
분자 분석 이제 본질적인 내용에 신속 하 고 정확한 먹이 탐지를 허용 하는 일반적인 도구 되고있다. 이러한 기술의 범위는 다양 한: 단일 클론 항 체 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 근거를 둔 전략은, 때문에 자주 사용 그들의 높은 특이성 및 감도11. 새로운 단일 클론 항 체의 개발은 시간 및 비용 집중, 그러므로, 다른 분자 기술에의 응용 프로그램은 더 유용 항 체11를 이미 존재 하지 않는 경우. 또 다른 일반적인 접근은 보편적인 뇌관을 사용 하 여 대부분의 종에서 존재 ribosomal ribonucleic 산 (RNA) 유전자 처럼 deoxyribonucleic 산 (DNA)의 증폭 세트12,13이다. 이 기술을 사용 하 여, 그것 불가능 자주 DNA14의 혼합된 소스 내에서 먹이 생물의 전체 범위를 식별 합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 효과적인 접근 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 유전 직감 콘텐츠 분석에 대 한 설정입니다. 특정 대상 그룹의 DNA 영역만을 증폭 하 고 모든 다른 종15,16제외 하도록 설계 된, 그룹 전용 프라이 머 사용 없이 지정된 된 그룹의 분류학 수준에 먹이 생물의 식별 시간 및 비용 집약적인 보조 분석입니다. 그러나, 모든 콘텐츠 분석 직감, 같은 같은 분석만 먹이 행동의 스냅샷을 제공 합니다. 따라서, 분석 시간 통합 자연 추적기 (예를 들어, 안정 동위 원소)의 분자 용기 콘텐츠 분석을 결합 하는 것은 유익한1,2간주 됩니다.
여기, 약탈자 먹이 상호 작용 동일한 견본의 안정 동위 원소 분석 결합 될 핵 ribosomal DNA (rDNA) 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 PCR 기반 조사에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법을 통해 단일 먹이 그룹의 DNA의 탐지를 설명합니다. 또한, 선물이 해당 같은 그룹-특정 뇌관의 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석 기회 뇌관 특이성 보다 높은 분류학 해상도 필요할 때마다. 때문에 단일 좌초 DNA (ssDNA) 양식 3 차 conformations 그들의 기본 시퀀스17에 의해 결정 되는 조각, 조각 같은 그룹-특정 뇌관에 의해 증폭에 작은 변화 구조적 변화에 이어질. 이러한 변화는 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤17,18, 먹이 생물 (종 수준)의 더 정확한 id를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.
Agarose 젤 전기 이동 법 DNA 파편을 시각화 하 고 그들의 대략적인 길이19, 해상도 결정 하는 일반적이 고 저렴 한 도구는 DNA의 금액에 따라 달라 집니다 및 착 색 염료 사용20동안에. 일반적으로, 시각화는 곧장 앞으로 순수한 DNA 샘플을 작업할 때 하지만 잠재적으로 낮은 양의 먹이 소비자의 본질적인 내용에 DNA agarose 젤 전기 이동 법 결과의 점수 복잡 수 있습니다. 아직도,이 검색 메서드는 가능한 한 낮은 필드에서 소비자 표본 수를 화면 또는 몇 먹이 그룹, 하지만 점수에 합병증 샘플의 높은 숫자의 심사 여러 먹이 taxa 매우 시간이 집중 따라서 불가능. 더 민감한 검출 방법의 조각 조각21의 정확한 길이 결정 있습니다 모 세관 전기 이동 법을 통해 자동화 된 분석 이다. 여러 microsatellite 기반 연구 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 그것이 감지 하 여 자동된 조각 분석22,23에 의해 다른 파편의 유사한 길이 결정 24. 따라서, 우리 또한 현재 여러 먹이에서 DNA의 병렬 검색에 대 한 자세한 프로토콜 레이블된 그룹-특정 뇌관 세트와 자동화 된 시퀀서와 자동된 조각 분석을 통해 감지 PCR를 사용 하 여 그룹. 또한, 우리는 자동된 조각 분석을 통해 먹이 DNA의 검출 방식은 또한 섭취 한 먹이의 상대 정량화를 가능 하 게 보여주는 사례 연구에서 결과 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>liquid nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml reaction tubes - Safelock</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40d</td>
			<td>This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5</td>
			<td>Bioform</td>
			<td>B40b</td>
			<td>This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA-ExitusPlus</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7409,1000RF</td>
			<td>Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fuzz-free paper towel</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>Precision needs to be at least 0.01 g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 2.0 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2165</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-2164</td>
			<td>It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride &#8805;99.5%, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>3957.3</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 &#956;L)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td>For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid &#8805;99.8 %, p.a., ACS, ISO</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6943.2</td>
			<td>For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4360.1</td>
			<td>For extraction of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K lyophil.</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>7528.1</td>
			<td>Prepare a working solution containing 10 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>Bead mill for homogenization of the samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Beads, 5 mm</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>For homogenization of samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Thermoshaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>NA</td>
			<td>Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6752.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.8 %, p.a.</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Molecular biology grade (ddH2O)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A7398,1000</td>
			<td>nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unmodified Olegonucleotides</td>
			<td>Eurofins MWG Operon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers unlabeled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified olegonucleotides</td>
			<td>Metabion International AG</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers labelled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGOLD Taq all inclusive</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>01-1000</td>
			<td>Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 96 Well PCR Plates</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-2879</td>
			<td>Used for PCR reactions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>732-3223</td>
			<td>Cap stripes used to close the PCR plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td>Used for gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical flask</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Power Supply PS3002</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution 1 %</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>2218.1</td>
			<td>Used to prepare staining bath for agarose gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>6749.1</td>
			<td>Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromphenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3640.0010</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>4621.1</td>
			<td>Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp-DNA-Ladder extended</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>T835.1</td>
			<td>As size standard for agarose gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Documentation system</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>To visualize gel electrophoresis results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>A121.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxydisulphate</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>9592.2</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>foldback clips (32 mm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square-shaped plastic box (21 &#215; 6.5 &#215; 5 cm)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>carlroth</td>
			<td>23.67.1</td>
			<td>For the preparation of polyacrylamid gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC 10 Digital chiller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0138</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-2361</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notched glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0261</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank glass plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0260</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0262</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Comb with 25 teeth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>730-0294</td>
			<td>For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking platform</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td>For constant shaking of the staining bath.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850535 (50535)</td>
			<td>For staining of polyacrylamide gels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608098</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608095</td>
			<td>For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Loading Solution (SLS)</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608082</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>6551</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate centrifuge, PerfectSpin P</td>
			<td>VWR Peqlab</td>
			<td>NA</td>
			<td>mini plate centrifuge used to spin down PCR products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9017</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenomeLab Seperation buffer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608012</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation Gel - LPAI</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>608010</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>NA</td>
			<td>For automated fragment analyses.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMarker V1.95</td>
			<td>Softgenetics</td>
			<td>NA</td>
			<td>To analyze results of automated fragment analyses.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory protocol for genetic gut content analyses of aquatic macroinvertebrates using group-specific rdna primers

음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ15N 그리고 δ13C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.

우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시.
예를 들어, 저자28 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는 먹이 실험 실시 했다. 포식 자와 먹이로 체니스 종 애벌레로 Dikerogammarus villosus 의 개인 라인 backwaters 카를스루에 (독일) 근처에서 체포 했다. 실험실에서 포식 자와 먹이 taxa는 20 ° C에서 필터링 된 스트림 물에 별도로 보관 했다 하 고 36 시간 동안 굶 어 했다. 실험에 대 한 amphipod 표본 필터링 된 스트림 물 (100 mL) 개별적으로, 30 분, 2 ~ 3 체니스 애벌레 먹이 하 고 그 후 액체 질소에서 냉동 비 커에 배치 했다. 각 디 villosus 의 위장 이었다 해 부 그리고 DNA 프로토콜 1에 설명 된 대로 추출 되었다. DNA 추출 물 Caep28S 뇌관 체니스 종 프로토콜 3에 설명 된 대로 적절 한 PCR 프로토콜28 를 사용 하 여 검출에 적합 한 설정으로 테스트 되었습니다. 증폭 된 파편 체니스 종 간의 차이 확인 하려면 PCR 콘텐츠 샘플 용기와 순수한 DNA 샘플 3 체니스 참조 종의 실시 됐다. Agarose 젤 전기 영동이이 유형의 전기 이동 법 (그림 2A)와 체니스 종 사이 구별 될 수 없는 두 배 좌초 DNA의 단일 밴드를 이끌어 반면, SSCP 젤 전기 이동 법, 프로토콜 4에 설명 된 대로 했다 참조 샘플 (그림 2B)와 창 자 콘텐츠 샘플을 비교 하 여 종 수준 먹이 생물을 식별할 수 있습니다. SSCP 조각 패턴 3 참조 taxa 체니스 beskidensis (그림 2B, 레인 1), (그림 2B, 레인 2) 체니스 시간대 의, 와 체니스 luctuosa (그림 2B, 3 차선) 미분 가능 패턴 4 밴드의 구성 되어 있습니다. 2 창 자 콘텐츠 샘플 (그림 2B, 레인 4와 5) C. luctuosa (그림 2B, 3 차선)의 동일한 조각 패턴을 했다. 세 번째 창 콘텐츠 샘플 (그림 2B, 6 레인)의 조각 패턴 C. 시간대 (그림 2B, 레인 2)와 동일 했다. 두 시퀀스 분석 직감 콘텐츠 샘플 C. luctuosa , C. 시간대 (그림 2B, 4와 6 차선)로 식별 하 고 해당 참조 종이이 결과 확인 (전자 보충 맞춤 fasta 파일 참조).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56132/56132fig2.jpg"> 
그림 2: (A) agarose 젤 전기 이동 법의 원본 이미지와 PCR의 (B) SSCP 분석 콘텐츠 직감의 조각 하 고 참조 샘플 Caep28S 뇌관 세트와 증폭. 차선 1-3 종의 체니스 beskidensis (1), 체니스 시간대 (2)와 체니스 luctuosa (3) 참조 샘플을 표시합니다. 레인 4-6 amphipod Dikerogammarus villosus 의 다른 창 콘텐츠 샘플의 조각 패턴 되 게 됩니다. 레인 7 100 bp DNA 사다리의 조각 패턴을 보여 줍니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56132/56132fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
또한, 실험실 실험 진드기 종 Hygrobates fluviatilis 에 속하는 chironomid에 먹 힌 물 애벌레 뿐만 아니라 결정 물 진드기에 소비 chironomid 개인의 DNA를 감지할 수 경우에 실시 그러나 또한 DNA 검출의 양을 먹이29의 소비 이후 경과 시간에 따라 테스트 하. 진드기 약 1 주일 배 고 파, 후 각 진드기는 음식으로 한 chironomid 애벌레를 제안 되었다. 각 3-4 물 진드기 개인 (절대) 1에서 dipteran 가족 Chironomidae28 에 특정 Chiro18S 뇌관 세트를 사용 하 여 유전 분석을 위해, 에타 놀에서 2, 3, 7, 9, 24, 32, 50 h29를 먹이 되 고 후 고정 했다. 정도의 물 진드기 개인 소비로 각각 먹이 개인 다음 5 먹이 범주에 분류 되었다: 1 = 완전히 비운, 밖으로 완전히 빨려 외피 (&#62; 90%), 2 = 거의 완전 하 게 밖으로 빨려 (&#62; 75-90%), 3 = 밖으로 빨려 하는 세미 (&#62; 50-75%), 4 = 부분적으로 밖으로 빨려만 (&#62; 5-50%), 5 = 먹이 몸 구조 (≤ 5%)29에 보이는 변화. DNA (1.2.1, 1.2.2 단계) 없이 프로토콜 1에 설명 된 대로 물 진드기에서 추출 된 고 프로토콜 2에 설명 된 대로 추출에 18S rDNA의 존재와 서식 파일의 기능 효율성 확인 했다. DNA 프로토콜 4만 Chiro18S를 사용 하 여 뇌관 앞으로 뇌관 설정 표시에 따라 수행 하는 먹이의 탐지는 형광 염료 ( 표 2참조)와 DNA 크기 표준 키트-400. 샘플 사이의 비교 분석 자동화 된 시퀀서, 샘플 피크 높이의 피크 높이 사이 비율의 다른 실행 내에서 수 있도록는 내부 기준에 가장 가까운 (즉, 360이 경우에서 혈압) 각 샘플의 계산 하 고 사용 했다 감지 하는 DNA 양을 프록시입니다. 결과는 chironomid DNA Hygrobates fluviatilis chironomid 애벌레29에 먹이의 거의 모든 개인에서 감지 되었다 보여주었다. 긴 기간 짧은 간격 (1 시간 수 유 후)에서 후 먹이 (50 시간) 감지 먹이 DNA의 상대적인 양을 크게 감소 (그림 3A)29. 또한, DNA 수 먹이의 섭취 금액에 대 한 프록시 수 유 후 시간과 먹이 분류 사이 관계 확인 (그림 3B)29. 감소 먹이 시간 후 가장 가능성이 먹이 발견 DNA DNA의 저하와 먹이의 소화에 의해 완전히 반영의 egestion 먹이 DNA 때문에 물 진드기29항문의 부족으로 인해 매우 그럴 듯 하 게 하지 않습니다. 이러한 결과 섭취 한 먹이의 정량화를 위한이 방법의 적합성을 확인합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56132/56132fig3.jpg"> 
그림 3: 진드기 및 (B) 먹이 카테고리의 먹이 후 시간 국가 ln 높이 비율 (샘플 최대 높이/표준360 피크 높이) 및 (A) 간의 관계 (n = 23). "실험 및 적용 Acarology의 첫 검출 DNA Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari)에 먹이: 물 진드기에 포식 자-먹이 관계를 결정 하기 위한 새로운 접근 67, 376, P. 마틴, M. Koester, L. Schynawa, R. Gergs, (© 스프링 거 국제 Switzerl 게시그리고 2015) "Springer의 허가로. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56132/56132fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
Δ13C의 침략 amphipod D. villosus 필드, 집중 안정 동위 원소 분석에 의해 포식의 중요성 및 δ15조사 하 디 villosus 및 잠재적인 음식 자원의 N 분자에 의해 발전 했다 정확한 동일한 개인의 본질적인 내용 최근 섭취 한 먹이의 탐지. 총에서 206 D. villosus 개인 다른 사이트에서 수집 된 하 고 각 개인의 위장 했다 해 부 프로토콜 1에 따르면 DNA 추출 되었다. 존재와 사용 하는 서식 파일의 기능 효율성 프로토콜 2에 설명 된 대로 안심 했다. 여러 macroinvertebrate 먹이 taxa에 D. villosus 개인에 의해 최근 포식 프로토콜 4에 설명 된 대로 테스트를 했다. 전반적으로, D. villosus 본질적인 내용의 16%만 16 대상된 macroinvertebrate 먹이 taxa의에 속하는 DNA에 대 한 긍정적인 테스트 하 고 따라서 낮은 predacious 먹이 행동을 표시 하는 안정 동위 원소 분석의 결과 지원 필드27침략 amphipod. 반면, 유전자 분석, 내 12 테스트 먹이 taxa의 DNA 1 창 콘텐츠 샘플에서 발견 되었다, 4 다른 먹이 taxa의 DNA 발견된 (그림 4)27못했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56132/56132fig4.jpg"> 
그림 4: 디 villosus 개인 본질적인 내용이 macroinvertebrate에 대 한 양성 하는 모든 10 개의 사이트에서 각각 수를 보여주는 히스토그램 먹이 DNA. PCR 수행 되었다 16 그룹 특정 뇌관 세트와 같이. "Hydrobiologia, 라인 시스템 '살인자 새우' Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae)은?, 768, 2016, 310, Koester Meike, 바이엘 바스 티, Gergs 르네 (© 스프링 거 국제 게시 스위스 2015)"의 허가 스프링 거입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56132/56132fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 파일. Sequence_alignement_feeding_trial.fasta <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56132/Sequence_alignement_feeding_trial.fasta" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

laboratory-protocol-for-genetic-gut-content-analyses-aquatic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K 조회수.  University of Koblenz-Landau. Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

비디오: Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.