Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

우리는 원고를 비판적으로 읽었던 J. Vaughen에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가신 교부금 번호 26891025, 15H01500 및 YT에 대한 다케다 과학 재단 연구 보조금의 교부금으로 지원되었습니다

1. 십자가 비행 및 유도 유도 <ol><li> 처녀 파리를 수집하기 전에 유리 병에서 모든 파리를 12 시간 안에 제거하십시오. </li><li> CO 2 가스를 주입하고 파리를 CO 2 플라이 패드 위에 놓아 바이알의 파리를 마취시킵니다. </li><li> CO 2 플라이 패드의 10 - 20 명의 처녀 암컷과 10 명의 수컷을 신선한 유리 병으로 옮기고 25 ° C에서 1 일 동안 품어 라. </li><li> 이들 파리를 신선한 유리 병에 옮기고 25 ° C에서 12 시간 동안 품어 낸다. 참고 : 처녀 암컷은 첫날에 충분한 알을 낳지 않으므로 첫 번째 약병을 폐기하십시오. </li><li> 인핸서 GAL4 라인 들어, 성인 파리를 제거하고 25 분 해부 때까지 바이알을 품어. </li><li> 플립 아웃 GAL4에 의해 모자이크 클론의 유도에 대한 성인 파리를 제거하고 25에서 2 ~ 4 일 동안 유리 병을 품어 ° C. 열 충격 이전의 배양 시간은 실험 목적에 달려있다. 난자 채취 2 일 후 열충격 (AED)은 미성숙 한 두 번째 날에 모자이크 클론을 생성한다상상 상피를 형성한다. 3 또는 4 일 후 열 충격은 분화 된 조기 - 중반 - 셋째 inst 상상 세포에서 모자이크 클론을 생성합니다. 참고 : 종양 생성 성 표현형에 대한 열 충격 타이밍의 변화를 조사하는 것이 중요합니다. </li><li> 플립 아웃 GAL4에 의한 모자이크 클론의 유도를 위해 25 ℃에서 2-3 일 동안 배양 한 후 10-45 분 동안 37 ℃의 수조에 침지시켜 바이알을 가열 충격을가한다. 참고 : 각 실험에서 열 충격 시간, 시간 및 배양 시간에 대한 정보는 그림 범례에 표시되어 있습니다. </li></ol> 2. 애벌레의 해부 <ol><li> 형광 입체 현미경하에 적절한 형광 마커 ( 예 : EGFP)에 의해 나무 막대기 또는 무딘 집게와 genotype 그들 방황 셋째 instar 애벌레를 수집하고 PBS (인산염 완충 식염수)와 해부 접시에 그들을 놓으십시오. </li><li> 2 ML 플라스틱 전송 pipettes와 pipetting하여 PBS에 애벌레를 씻으십시오. </li><li>하나의 집게로 유충의 중심을 꼬집어 다른 집게로 반으로 몸을 찢어. </li><li> 하나의 집게로 앞쪽 절반의 입 갈고리를 집어 넣고 다른 집게로 몸쪽으로 입을 밀어 내면 몸을 밖으로 내 보냅니다. </li><li> 타액선과 같은 불필요한 물질이나 집게로 지방을 제거하십시오. </li></ol> 3. 고정 및 항체 염색 <ol><li> 1.5 ML 플라스틱 튜브에 유충 본문 (상상의 날개 디스크를 포함하여)의 해부 전방 절반을 전송하고 부드럽게 회전과 어둠 속에서 실온에서 10 분 수정 솔루션 (PBS에 4 % 포름 알데히드) 1 ML에 수정. 주의 : 포름 알데히드는 독성이며 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑 및 의복을 착용하십시오. 참고 :이 부분에서는 다르게 표시되지 않는 한 어두운 곳에서 실온에서 nutator를 사용하여 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 수정 솔루션을 제거하고 버립니다. 조직을 1 mL의 PBT (0.3 % TritPBS 중 X-100)로 15 분씩 각각 3 회 세척한다. </li><li> PBT를 제거하고 실온에서 1 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새도록 블로킹하고 절식하기 위해 PBTG (PBT 중 0.2 % 소 혈청 알부민 및 5 % 정상 염소 혈청) 1 mL를 첨가한다. </li><li> PBTG를 제거하고 PBTG로 적절히 희석 한 1 차 항체 용액을 첨가하고 ( 재료 표 참조) 4 ° C에서 밤새 숙고시킨다. </li><li> 1 차 항체 용액을 제거하고 PBT 1 mL로 각각 15 분씩 세 번 세척하십시오. </li><li> PBT를 제거하고 PBTG (1 : 400)로 적절히 희석 한 2 차 항체 용액을 첨가한다. 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 누 ate다. </li><li> 2 차 항체 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT 1 mL로 조직을 두 번 씻는다. </li><li> F - 굴지를 얼룩이려면, PBT를 제거하고 PBS (1:40)에 적절히 희석 Phalloidin 솔루션을 추가합니다. 그런 다음 20 분 동안 타다. Phalloidin 용액을 제거하고 PBT 1 mL로 각각 15 분씩 두 번 세척하십시오. </li><li> 핵 DNA를 counterstain하려면 PBT를 제거하고 DAPI (4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole) 솔루션 (PBS에 0.5 μg / ML DAPI)을 추가합니다. 그런 다음 10 분간 타다. 주의 : DAPI는 발암 가능성이 있습니다. 피부 접촉을 방지하기 위해 보호 장갑 및 의복을 착용하십시오. </li><li> DAPI 용액을 제거하고 각각 15 분 동안 PBT 1 mL로 두 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 실온에서 10 분 동안 PBS 1 mL에서 한번 씻어 낸다. </li><li> PBS를 제거하고 미리 장착 매체로 100 % 글리세롤 500 μL를 추가합니다. </li></ol> 4. 현미경 슬라이드에 장착 <ol><li> 2 ML 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 현미경 슬라이드에 스테인드 조직을 놓으십시오. </li><li> 집게와 다른 현미경 슬라이드에 장착 매체의 방울로 조직을 전송합니다. </li><li> 하나의 집게로 해부 조직의 끝을 잡고 다른 집게로 두뇌와 눈 antennal 디스크를 당겨. 참고 : 해부 된 뇌를 날개의 상상 디스크 근처에 두도록하십시오.. 두뇌는 coverslip가 날개 imaginal 원판을 분쇄하는 것을 막는 플래트 홈으로 작동합니다. </li><li> 날개 imaginal 디스크를 분리하기 위해 하나의 집게로 해부 조직의 끝을 누르고 부드럽게 몸 포획 벽을 긁고 다른 집게로 디스크를 찢습니다. 참고 : 날개가있는 상처 원판을 찾기가 어려우면 후방에서 앞쪽으로 기관을 떼어냅니다. 윙 상상의 원판은 기관에 붙어 있습니다. </li><li> 부드럽게 coverslip과 매니큐어와 인감으로 imaginal 디스크를 커버; 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 <ol><li> 발광 파장 범위의 레이저 강도, 게인, 오프셋, 주사 속도와 화상 사이즈 (24)를 포함하는 공 초점 레이저 주사 현미경으로 설정 화상 획득 파라미터를 이용하여 공 초점 화상을 취득. 참고 : 이미지 획득 설정에 대한 자세한 절차는 각 현미경 제조업체에서 제공하는 사용 설명서를 참조하십시오. </li><li> 단일 공동 촬영전체 날개 디스크의 초점이 맞지 않는 부분에 20X 대물 렌즈를 사용하십시오. </li><li> 40X 또는 60X 렌즈를 사용하여 0.5 - 1.0μm의 스텝 크기로 z 스택 스캐닝으로 3 차원 이미지를 획득하십시오. 참고 : 고해상도로 세포 표현형을 분석하려면 이미지 크기가 512 x 512 픽셀보다 커야합니다. </li></ol> 6. ImageJ를 이용한 이미지 분석 <ol><li> 공 촛점 z- 스택 이미지를 수집하고 분석하기 위해 생물 이미지 분석 (https://fiji.sc/) 25 에 초점을 맞춘 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어 인 피지를 사용하십시오. </li><li> 수직 섹션을 얻으려면 ImageJ에서 z 스택 이미지를 열고 &quot;Image / Stacks / Reslice&quot;메뉴 항목을 선택하십시오. 참고 : Reslice 메뉴에서 XZ 축 또는 YZ 축을 선택할 수 있습니다. 수직 단면은 z- 스택 이미지에 직선이나 직사각형을 그리면 임의의 방향으로도 얻을 수 있습니다. </li></ol> 7. 종양의 진단 <ol><li> 수직을여십시오.하나의 세트의 z- 스택 이미지로부터 얻어진 단면 (XZ 또는 YZ 축)을 분석하고 형태 학적 표현형 및 항체 염색을 분석한다. </li><li> 종양 phenotypes의 진단을 위해, 주로 다음 세 가지 포인트에 초점을 맞추고 있습니다 : (1) 세포 덩어리 (knockdown clones 포함)가 주요 상피층에서 벗어나는 경우, (2) junctional 단백질의 세포 내 위치가이 세포 덩어리에서 변형되면 , 및 (3)이 세포 덩어리의 직경이 4 세포보다 큰 경우. </li><li> 그림 1에 설명 된 순서도에 따라 종양 표현형을 분류합니다. </li></ol>

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GAL4-UAS 시스템은 초파리 (26) 내의 표적 유전자의 발현을위한 가장 강력한 유전 적 도구이다 크게 생체 4 종양 세포 유도 분석을 용이하게한다. 이 시스템은 변형 된 종양 세포가 정상 상피 세포로 둘러싸인 인간 암의 초기 단계와 매우 유사한 상황 인 야생형 상피 조직 내 종양 억제 유전자의 knockdown 또는 종양 유전자의 과발현을 나타내는 클론의 생성을 가능하게한다. GAL4 인핸서 - 트랩 라인 또는 Janelia GAL4 라인 27 과 같은 인핸서 서열에 의해 조절되는 GAL4 드라이버 라인은 고유하고, 시공간적으로 제한된 발현 패턴을 갖는다. 따라서, 이러한 enhancer-GAL4 계통은 제한된 상피 원판에서 종양을 지속적으로 유도하는데 유용합니다. 본 연구에 제시된 sd-GAL4 및 upd-GAL4 이외에 lgl - knockdown은 b예 기타 증강제 트랩 GAL4 라인 engrailed-GAL4 등 (EN-GAL4), 헤지 호그-GAL4 (HH-GAL4) optomotor 맹검-GAL4 (OMB-GAL4) 패치 - GAL4 (PTC-GAL4) 및 SPALT-소령 - GAL4 ( salm-GAL4 )는 상상 세포 원반 의 경첩 부위에 종 양성 종양을 생성 할 수 있습니다. 인핸서 -GAL4 발현 패턴을 일시적으로 조절해야하는 경우 GAL4와 온도에 민감한 GAL80 (GAL80 ts ) 버전을 함께 사용할 수 있습니다. GAL80 TS는 18 ° C에서 아니지만 또는 필요 28 꺼야하는 UAS - 트랜스 진 발현을 허용하는 29 ° C에서 GAL4 기능을 억제한다. 플립 아웃 GAL4 모자이크 시스템은 FLP-FRT 시스템과 GAL4-UAS 시스템 3 을 결합하여 가상의 디스크에 임의의 클론을 생성합니다. heat-shock-inducible flippase (hsFLP)와 플립 아웃 GAL4를 결합하여 클론 생성시기이온은 조절 가능하다. 성충 디스크 세포의 종양 형성 가능성이 발달 단계 내생 시그널링 이벤트 및 / 또는 세포 분화 (29), (30)에 의존 할 수 있기 때문에, 종 양성 표현형에 변경된 열충격 타이밍의 영향을 검토하는 것이 매우 중요하다. 이전에 nTSG 돌연변이 클론은 야생형 세포 10 , 11 , 12 , 18에 둘러싸여있을 때 세포 경쟁에 의존적 인 세포 사멸을 겪었으며, 이는 암 발달 중에 세포 돌연변이가 필요하다는 것을 암시합니다. 실제로 lgl 또는 scrib 돌연변이 클론에서 발암 성 Ras 또는 Yki의 과발현은 공격성 종양 10 , 18 , 31 로 변형시킨다Ras V12 또는 Yki 3SA의 발현은 nTSG 돌연변이없이 스스로 악성 신 생물을 유도하지 않는다. 여기와 이전의 16 에서 볼 수 있듯이, 야생형 날개 디스크에서 생성 된 프로 종양 nTSG- 녹다운 클론은 또한 아폽토시스를 겪고 날개 봉지 ( 16)에 종양 형성을 나타내지 않는다. 동시에 경첩 &quot;핫스팟 (hotspot)&quot;에 위치한 nTSG-knockdown 클론은 추가 발암 돌연변이없이 종 양성 종양으로 발전합니다. 경첩 부위에서 nTSG가 결핍 된 세포는 종양 형성을 유도하기 위해 내인성 Janus kinase / 신호 변환기와 전사 활성제 (JAK / STAT) 신호를 납치합니다 16 . 따라서 upd-GAL4 와 같은 경첩 특이성 GAL4 는 종양 억제 유전자의 RNAi 매개 knockdown에 의한 종양 형성을 지속적으로 유도하는 유용한 도구입니다. 플립 아웃 GAL4에 의해 유도 된 nTSG- 넉다운 모자이크 클론이 경첩 내 종양을 유도하지만종양 형성은 초기 클론 크기에 의존한다 : 20 분 이상의 열충격에 의해 생성 된 큰 클론은 보통 종양 형성을 유도하는 반면, 10 분보다 짧은 열충격에 의해 생성 된 대부분의 작은 클론은 완전히 제거된다 (KM 및 YT, 미 출판 데이터). 종양 발달과 암 진행에 관한 최근의 여러 연구에서 Drosophila imaginal disc를 모델 시스템으로 사용합니다 32 , 33 . 이 연구에 공통적으로 나타나는 것은 종양 세포의 비정상 세포질, 변형 된 디스크 모양, F- 액틴 축적, 세포주기의 강화 (BrdU / EdU 결합 또는 PH3 발현), JNK 신호 전달 및 그 다운 스트림 표적 MMP1의 활성화, 기저막 (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 또는 PAR-6), 중격 결손 (septate junctions)에 관련된 단백질의 손실 또는 세포 내 비편 재화를 포함하는,(Lgl, Scrib, Dlg 또는 Coracle) 또는 adherens 접합점 (E-Cadherin 또는 Armadillo). 이러한 표현형은 통상적 인 항체 염색에 의해 용이하게 검출 가능하다. 그것은 클론 표현형은 종양의 초기 단계에서 세포의 증식, 발육 이상, 양성 종양이나 악성 종양을인지 확인하기 어렵지만, 그것은 하나의 상피 단층으로 구성 초파리 성충 디스크 상피 세포에서 간단해야한다. 본 연구에서는 상피 단층 세포에서 유도 된 종양의 클론 표현형을 분류하는 진단법을 도입했다 ( 그림 1 ). 이 방법은 z-stack 공 촛점 이미지를 사용하여 다섯 가지 기준을 면밀히 관찰해야합니다. 각 진단 기준은 통상적 인 항체 염색 및 공 초점 이미징에 의해 검사 될 수있다. 이 방법에서 우리가 도입 한 새로운 기준 중 하나는 상피 세포에서 이형성과 신 생물을 구별하는 &quot;4 세포 지름 기준&quot;입니다. nTSG 돌연변이 클론과 같은 프로 종양 세포는 빈번하다.셀 경쟁 또는 스핀들 방향 오류 (ascor misorientation)를 통해 상피 층으로부터 압출 됨 15 , 16 , 34 . 대부분의 상황에서 이러한 압출 세포는 세포 사멸 (apoptose)하므로 증식 할 수 없습니다. 프로 종양 세포가 압출 중 세포 분열을 한 번하고 압출 후 한 번 또는 두 번 더 세포 분열을 일으킬 가능성은 있지만, 이것은 세포 지질을 2 내지 3 세포 직경으로 만든다. 따라서 상피층에서 벗어난 전립선 세포의 세포 덩어리가 4 세포 직경보다 크다면 상피 층 외부의 신 생물로서 생존하고 증식하는 것으로 판단 할 수 있습니다. 이 진단 방법은 간단하지만 시간이 지남에 종양 발달과 악성 종양이 진행됨에 따라 표현형의 시간 경과를 결정하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 이형성증은 세포 학적으로 비정상적인 조직이며 완전히 양성 성장과 전이성 사이의 전이 상태입니다악의 있는. 따라서, 관찰 된 클론이 순서도 ( 그림 1 )에 따라 이형성으로 정의 되더라도, 이형성증이이어서 신 생물로 발전 할 가능성이 있습니다. 애벌레 단계는 시간이 제한되어 있지만 (25 ° C에서 5 - 6 일 또는 29 ° C AED에서 4 - 5 일), 상피 세포의 종양 성장은 인슐린 유사 펩타이드를 통해 애벌레 단계를 연장시켜 pupariation 35 , 36 따라서 상완 원판에서 종 양성 종양이 형성되면 종양 클론의 표현형 진행을 며칠 동안 관찰 할 수 있습니다. 우리의 간단한 분류 방법은 Drosophila의 여러 기관에서 종양 phenotypes의 클론 분석에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.

상피 조직은 발달 및 세포 회전율을 통해 조직을 유지할 수있는 현저한 항상성을 지닌 고도로 조직화 된 시스템입니다. 그러나이 강력한자가 조직 시스템은 종양 발달 중에 점차적으로 혼란을 겪습니다. 종양 발달 초기에, 종양 유전자 활성화 또는 종양 억제 유전자 불 활성화로 인해 발생하는 개개의 돌연변이 세포가 상피층 내에서 출현한다. 이 형질 전환 된 &quot;종양 세포&quot;가 억제 환경을 피하고, 상피 조직을 파괴하고, 제어되지 않은 증식을 시작할 때, 종양 형성이 발생합니다 1 . 지난 수십 년 동안 유전학 및 분자 생물학 분야의 탁월한 기술 발전은 암 연구에서 눈부신 발전을 이루었습니다. 특히, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase 표적) 유사 분열 재조합과 같은 Drosophila melanogaster 에서 유 전적으로 모자이크 분석 도구를 사용한 최근의 연구2 및 플립 - GAL4 - UAS (업스트림 활성화 시퀀스) 시스템 3 , 종양의 형성과 전이에 관련된 유전자 메커니즘을 이해하는 데 크게 기여했습니다 4 , 5 , 6 . 치명적인 자이언트 애벌레 ( lgl ), 큰 디스크 ( dlg ) 및 낙서 ( scribble )와 같은 보존 된 Drosophila 종양 억제 유전자 그룹에 대한 연구는 상피 조직 손실과 종양 발달 사이의 중요한 관계를 강조했습니다. apical-basal cell의 극성과 상피 조직에서의 세포 증식의 조절 7 . Drosophila imaginal disc는 일반적으로 단층 상피 세포이지만,이 3 가지 유전자 중 homozygous 돌연변이는 세포가 구조와 극성을 잃게하고,overproliferate, rentiate 궁극적 인접 조직 7 융합 다층 비정질 덩어리를 형성한다. 마찬가지로, 포유 동물에서 이들 유전자의 파괴는 악성 종양의 발병과 관련이있다 8 , 9 . 돌연변이 조직에 의해 나타나는 종양 표현형은 보존, 종양 종양 억제 유전자 (nTSGs)와 같은 세 가지 유전자의 분류 7, 8로 이어졌다. 그러나 homozygous nTSG 돌연변이 세포가 FLP-FRT 매개 성의 유사 분열 재조합을 사용하여 야생 형 상상 원판을 개발할 때 산발적으로 생성되면 c-Jun N-terminal kinase (JNK) 의존성 세포 사멸을 통해 돌연변이 세포가 조직에서 제거됩니다 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 압출 15 </sup&gt; , 16 , 또는 이물질에 의한 황산 화 및 식균 작용 17 . 이 유 전적으로 모자이크 상피 세포에서는 세포 경계가 클로닝 경계에 위치한 nTSG 돌연변이 세포에서 주로 검출되며, 이는 인접한 정상 세포가 nTSG 돌연변이 세포의 세포 사멸을 유발한다는 것을 의미합니다. 10 , 11 , 12 , 18 . 포유 동물 세포에 대한 최근의 연구에 따르면 전구 세포 종양 세포의이 세포 경쟁 의존적 제거가 암에 대한 진화 적으로 보존 된 상피 세포 방어 기작임을 확인했다 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . 그러나 Drosophila imaginal discs에 대한 최근 연구에서 모자이크 nTSG-knockdown clone은 종양의 종양을 특이 적으로 유도한다는 것을 보여 주었다날개의 상상의 디스크의 IC 영역 16 . 초기 종양 형성은 말초 &quot;힌지&quot;영역에서 항상 발견되었고 날개 디스크 상피의 중앙 &quot;파우치 (pouch)&quot;영역에서는 관찰되지 않았으며, 이는 nTSG- 녹다운 세포의 종양 형성 잠재력이 국소 환경에 의존한다는 것을 암시한다. 중앙 파우치 지역은 전립선 종양 세포가 이형성 과증식을 나타내지 않는 반면 말초 경첩 부위는 &quot;종양 핫스팟&quot; 16 처럼 행동하는 &quot;종양 냉점&quot;으로 기능합니다. &quot;coldspot&quot;파우치 영역에서 nTSG- 녹다운 세포는 기저부로부터 박리되어 세포 사멸을 겪습니다. 대조적으로 &quot;핫스팟&quot;힌지 셀들이 기저 측면에 견고한 골격 구조의 네트워크를 갖고, nTSG-녹다운 세포는 상피의 선단 측으로부터 박리 및 발암 성 과증식 (16)을 시작. 따라서, 상상의 디스크에서 종양 phenotypes의 분석은주의 consin 필요합니다종양 형성 자극에 대한 부위 특이 적 감수성의 저하. 여기, 우리는 정상 날개 디스크 상피에서 nTSG - knockdown 세포가 생성되는 GAL4 - UAS - RNAi 시스템을 활용하여 초파리 날개 imaginal 디스크에 종양 형성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 실험 시스템이 암의 초기 단계를 연구하는 데 유용하지만 상상 디스크 상피 세포에서 종양 진행 단계를 평가하는 명확한 분류 방법은 이전에 명확하게 설명되지 않았습니다. 따라서 우리는 또한 날개 원발성 상피 세포에서 유래 된 전 종양의 클론 성 표현형을 3 가지 범주로 분류하는 진단 방법을 제안한다 : 증식 (증가 된 증식으로 정상 출현하는 세포의 과도한 수의 축적), 이형성증 (비정상적으로 나타나는 전암 조직 세포) 및 신 생물 (비정상적인 모양 및 비정상적인 증식 패턴을 갖는 세포로 구성된 양성 또는 악성 종양).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;tubulin&lt;/span&gt;</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Act&gt;CD2&gt;GAL4 (flip-out GAL4)&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>second chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

암의 초기 단계에서, 형질 전환 된 돌연변이 세포는 세포 학적 이상을 보이고 통제되지 않은 과증식을 시작하며 점차적으로 조직 구성을 붕괴시킵니다. Drosophila melanogaster 는 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하기 위해 암 생물학에서 대중적인 실험 모델 시스템으로 부상했습니다. 특히 Drosophila imaginal disc (애벌레의 상피 형성)를위한 유전 도구는 인간 상피 세포의 초기 단계와 유사한 상황 인 정상 상피 조직 내에서 형질 전환 된 종양 세포의 생성을 가능하게합니다. 그러나 Drosophila wing imaginal disc의 종양 발생에 관한 최근의 연구에 따르면, 종양 발생은 조직 고유의 세포 구조와 국소 미세 환경에 달려있어 상상적으로 종양 표현형을 평가할 때 종양 형성 자극에 대한 영역 특이성 감수성을 고려하는 것이 중요하다는 것을 알 수있다 디스크. 종양 진행의 표현형 분석을 용이하게하기 위해GAL4-UAS 시스템을 이용하여 날개 상상 디스크에서 종 양성 종양을 유도하는 유전자 실험 프로토콜을 설명합니다. 우리는 상피 성 상피에서 유도 된 클론 병변의 표현형을 분류하기위한 진단 방법을 소개한다. 종양 진행의 다양한 단계 (과형성, 이형성증, 신 생물 등)를 구분하기위한 분명한 분류 방법은 이전에 기술되지 않았다. 이러한 방법은 Drosophila의 여러 기관에서 종양 phenotypes의 클론 분석에 널리 적용 할 수 있습니다.

Drosophila wing imaginal disc에서 RNAi 매개 된 nTSG-knockdown에 의해 실험적으로 유도 된 종 양성 종양을 확인하기 위해 3 가지 다른 GAL4 드라이버를 사용하여 lgl 또는 scrib에 대한 UAS-RNAi 를 발현 시켰다 : (1) sd-GAL4 . 힌지 영역 ( 그림 2 및 그림 3A )에서 날개 파우치 및 마일드 표현. (2) 등 지느러미 내측 배의 두 영역에서 강력한 발현, 하나의 앞쪽 - 외측 영역에서의 약한 발현 및 복부 - 뒤쪽 도메인에서의 약한 발현을 포함하여 힌지의 하위 도메인을 유도하는 upd-GAL4 ( 도 2 및 도 3C ); 및 (3) UAS 유전자를 발현하는 임의의 모자이크 클론을 생성하는 열 쇼크 유발 플립 아웃 GAL4 ( 도 4 및 Fi그림 5). 모든 실험에서, UAS-EGFP 는 UAS-RNAi 와 동시에 발현되어 클론을 표시한다. 첫째, sd-GAL4 가 유도 한 lgl-RNAi 를 사용하여 날개 주머니와 힌지 영역에서 lgl의 knockdown을 유도 하였다. UAS-lgl-RNAi 가없는 대조 세 번째 날개 디스크에서는 형태 학적 변화가 일어나지 않았다 ( 그림 3A ). 대조적으로, lgl-RNAi를 발현하는 3 번째 날개 디스크에서, 힌지의 특정 부분에서 상피 변형 및 종양 생성 과증식이 명확하게 관찰되었다 ( 도 3B ). 그러나 날개 파우치 지역에서는 이형성 과증식이 관찰되지 않았다. 종양 경첩 병변에서는 강한 MMP1 (matrix metalloprotease-1) 발현이 관찰 되었으나 날개 파우치 영역에서는 그렇지 않았다 ( 그림 3B ). MMP1 발현이 기저막의 분해에 관여하기 때문에이러한 경첩 종양은 전이성 능력을 가질 가능성이 있습니다 ( 그림 3B ). 다음으로, 경첩 영역에서 lgl 녹다운을 유도하기 위해 upd-GAL4 를 사용 하였다. UAS-lgl-RNAi 가없는 대조 세 번째 날개 디스크에서 형태 학적 변화는 발생하지 않았다 ( 그림 3C ). 그러나, 5 일 AED 후, upd-GAL4 및 lgl-RNAi를 갖는 3 번째 날개 원판은 F- 액틴 누적 및 상피 층으로부터의 클론 변위로 현저한 상피 해리를 보였다 ( 도 3d ). 6 일 AED에서, MMP1을 발현하는 신 생물 종양은 힌지 영역에서 과도하게 지나치다 ( 도 3G ) ( 도 3E 및 F ). 경첩 영역의 수직 단면은 신 생물 종양이 상피 층의 정점 측에서 편재하는 것을 확인 하였다 ( lgl의 knockdown에 의해 유도 된 종양 성장의 진행을 모니터하기 위해 lgl-RNAi를 발현하는 산발적 인 클론이 열 충격 유발 플립 아웃 GAL4 모자이크 시스템을 사용하여 날개 디스크에서 생성되었다. 두 번째 instar 애벌레 (2 일 AED)에 열 충격 후 이틀, 힌지 지역에 위치한 일부 lgl - 녹다운 클론은 상피 레이어의 꼭대기 측면에서 이탈을 보여 주었다 ( 그림 4A ). 열 충격 유도 4 일 후 경첩 부위의 이형성 병변이 명확 해지 면서 lib- knockdown clone이 apical side로부터 떨어져서 자리 잡아 내강 내에서 증식한다는 것을 암시한다 ( 그림 4B ). 열 충격 유도 후 7 일이 지나면 종양 발생 과발성이 경첩 부위를 지배했다 ( 그림 4C ). 설명하기우리의 진단 방법으로 clonal phenotypes를 분류 한 결과 열충격 유발 플립 아웃 GAL4 모자이크 시스템을 사용하여 날개 디스크에 scrib-RNAi를 발현하는 산발적 클론이 생성되었다. 두 번째 instar 애벌레 (2 일 AED)에 열 충격 후 5 일, 특정 GFP 표현 scrib - 녹다운 클론은 tumorigenic phenotypes을 보여 주었다 ( 그림 5A ). ImageJ를 사용하여 z-stack 공 초점 영상의 수직 단면에서 네 개의 클론 ( 그림 5A의 B, C, D 및 E)을 분석했습니다. 2D 공 초점 영상에서 자세한 세포 학적 및 구조적 표현형을 획득하기가 어렵 기 때문입니다 ( 그림 4 및 그림 5A ). 클론 B와 C는 septate-junction protein discs large (Dlg)이 mislocalized되어서 dysplasia로 분류되었다 ( 그림 5B와 C ). 클론 B에서, 상피로부터 옮겨진 세포 덩어리의 크기는 반점에서 4 세포보다 크지 않았다r ( 도 5B ), 클론 C는 상피로부터 벗어나지 않았다 ( 도 5C ); 따라서, 클론 B 및 C는 신생 물성으로 간주되지 않았다. 그러나 Dlg의 위치가 틀린 것으로 밝혀진 클론 D 및 E는 상피 외부의 종양 세포 덩어리를 형성했다 ( 도 5D 및 5E ). 이들 변위 된 종양 클론의 크기는 직경이 4 세포 이상 이었기 때문에 클론은 종양으로 분류되었다. 날개 상상 원판에 증식 성 종양이나 낭포 형성을 유도하기 위해 종양 내 Ras ( Ras V12 ) 또는 Hippo 경로의 전사 보조 활성제 인 Yorkie ( Yki 3SA )를 발현하는 산발성 클론을 열 충격 유발 플립 아웃 GAL4 모자이크 시스템. 두 번째 instar 애벌레 (2 일 AED)에 열 충격 후 4 일, RaGFP로 표지 된 FPRL1- 발현 클론들에 V12는 성충 디스크 (도 6A)에 둥근 세포 덩어리가되었다. Ras V12 발현 클론 ( 도 6A의 클론 B)의 수직 단면은 상피 층으로부터 해리 된 세포 질량이 Dlg의 적절한 국소화를 나타내 었으며, 이는 세포 질량이 상피 층 외부의 정상 상피 구조를 유지함을 시사한다 ( 도 6B ) . MMP1 발현은 이러한 Ras V12- 발현 클론에서 관찰되지 않았다 ( 도 6C ). 따라서 클론 B는 낭종 형성으로 분류되었다. 두 번째 instar 애벌레 (2 일 AED)에 열 충격 후 4 일, GFP에 의해 분류 Yki 3SA - 표현 클론은 imaginal 디스크 ( 그림 7A )에 큰 세포 질량을 형성. 우리는 두 개의 클론에 집중했다 ( 그림 7A의 B와 C). 클론 B가 나타났다.상피 세포의 정단 막을 부에서 상피 층 굴림 적절한 제이션에 통합은 YKI 3SA FPRL1- 발현 클론 B 상피 구조를 유지하고 있음을 시사한다. 따라서, 클론 B는 증식으로 분류되었다 ( 도 7B ). 힌지 영역에 위치한 클론 C는 Dlg의 위치 틀림을 나타내었고 상피층의 기저부에 다층 구조를 형성했다. MMP1 발현은 Yki 3SA 발현 클론에서는 관찰되지 않았다. 종합하여, 클론 C는 양성 신 생물로 분류되었다 ( 도 7C 및 D ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig1.jpg" /> 그림 1 : 종양 표현형 분류의 순서도 이 순서도는 상피 상피에서 클론 병변을 분류하는 진단 방법을 나타냅니다. 분류 된(1) 상피 층으로부터의 클론 이탈, (2) 접합 단백질의 세포 내 mislocalization, (3) 세포 증식, (4) 클론 크기 및 (5) MMP1 발현의 5 가지 기준에 기초한다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig2.jpg" /> 그림 2 : Dlg (녹색)와 핵 (DAPI, 마젠타)을 염색 한 ( A ) 야생형 날개 상상 디스크. ( B ) 날개 파우치 (파란색), 경첩 (오렌지색) 및 표명 (녹색) 영역을 보여주는 초파리 날개 상상 디스크의 도식적 표현. ( C ) 정상 날개 상상 디스크는 F - 굴지 (빨간색)와 microtubules (녹색)에 대한 스테인드. 지하 막은 콜라겐 IV / Vkg-GFP (파란색)로 표시됩니다. ( D ) 부지의 수직 단면( C )에 흰색 점선이 표시되어 있습니다. ( E ) 선 그림은 ( D )의 상피층의 정점 (빨간색)과 기저 (파란색)면을 추적합니다. 점선이 peripodial membrane을 추적합니다. 등 지느러미의 근위 (Df), 내측 (Mf) 및 근위 (Pf) 주름이 표시됩니다. 자세한 유전자형 : A, w - CD, Vkg-GFP <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig3.jpg" /> 그림 3 : Enhancer-GAL4가 유도하는 부위 별 종양 형성 ( A , B ) 공 촛점 이미지는 MMP1 (빨간색)에 대한 스테인드 지적 genotypes의 세 번째 instar 애벌레에서 해부 날개 상상 디스크를 보여줍니다. sd-GAL4 -expressing 부위는 GFP 발현 (녹색)으로 표시 하였다. ( CG ) 공 촛점 이미지는 지정된 시점 AED에서 지정된 유전자형의 3 번째 instar larvae에서 해부 된 날개 상상 디스크를 보여줍니다. F-actin은 ( CF )에서 Phalloidin (red)으로 염색되었습니다. MMP1 발현은 ( G )에서 항 -MMP1 항체 (적색)로 염색된다. upd-GAL4- 발현 영역은 GFP 발현 (녹색)으로 표지 하였다. ( CF )의 아래쪽 패널은 위쪽 패널에 표시된 영역의 확대보기입니다. 흰색 화살표는 lgl- 녹다운 클론에 의해 유도 된 이형성 병변을 나타낸다. ( H ) (E)의 바닥 패널에 흰 점선으로 표시된 부위의 수직 단면. 흰 점선은 (A)와 (B)의 날개 파우치와 힌지 영역 사이의 경계를 표시합니다. 핵은 DAPI (파란색)로 표시했습니다. 스케일 바 = 100 μm (AG) 및 50 μm (H). 자세한 유전자형 : A, w - , sd - GAL4, UAS - EGFP; UAS-dicer2; B, w - SD-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig4.jpg" /> 그림 4 : 무작위 모자이크 클론에 의해 유발 된 종양 표현형. ( AC ) 공 촛점 이미지는 열 충격 유도 후 표시된 시점에 lgl-RNAi 와 GFP (녹색)를 공동 발현하는 클론으로 3 번째 기생충 의 모자이크 날개 상상 디스크를 보여줍니다. 핵은 DAPI (파란색)로 표시했습니다. 가운데 패널은 왼쪽 패널에 표시된 흰색 사각형 영역의 확대 된보기를 표시합니다. 오른쪽 패널<html> s는 상피 층 (청색) 및 GFP- 발현 클론 (녹색)의 정점 측의 개략도를 도시한다. 상피 내에 위치하는 모자이크 클론은 밝은 녹색으로 표시되는 반면, 상피로부터 벗어나는 종 양성 종양은 자홍색으로 표시됩니다. 왼쪽 패널의 흰 점선은 날개 파우치와 힌지 영역 사이의 경계를 표시합니다. 중간 패널의 흰색 화살표는 lgl -knockdown 클론에 의해 유도 된 이형성 병변을 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm. 자세한 유전자형 : AC, hsFLP; UAS-dicer2; UAS-EGFP / UAS-lgl-RNAi (2 일 AED에서 열 충격 30 분, A에서 25 ° C에서 2 일 항온 배양, B에서 25 ° C에서 4 일 항온 배양, 7 일간 품어 열충격 후 C = 25 ° C). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 5 &quot;class =&quot;xfigimg &quot;src =&quot;/ files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg &quot;/&gt; 도표 5 : Dysplastic Clonal Phenotype의 진단 시험. ( A ) 왼쪽 패널은 열충격 유발 5 일 후 scrib-RNAi 와 GFP (녹색)를 공동 발현하는 클론이 Dlg (적색)으로 염색 된 3 번째 유충의 모자이크 날개 상상 디스크를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 상피 층 (파란색)과 GFP - 표현 클론 (녹색)의 꼭대기 측면의 개략 선 그리기를 보여줍니다. 상피층의 모자이크 클론은 연한 녹색으로 나타나고 상피층에서 옮겨진 종 양성 종양은 마젠타 색으로 표시됩니다. ( BE ) 공 촛점 이미지는 (A)의 오른쪽 패널에 표시된 스크 라이브 - 녹다운 클론의 수직 섹션을 보여줍니다. 왼쪽의 두 번째 패널에는 Dlg 지역화 패턴 (빨간색)이 표시됩니다. 왼쪽의 세 번째 패널은 상피 층의 정점 (빨간색)과 기저 (파란색) 측면의 개략적 인 선 그림과 GFP-expr에싱 스크라이브 - 녹다운 클론 (녹색). 상피층의 이형성 클론은 연한 녹색 (B와 C)으로 나타나고 상피로부터 옮겨진 종양 클론은 마젠타 (D와 E)로 표시됩니다. 흰색 화살표는 tumorigenic 표현형을 보여주는 스크 라이브 - 녹다운 클론을 나타냅니다. 핵은 DAPI (파란색)로 표시했습니다. 스케일 바 = 50 μm. 각 클론의 종양 표현형은 그림 1에 나와있는 순서도에 따라 분류되었습니다. 자세한 유전자형 : AE, hsFLP; UAS-scrib-RNAi; 행동&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP (2 일 AED 30 분 열 충격, 열 충격 후 25 ℃ 4 일 품어). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig6.jpg" /> 그림 6 : 진단Ras V12 발현 클론 성 표현형의 검사. ( A ) 왼쪽 패널은 Dlg (빨간색)에 대한 스테인드 열 충격 유도 4 일 후 발암 Ras V12 와 GFP (녹색)를 공동 발현하는 클론과 함께 3 번째 유충의 모자이크 날개 imaginal 디스크를 보여줍니다. 오른쪽 패널은 상피 층 (파란색)과 GFP - 표현 클론 (녹색)의 꼭대기 측면의 개략 선 그리기를 보여줍니다. 스케일 바는 50 μm를 나타냅니다. ( B ) (A)의 오른쪽 패널에 표시된 Ras V12 발현 클론의 수직 절편. 왼쪽의 두 번째 패널에는 Dlg 지역화 패턴 (빨간색)이 표시됩니다. 왼쪽의 세 번째 패널은 상피층의 정점 (적색)과 기저부 (청색) 측면의 RAS V12 및 GFP 발현 클론 (녹색)의 개략도를 보여줍니다. 눈금 막대 = 25 μm. ( C ) 공동 표현하는 클론과 함께 3 번째 instar 애벌레의 모자이크 날개 imaginal 디스크 &lt;em&gt; Ras V12 및 GFP (녹색) 열 충격 유도 4 일 후, MMP1 (빨간색)에 대한 스테인드. 스케일 바 = 100 μm. 자세한 유전자형 : AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; 행동&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP (2 일 AED에서 열 충격 45 분, 열 충격 후 25 ° C에서 4 일간 품어). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig7.jpg" /> 그림 7 : YKI 3SA 발현 클론 표현형의 진단 검사. (A) 좌측 패널과 제 령 유충의 모자이크 날개 성충 디스크를 도시 클론 공동 발현 굴림 (적색)에 대해 염색 사일 열 - 충격 유도 후 구조적 활성 YKI 3SA 및 GFP (녹색). 오른쪽 패널은 다음과 같이 표시됩니다.<html> 상피 층 (청색) 및 GFP- 발현 클론 (녹색)의 정점 측의 화학 선 묘화. 스케일 바 = 50 μm. ( BC ) (A)의 오른쪽 패널에 표시된 Yki 3SA 발현 클론의 수직 절편. 왼쪽의 두 번째 패널에는 Dlg 지역화 패턴 (빨간색)이 표시됩니다. 왼쪽의 세 번째 패널은 상피 층의 꼭대기 (빨간색) 및 기저부 (파란색)면과 Yki 및 GFP 발현 클론 (녹색)의 개략도를 보여줍니다. 눈금 막대 = 25 μm. ( D ) 열 충격 유도 후 4 일째에 Yki 3SA 와 GFP (녹색)를 공동 발현하는 클론이있는 3 번째 유충의 모자이크 날개 상상 디스크. MMP1 (적색)으로 염색 됨. 스케일 바 = 100 μm. 세부 유전형 : AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP (2 일 AED 30 분, 25 ° C에서 4 일간 품어).5901fig7large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Drosophila imaginal disc epithelia의 모자이크 클론 분석은 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 여기에서는 GAL4-UAS 시스템을 사용하여 Drosophila wing imaginal discs에서 종양을 유도하는 프로토콜을 설명하고 종양 표현형을 분류하는 진단 방법을 소개합니다.

종양의 유도 및 진단<em&gt; Drosophila</em&gt; 상피 디스크 상피 세포

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K 조회수.  SOKENDAI.  Drosophila imaginal disc epithelia의 모자이크 클론 분석은 종양 형성의 유전 및 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 여기에서는 GAL4-UAS 시스템을 사용하여 Drosophila wing imaginal discs에서 종양을 유도하는 프로토콜을 설명하고 종양 표현형을 분류하는 진단 방법을 소개합니다. 

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Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

연구

암 연구학

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

셋째 Instar Drosophila의 유충에서 Imaginal 디스크의 해부

생물학

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜<em&gt; 초파리</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

의학

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

푸팔 단계 동안 개발 초파리 에피텔리아에서 조직 방향 과 성장 역학의 이미징 및 분석

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

발생학

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

초파리 유충 상상 디스크 해부: 상피 발달을 관찰하는 방법

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

종양의 유도 및 진단

요약

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