Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Ringraziamo J. Vaughen per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e la Fondazione di Ricerca di Takeda Science Grant a YT

1. Crociere di mosche e induzione del clone <ol><li> Rimuovere tutte le mosche nella fiala 12 h prima di raccogliere le mosche vergini. </li><li> Anestetizzare le mosche nel flaconcino iniettando il gas CO 2 e posizionare le mosche su un moscerino di CO 2 . </li><li> Trasferite 10-20 femmine vergini e 10 maschi dal tampone di volo CO 2 in un flaconcino fresco e incubate per 1 giorno a 25 ° C. </li><li> Trasferire queste mosche in una fiala fresca e incubare per 12 h a 25 ° C. NOTA: Scartare il primo flaconcino in quanto le femmine vergini non posano le uova sufficienti nel primo giorno. </li><li> Per linee enhancer-GAL4, rimuovere le mosche adulti e incubare la fiala a 25 ° C fino alla dissezione. </li><li> Per l&#39;induzione di cloni mosaici per flip-out-GAL4, rimuovere le mosche adulte e incubare il flaconcino per 2 - 4 giorni a 25 ° C. Il tempo di incubazione prima dello shock termico dipende dallo scopo sperimentale. Un colpo di calore 2 giorni dopo la deposizione dell&#39;uovo (AED) genera cloni mosaici in secondi immaturiInstallare epitelio immaginario. Una scossa termica dopo 3 o 4 giorni AED genera cloni mosaici in epitelio immaginario differenziato all&#39;inizio del periodo medio e terzo. NOTA: È importante esaminare l&#39;effetto di alterazione del tempo di scossa termico sui fenotipi tumorigenici. </li><li> Per l&#39;induzione di cloni di mosaico per flip-out-GAL4, scuotere il flacone mediante immersione in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per 10-45 minuti seguito da incubazione per 2 - 3 giorni a 25 ° C. NOTA: Le informazioni relative al tempo di scossa, tempi e tempi di incubazione in ciascun esperimento sono mostrati nelle leggende delle figure. </li></ol> 2. Dissezione delle larve <ol><li> Raccogli le larve di terzo istante vaganti con un bastone di legno o pinze sbattute, genotiparle con appositi marcatori fluorescenti ( ad es . EGFP) sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza e collocarli in un piatto di dissezione con PBS (salina tampone fosfato). </li><li> Lavare le larve in PBS pipettando con pipette di trasferimento di plastica da 2 ml. </li><li>Pinch il centro della larva con una pinza e strappare il corpo a metà con le altre pinze. </li><li> Pinch il gancio della bocca della metà anteriore con una pinza e spingere la bocca verso il corpo con l&#39;altra pinza per girare il corpo dentro di fuori. </li><li> Rimuovere materiali inutili come ghiandole salivari o corpi grassi con pinze. </li></ol> 3. Fissazione e colorazione degli anticorpi <ol><li> Trasferire la metà anteriore disseccata del corpo larvale (compresi i dischi flap imaginali) in un tubo di plastica da 1,5 ml e fissare in 1 mL di soluzione Fix (4% di formaldeide in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con una rotazione delicata. ATTENZIONE: la formaldeide è tossica e ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle. NOTA: In questa parte, tutti i passaggi avvengono in un nutatore a temperatura ambiente al buio, salvo diversa indicazione. </li><li> Rimuovere la soluzione Fix e scartare. Lavare i tessuti con 1 mL di PBT (0,3% TritSu X-100 in PBS) tre volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Rimuovere il PBT e aggiungere 1 mL di PBTG (albumina serica bovina 0,2% e siero di capra normale 5% in PBT) per bloccare e nutrire 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere PBTG e aggiungere soluzione primaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (vedi Tabella Materiali ) e nutrire per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i tessuti con 1 mL di PBT tre volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Rimuovere PBT e aggiungere soluzione secondaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (1: 400). Nocciola per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Per macchiare F-actina, rimuovere PBT e aggiungere soluzione Phalloidin opportunamente diluita in PBS (1:40). Poi nutrire per 20 minuti. Rimuovere la soluzione di Phalloidin e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Per contare il DNA nucleare, rimuovere PBT e aggiungere DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo) (0,5 μg / mL di DAPI in PBS). Poi nutate 10 min. ATTENZIONE: DAPI ha potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle. </li><li> Rimuovere la soluzione DAPI e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Sciacquare una volta in 1 ml di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 500 μl di glicerolo al 100% come mezzo di pre-montaggio. </li></ol> 4. Montaggio su diapositive microscopiche <ol><li> Posizionare i tessuti macchiati su uno scivolo a microscopio utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica da 2 ml. </li><li> Trasferire i tessuti a gocce di supporto di montaggio su un&#39;altra scivolo a microscopio con pinze. </li><li> Tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e tirare fuori i dischi antennari del cervello e dell&#39;occhio con le altre pinze. NOTA: Tenere i cervelli dissected per posizionarli vicino ai dischi imaginal di ala. I cervelli fungono da piattaforma che impediscono la copertura a schiacciare i dischi imaginali dell&#39;ala. </li><li> Per isolare i dischi fantinici dell&#39;ala, tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e graffiare delicatamente la parete del corpo e strappare i dischi con le altre pinze. NOTA: Se è difficile trovare i dischi fantinici dell&#39;ala, sbucciare la trachea dal retro al lato anteriore. I dischi imaginali delle ali sono attaccati alla trachea. </li><li> Coprire delicatamente i dischi imaginali con una copertura e un sigillo con smalto; Conservare a 4 ° C. </li></ol> 5. Microscopia confocale <ol><li> Per acquisire immagini confocali utilizzando parametri di acquisizione dell&#39;immagine di microscopio confocale, compresi l&#39;intervallo di lunghezza d&#39;onda di emissione, l&#39;intensità del laser, il guadagno, l&#39;offset, la velocità di scansione e la dimensione dell&#39;immagine 24 . NOTA: Per una procedura dettagliata delle impostazioni di acquisizione delle immagini, fare riferimento al manuale di istruzioni fornite da ciascun produttore del microscopio. </li><li> Per catturare singoli coLe sezioni nfocal di un intero disco fantasiale, utilizzare un obiettivo obiettivo 20X. </li><li> Acquisire immagini tridimensionali mediante scansione z-stack a dimensioni passo-passo di 0,5-1,0 μm utilizzando lenti 40X o 60X. NOTA: Per analizzare i fenotipi cellulari in alta risoluzione, le dimensioni di un&#39;immagine devono essere superiori a 512 x 512 pixel. </li></ol> 6. Analisi delle immagini usando ImageJ <ol><li> Utilizza Fiji, un software ImageJ open-source, focalizzato sull&#39;analisi delle immagini biologiche (https://fiji.sc/) 25 , per acquisire e analizzare immagini confocalizzate a z-stack. </li><li> Per acquisire le sezioni verticali, aprire le immagini z-stack in ImageJ e selezionare la voce di menu &quot;Immagine / Stacks / Reslice&quot;. NOTA: L&#39;asse XZ o l&#39;asse YZ possono essere selezionati nel menu Reslice. La sezione verticale può essere ottenuta anche in una direzione arbitraria, disegnando una retta o un rettangolo sull&#39;immagine z-stack. </li></ol> 7. Diagnosi dei fenotipi neoplastici <ol><li> Apri la verticaleSezioni (asse XZ o YZ) ottenute da un insieme di immagini a z-stack e analisi di fenotipi morfologici e colorazione degli anticorpi. </li><li> Per la diagnosi dei fenotipi tumorali, si concentrano principalmente i seguenti tre punti: (1) se una massa cellulare, compresi i cloni di abbattimento, si discosta dallo strato epiteliale principale, (2) se la localizzazione subcellulare delle proteine ​​junctional è alterata in questa massa cellulare , E (3) se il diametro di questa massa cellulare è maggiore di 4 celle. </li><li> Classificare i fenotipi tumorali secondo il diagramma di flusso descritto nella Figura 1 . </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il sistema GAL4-UAS è uno degli strumenti genetici più potenti per l&#39;espressione genica mirata in Drosophila 26 e consente notevolmente l&#39;induzione e l&#39;analisi delle cellule tumorali in vivo 4 . Questo sistema consente la generazione di cloni che portano a eliminare i geni del soppressore tumorale o sovraespressione di oncogeni all&#39;interno del tessuto epiteliale di tipo selvaggio, una situazione molto simile agli stadi iniziali del cancro umano in cui le cellule protumorali trasformate sono circondate da normali cellule epiteliali. Le linee di guida GAL4 regolate da sequenze di potenziamento come le linee di trapianto di GAL4 o le linee di Janelia GAL4 27 hanno patters espressi unici e spatiotemporalmente limitati. Pertanto, queste linee di enhancer-GAL4 sono utili per indurre tumori coerentemente in aree restrittive di dischi imaginali. Oltre al sd-GAL4 e all&#39;aggiornamento-GAL4 mostrato in questo studio, abbiamo confermato che lgl -indotto by altre linee GAL4 enhancer-trap compresi engrailed-GAL4 (en-GAL4), hedgehog-GAL4 (hh-GAL4), optomotor cieco-GAL4 (OMB-GAL4), patched-GAL4 (PTC-GAL4) e spalt-gioranza GAL4 ( salm-GAL4 ) può generare tumori neoplastici nelle regioni delle cerniere dei dischi imaginal di ala. Se il pattern di espressione del enhancer-GAL4 deve essere temporalmente controllato, è possibile scegliere una combinazione di GAL4 e una versione sensibile alla temperatura di GAL80 (GAL80 ts ). GAL80 ts reprime la funzione GAL4 a 18 ° C, ma non a 29 ° C, che consente l&#39;inserimento o la disattivazione dell&#39;espressione di transgeni UAS come necessario 28 . Il sistema mosaico flip-out-GAL4, che combina il sistema FLP-FRT e il sistema GAL4-UAS 3 , genera cloni casuali nei dischi imaginali. Combinando la flippa indotta da calore-shock (hsFLP) con il flip-out GAL4, la temporizzazione del generatore di cloneIone è controllabile. Poiché il potenziale tumorigenico delle cellule discontinue può dipendere dalla fase di sviluppo, dagli eventi di segnalazione endogena e / o dalla differenziazione cellulare 29 , 30 , è molto importante esaminare l&#39;effetto della temporizzazione alterata di shock termico sui fenotipi tumorigenici. È stato precedentemente dimostrato che i cloni mutanti nTSG sono sottoposti ad apoptosi di competizione a cellule circolate quando circondano le cellule di tipo selvatico 10 , 11 , 12 , 18 , suggerendo che sono necessarie molteplici mutazioni per la trasformazione cellulare durante lo sviluppo del cancro. Infatti, la sovraespressione di Ras oncogeni o Yki in lgl o SCRIB cloni mutanti li trasforma in tumori aggressivi 10, 18, 31 che misL&#39;espressione di Ras V12 o Yki 3SA non induce neoplasi maligni da soli senza mutazioni nTSG. Come mostrato qui e in precedenza 16 , i cloni pro-tumor nTSG-knockdown generati in dischi di ali di tipo selvaggio sono anche sottoposti ad apoptosi e non mostrano tumorigenesi nella sacca d&#39;ala 16 . Allo stesso tempo, i cloni nt-knockdown situati in cerniere &quot;hotspot&quot; si sviluppano in tumori neoplastici senza ulteriori mutazioni oncogene. Nelle zone delle cerniere, le cellule affette da nTSG si oppongono all&#39;eliminazione del trasduttore endogeno di Janus chinasi / segnale e dell&#39;attivatore della trascrizione (JAK / STAT) per guidare la tumorigenesi 16 . Pertanto, le GAL4s specifiche di cerniera come l&#39;aggiorn -GAL4 sono strumenti utili per indurre costantemente la formazione di tumori neoplastici mediante il ristagno mediato da RNAi dei geni del tumore soppressore. Anche se i cloni mosaici nTSG indotti da flip-out-GAL4 inducono anche i tumori neoplastici in cerniera, I casi di tumorigenesi dipendono dalla dimensione iniziale del clone: ​​i grandi cloni generati da uno shock termico per 20 minuti di solito inducono la tumorigenesi, mentre la maggior parte dei piccoli cloni generati da shock termico inferiore a 10 minuti sono completamente eliminati (KM e YT, dati non pubblicati). Un certo numero di recenti studi sullo sviluppo del tumore e sulla progressione del tumore usano dischi imaginal Drosophila come sistema di modello 32 , 33 . Comuni a questi studi comprendono diversi marcatori di tumori neoplastici: masse di cellule devianti, forme deforme del disco, accumulazione di F-actina, cicli di cellule avanzate (incorporazione di BrdU / EdU o espressione di PH3), attivazione della segnalazione JNK e suo bersaglio a valle MMP1, Disfunzione e / o disorganizzazione epiteliale, inclusa la delocalizzazione subcellulare delle proteine ​​coinvolte nella polarità delle cellule apicala-basali (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 o PAR-6), giunti septate(Lgl, Scrib, Dlg o Coracle) o aderenti con giunzioni (E-Cadherin o Armadillo). Questi fenotipi sono facilmente riconoscibili con la colorazione anticorpale convenzionale. Anche se è difficile determinare se un fenotipo clonale è iperplasia, displasia, neoplasia benigna o neoplasia maligna nella fase iniziale della tumorigenesi, dovrebbe essere più semplice nell&#39;epitelio disco Drosophila imaginale composto da un singolo strato epiteliale. In questo studio abbiamo introdotto un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali del clone indotti nel monostrato epiteliale ( Figura 1 ). Questo metodo richiede osservazioni attenti di cinque criteri usando le immagini confocali z-stack; Ogni criterio diagnostico può essere esaminato mediante la colorazione anticorpale convenzionale e l&#39;imaging confocale. Uno dei nuovi criteri che abbiamo introdotto in questo metodo è il &quot;criterio di diametro delle 4 celle&quot; che discrimina tra displasia e neoplasia nei dischi imaginali. Le cellule pro-tumorali come i cloni mutanti nTSG sono frequentiEstrusi da strati epiteliali attraverso la concorrenza delle cellule o il misorientamento del mandrino 15 , 16 , 34 . Nella maggior parte delle situazioni, queste cellule estruse apoptose, e quindi non possono proliferare. Sebbene sia possibile che le cellule pro-tumor subiscono una divisione cellulare una volta durante l&#39;estrusione e una o due volte dopo l&#39;estrusione, questo rende una massa cellulare di diametro da 2 a 3 celle. Pertanto, se una massa cellulare di cellule pro-tumor ha deviato dallo strato epiteliale è maggiore del diametro delle 4 celle, possiamo determinare che essi sopravvivono e si proliferano come neoplasie al di fuori dello strato epiteliale. Anche se questo metodo di diagnosi è semplice, è fondamentale prendere un corso temporale di fenotipi, poiché lo sviluppo del tumore e la malignità progrediscono nel tempo. Per esempio, la displasia è un tessuto citologicamente anormale e uno stato transitorio tra le colture completamente benigne e quelle precocimaligno. Pertanto, anche se un clone osservato è definito come una displasia secondo il diagramma di flusso ( Figura 1 ), è possibile che la displasia successivamente si sviluppi in un neoplasma. Sebbene lo stadio larvale sia limitato nel tempo (5 - 6 giorni a 25 ° C o 4-5 giorni a 29 ° C AED), la crescita tumorale nei dischi imaginali prolunga lo stadio larvale attraverso un ritardo indotto da peptidi simili a insulina 35 , 36 . Pertanto, la formazione di tumori neoplastici nei dischi imaginali consente di osservare la progressione fenotipica del clone tumorale per altri giorni. Il nostro semplice metodo di classificazione potrebbe essere generalmente applicabile all&#39;analisi clonale dei fenotipi tumorali nei vari organi di Drosophila .

I tessuti epiteliali sono sistemi altamente organizzati che hanno la straordinaria abilità homeostatica per mantenere la propria organizzazione attraverso lo sviluppo e il fatturato delle cellule. Questo robusto sistema di auto-organizzazione, tuttavia, è progressivamente interrotto durante lo sviluppo del tumore. All&#39;inizio dello sviluppo del tumore, all&#39;interno di uno strato epiteliale emergono singole cellule mutanti derivanti dall&#39;attivazione di oncogene o dall&#39;inattivazione del gene del soppressore tumorale. Quando questa &quot;cellula pro-tumorica&quot; ​​trasformata evita un ambiente soppressivo, interferisce con l&#39;organizzazione epiteliale e inizia la proliferazione incontrollata, la tumorigenesi si verifica 1 . Negli ultimi decenni, i notevoli progressi tecnologici nella genetica e nella biologia molecolare hanno fatto notevoli progressi sulla ricerca sul cancro. In particolare, recenti studi che utilizzano gli strumenti di analisi genetica mosaica in Drosophila melanogaster , come il recupero mitotico FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target)2 e flip-out-GAL4-UAS (sequenza di attivazione a monte) 3 , hanno contribuito notevolmente a una migliore comprensione dei meccanismi genetici coinvolti nella formazione e nella metastasi dei tumori 4 , 5 , 6 . Studi di un gruppo di geni gonfiori letali di Drosophila conservati, larve giganti letali ( lgl ), dischi di grandi dimensioni ( dlg ) e scribble ( scrib ), hanno evidenziato il rapporto critico tra la perdita di organizzazione epiteliale e lo sviluppo del tumore, in quanto questi geni svolgono ruoli chiave Nella regolazione della polarità delle cellule apicala-basali e della proliferazione cellulare nei tessuti epiteliali 7 . Mentre i dischi imaginal di Drosophila sono normalmente epiteli monolayered, mutazioni omozigote in ognuno di questi tre geni provocano la perdita della struttura e della polarità delle cellule, non differisconoReniate, sovraproliferano e, in ultima analisi, formano masse amorfe multistrato che si fusono con i tessuti adiacenti 7 . Allo stesso modo, la distruzione di questi geni nei mammiferi è coinvolta nello sviluppo di tumori maligni 8 , 9 . I fenotipi neoplastici esposti dai tessuti mutanti hanno portato alla classificazione di questi tre geni come geni conservati, neoplastici del soppressore del tumore (nTSGs) 7 , 8 . Tuttavia, quando le cellule mutanti nTSG omozigoti vengono generate sporadicamente nello sviluppo di dischi immaginari di tipo selvaggio utilizzando la ricombinazione mitotica mediata da FLP-FRT, le cellule mutanti vengono eliminate dal tessuto attraverso l&#39;apoptosi 10 , 11 , dipendente dalla c-Jun N-terminale chinasi (JNK) , 12 , 13 , 14 , estrusione 15 , 16 , o engulfment e fagocitosi da parte dei vicini 17 . In questa epiteli geneticamente mosaica, l&#39;apoptosi viene rilevata per lo più nelle cellule mutanti nTSG situate al limite del clone, suggerendo che le cellule normali adiacenti innescano l&#39;apoptosi delle cellule mutanti nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Recenti studi sulle cellule di mammiferi hanno confermato che questa eliminazione cellulare delle cellule pro-tumoriche è un meccanismo evolutivamente protetto contro il cancro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Un recente studio sui dischi imaginal Drosophila , tuttavia, ha mostrato che i cloni mosaici nTSG-knockdown inducono tumori neoplastici in specificiRegioni dei dischi imaginal di ala 16 . La formazione tumorale iniziale è sempre stata trovata nella regione &quot;cerniera&quot; periferica e non è mai stata osservata nella regione &quot;pouch&quot; centrale dell&#39;epitelio del disco dell&#39;ala, suggerendo che il potenziale tumorigenico delle cellule ntsg-knockdown dipende dall&#39;ambiente locale. La regione del sacchetto centrale funge da &quot;freddo&quot; del tumore in cui le cellule pro-tumorali non mostrano sovrapposizione displastica, mentre la regione di cerniera periferica si comporta come un &quot;hotspot tumorale&quot; 16 . Nelle regioni di sacche di &quot;coldspot&quot;, le cellule ntsg-knockdown si delaminano dal lato basale e subiscono l&#39;apoptosi. Al contrario, poiché le cellule a cerniere &quot;hotspot&quot; possiedono una rete di robuste strutture citoscheletriche sui loro lati basali, le cellule di coltura nTSG delaminano dal lato apicale dell&#39;epitelio e iniziano la crescita tumorigenica 16 . Pertanto, l&#39;analisi dei fenotipi tumorali nei dischi immaginari richiede un&#39;attenta analisiDerazione della suscettibilità specifica per regione a stimoli tumorigenici. Qui descriviamo un protocollo per indurre la formazione di tumori neoplastici nei dischi imaginali dell&#39;ala Drosophila che utilizzano il sistema GAL4-UAS- RNAi mediante i quali vengono generati nTSG-knockdown cellule nell&#39;epitelio normale dell&#39;ala. Anche se questi sistemi sperimentali sono utili per studiare le fasi iniziali del cancro, non è stato chiaramente descritto chiaramente un metodo di classificazione chiaro per valutare le fasi della progressione tumorale nell&#39;epitelio disco immaginario. Pertanto, proponiamo anche un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi clonali pro-tumori indotti nell&#39;epitelio di alafibre in tre categorie: iperplasia (accumulazione di un numero eccessivo di cellule apparenti normali con proliferazione aumentata), displasia (tessuto premaligeno composto da anomalie apparenti Cellule) e neoplasie (tumore benigno o maligno composto da cellule aventi un aspetto anomalo e pattern anomalo di proliferazione).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;tubulin&lt;/span&gt;</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Act&gt;CD2&gt;GAL4 (flip-out GAL4)&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>second chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

Nelle prime fasi del cancro, le cellule mutanti trasformate mostrano anomalie citologiche, iniziano la sovrabbondanza incontrollata e progressivamente distruggono l&#39;organizzazione tissutale. Drosophila melanogaster è emerso come un popolare sistema di modelli sperimentali nella biologia del cancro per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. In particolare, gli strumenti genetici per i dischi imaginal Drosophila (sviluppo epitelio in larva) consentono la creazione di cellule pro-tumor trasformate all&#39;interno di un normale tessuto epiteliale, una situazione simile a quella iniziale del cancro umano. Un recente studio sulla tumorigenesi nei dischi imaginali dell&#39;ala Drosophila ha tuttavia dimostrato che l&#39;iniziazione del tumore dipende dalla citoarchitettura intrinseca del tessuto e dal microambiente locale, suggerendo che sia importante considerare la suscettibilità specifica della regione a stimoli tumorigenici nella valutazione dei fenotipi tumorali in immagini dischi. Per facilitare l&#39;analisi fenotipica dei progressi tumoraliIn dischi immaginari, qui descriviamo un protocollo per esperimenti genetici usando il sistema GAL4-UAS per indurre tumori neoplastici nei dischi imaginal di ala. Abbiamo inoltre introdotto un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi delle lesioni clonali indotte nell&#39;epitelio immaginario, poiché un metodo di classificazione chiaro per discriminare le varie fasi della progressione tumorale (come iperplasia, displasia o neoplasia) non era stato precedentemente descritto. Questi metodi potrebbero essere generalmente applicabili all&#39;analisi clonale dei fenotipi tumorali nei vari organi di Drosophila .

Per dimostrare la formazione di tumori neoplastici sperimentalmente indotta da un nocciolamento nTSG mediato da RNAi nei dischi imaginal di ala Drosophila , sono stati utilizzati tre diversi driver GAL4 per esprimere UAS-RNAi per lgl o scrib : (1) sd-GAL4, che guida un&#39;espressione UAS forte nel Sacchetto ala e espressione lieve nelle regioni delle cerniere ( Figura 2 e Figura 3A ); (2) upd-GAL4, che guida nei sottodomini della cerniera, compresa una forte espressione in due domini della piega mediale dorsale, espressione lieve in un dominio anteriore-laterale e debole espressione nel dominio ventrale-posteriore ( Figura 2 e Figura 3C ); E (3) flip-out indotto da calore-scossa GAL4, che genera cloni mosaici casuali che esprimono geni UAS ( Figura 4 e Fi5). In tutti gli esperimenti, UAS-EGFP è stato coespresso con UAS-RNAi per contrassegnare i cloni di abbattimento. Primo, sd-GAL4 -driven lgl-RNAi è stato usato per indurre atterramento di LGL nel sacchetto ala e cerniera regioni. Nei dischi di terzo instar di controllo senza UAS-lgl-RNAi , non si è verificata alcuna alterazione morfologica ( Figura 3A ). Al contrario, in dischi di terzo istar che esprimono lgl-RNAi , le deformazioni epiteliali e le sovrapposizioni tumorigeniche sono state osservate chiaramente in alcune parti della cerniera ( Figura 3B ). Nella regione del sacchetto di ala, però, non è stata osservata la crescita plasmatica displastica. La forte espressione di MMP1 (matrice metalloproteasi-1) è stata osservata nelle lesioni tumorali delle cerniere ma non nella regione del sacchetto di ala ( Figura 3B ). Poiché l&#39;espressione di MMP1 è coinvolta nel degrado del membrana basaleÈ possibile che questi tumori di cerniera abbiano una capacità metastatica ( Figura 3B ). Successivamente, l&#39; aggiorn-GAL4 è stato usato per indurre la caduta del lgl nella regione cerniera. Nei dischi di terzo instar di controllo senza UAS-lgl-RNAi , non si sono verificate alterazioni morfologiche ( Figura 3C ). Tuttavia, dopo 5 giorni di AED, i dischi esterni di terzo instar con upd-GAL4 e lgl-RNAi hanno mostrato una disorganizzazione epiteliale prominente, con accumulo di F-actina e spostamento del clone dallo strato epiteliale ( Figura 3D ). A 6 giorni AED, i tumori neoplastici che esprimono MMP1 sono overgray nella regione cerniera ( Figura 3G ), anche se con variazioni nella dimensione tumorale tra i campioni ( Figura 3E e F ). Una sezione verticale della regione cerniera ha confermato che il tumore neoplastico subì una defibrillazione all&#39;estremità apicale dello strato epiteliale ( Per monitorare la progressione della crescita tumorale indotta da un collasso , i cloni sporadici che esprimono lgl-RNAi sono stati generati nei dischi di ala usando il sistema mosaico GAL4 flip-out indotto dal caldo-shock. Due giorni dopo lo scoppio di calore alle seconde larve instar (2 giorni di AED), alcuni cloni di knockdown lgl situati nella regione cerniera hanno mostrato una deviazione dal lato apicale dello strato epiteliale ( Figura 4A ). Quattro giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, le lesioni displasiche nella regione cerniera sono diventate chiare, suggerendo che i cloni di decompressione lgl sfollati dal lato apicale proliferano nel lumen ( Figura 4B ). Sette giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, le sovrapposizioni tumorigeniche dominavano le regioni delle cerniere ( Figura 4C ). Per dimostrare ilLa classificazione dei fenotipi clonali con il nostro metodo di diagnosi, i cloni sporadici che esprimono scrib-RNAi sono stati generati nei dischi di ala usando il sistema di mosaico GAL4 flip-out indotto dal caldo-shock. Cinque giorni dopo lo shock termico a seconda delle larve instar (2 giorni di AED), alcuni cloni di rilascio di scribi esprimenti GFP hanno mostrato fenotipi tumorigenici ( Figura 5A ). Abbiamo analizzato quattro cloni (B, C, D ed E in Figura 5A ) in sezioni verticali di immagini confocali z-stack usando ImageJ, perché è difficile acquisire i dettagliati fenotipi citologici e strutturali nelle immagini confcali 2D ( Figura 4 e Figura 5A ). I cloni B e C sono stati classificati come displasia come proteine ​​sezionate. Dischi di grandi dimensioni (Dlg) sono stati mislocalizzati ( Figura 5B e C ). Nel clone B, la dimensione della massa cellulare spostata dall&#39;epitelio non era maggiore di 4 cellule in diameteR ( Figura 5B ), mentre il clone C non ha deviato dall&#39;epitelio ( Figura 5C ); Quindi, i cloni B e C non sono stati considerati neoplastici. Tuttavia, i cloni D e E, che mostravano anche mislocalizzazione di Dlg, formavano masse cellulari tumorali al di fuori dell&#39;epitelio ( Figura 5D E 5E ). Poiché le dimensioni di questi cloni tumorali spostati erano più di 4 celle di diametro, i cloni erano classificati come neoplastici. Per indurre i tumori iperplastici o le formazioni di cisti nei dischi imaginali dell&#39;ala, sono stati generati cloni sporadici che esprimono oncogene Ras ( Ras V12 ) o forma costitutivamente attiva di Yorkie, un coattivatore trascrizionale del percorso Ippopotente ( Yki 3SA ) usando l&#39; effetto indotto da calore Sistema di mosaico GAL4 flip-out. Quattro giorni dopo lo scoppio di calore per la seconda larva instar (2 giorni AED), RaI cloni esprimenti V12- espressa con etichetta GFP sono diventati masse rotonde delle cellule nei dischi imaginali ( Figura 6A ). Una sezione verticale del clone esprimente Ras V12 (clone B nella Figura 6A ) ha rivelato che la massa cellulare dissociata dallo strato epiteliale ha una corretta localizzazione di Dlg, suggerendo che la massa cellulare mantenga normali strutture epiteliali al di fuori dello strato epiteliale ( Figura 6B ) . L&#39;espressione di MMP1 non è stata osservata in questi cloni esprimenti Ras V12 ( Figura 6C ). Pertanto, il clone B è stato classificato come formazione di cisti. Quattro giorni dopo lo scoppio di calore per la seconda larva instar (2 giorni AED), i cloni esprimenti Yki 3SA-etichettati da GFP formavano masse di cellule grandi nei dischi imaginali ( Figura 7A ). Ci siamo concentrati su due cloni (B e C in Figura 7A ). Il clone B ha mostratoL&#39;integrazione nello strato epiteliale e la corretta localizzazione di Dlg nelle membrane sub-apicale delle cellule epiteliali, suggerendo che il clone B esprimente YKI 3SA mantenesse la struttura epiteliale. Pertanto, il clone B è stato classificato come iperplasia ( Figura 7B ). Il clone C situato nella regione cerniera ha dimostrato la mislocalizzazione di Dlg e ha formato una struttura multistrato a livello basale dello strato epiteliale. L&#39;espressione di MMP1 non è stata osservata nei cloni esprimenti Yki 3SA. Considerati insieme, il clone C è stato classificato come neoplasia benigna ( Figura 7C e D ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramma di flusso per la classificazione dei fenotipi tumorali. Questo diagramma di flusso rappresenta un metodo di diagnosi per classificare le lesioni clonali in epitelio immaginario. Il classificatore(3) la proliferazione cellulare, (4) la dimensione del clone e (5) l&#39;espressione di MMP1. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig2.jpg" /> Figura 2: ( A ) Dischetto fantasma di tipo Wild, colorato per Dlg (verde) e nuclei (DAPI, magenta). ( B ) Rappresentazione schematica dei dischi imaginali di ala Drosophila che mostrano una zona di sacco di ala (blu), cerniera (arancio) e notum (verde). ( C ) Il disco fantasiale normale è macchiato per F-actina (rosso) e microtubuli (verde). Le membrane basali sono etichettate con collagene IV / Vkg-GFP (blu). ( D ) Sezione verticale del sitoContrassegnato con la linea tratteggiata bianca in ( C ). ( E ) I disegni di linea traccia i lati apicali (rossi) e basali (blu) dello strato epiteliale in ( D ). Linee tratteggiate tracciano la membrana peripodiale. Sono indicate le pieghe distali (Df), mediali (Mf) e proximal (Pf) della cerniera dorsale. Genotipi dettagliati: A, w - CD, Vkg-GFP <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig3.jpg" /> Figura 3: Tumorigenesis specifica del sito indotta da Enhancer-GAL4s. ( A , B ) Le immagini confocali mostrano i dischi fantasiali delle ali dissected dalle larve di terzo istar di genotipi indicati colorati per MMP1 (rosso). L&#39;esplorazione sd-GAL4Le regioni di ssing sono state etichettate con l&#39;espressione di GFP (verde). ( CG ) Le immagini confocali mostrano dischi imaginal di ala dissected dalle larve di terzo instar di genotipi indicati nel punto indicato AED. L&#39;F-actina è stata macchiata con Phalloidin (rosso) in ( CF ). L&#39;espressione di MMP1 è macchiata con anticorpi anti-MMP1 (rosso) in ( G ). Le regioni dell&#39;espressione -GAL4 sono state etichettate con l&#39;espressione GFP (verde). I pannelli inferiori di ( CF ) mostrano una vista ingrandita delle regioni indicate nei pannelli superiori. Le frecce bianche indicano lesioni displasiche indotte da cloni di lgl- knockdown. ( H ) Sezione verticale del sito contrassegnato con la linea bianca tratteggiata nel pannello inferiore di (E). Le linee tratteggiate bianche contraddistinguono i confini tra la borsa delle ali e le regioni delle cerniere in (A) e (B). I nuclei sono stati etichettati con DAPI (blu). Barre scala = 100 μm in (AG) e 50 μm in (H). Genotipi dettagliati: A, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; B, w - , sd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-LGL-RNAi; C, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; DH, w - , upd-GAL4, UAS-EGFP; UAS-dicer2; UAS-lgl-RNAi <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig4.jpg" /> Figura 4: Fenotipi tumorali indotti da cloni mosaici casuali. ( AC ) Le immagini confocali mostrano i dischi imaginali dell&#39;ala mosaica di larve di terzo istare con cloni co-esprimendo lgl-RNAi e GFP (verde) al punto indicato dopo l&#39;induzione del caldo-shock. I nuclei sono stati etichettati da DAPI (blu). I pannelli centrale mostrano una vista ingrandita delle regioni quadrate bianche contrassegnate nei pannelli a sinistra. Il pannello di destra<html> S mostrano schemi lineari del lato apicale degli strati epiteliali (blu) e dei cloni esprimenti GFP (verde). I cloni di mosaico situati nell&#39;epitelio sono rappresentati in verde chiaro mentre i tumori neoplastici che si differenziano dall&#39;epitelio sono mostrati in magenta. Le linee tratteggiate bianche nei pannelli di sinistra contrassegnano i confini tra la borsa delle ali e le regioni delle cerniere. Le frecce bianche nei pannelli medie indicano lesioni displasiche indotte da cloni di lgl- knockdown. Barre scala = 100 μm. Genotipi dettagliati: AC, hsFLP; UAS-dicer2; Agglutinare 2 giorni a 25 ° C in A, incubare 4 giorni a 25 ° C in B, incubare 7 giorni a 25 ° C in C dopo scosse termiche). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 5 &quot;class =&quot; xfigimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55901 / 55901fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5: Esame diagnostico dei fenotipi clonali dopplastici. ( A ) Il pannello a sinistra mostra un disco imaginale della terza instar larva con cloni co-esprimendo scrib-RNAi e GFP (verde) 5 giorni dopo l&#39;induzione di calore, colorati per Dlg (rosso). Il pannello a destra mostra un disegno schematico della parte apicale degli strati epiteliali (blu) e dei cloni esprimenti GFP (verde). I cloni di mosaico negli strati epiteliali sono mostrati in verde chiaro mentre i tumori neoplastici spostati dall&#39;epitelio sono mostrati in magenta. ( BE ) Le immagini confocali mostrano le sezioni verticali dei cloni di scansione di scorrimento indicati nel pannello destro di (A). I secondi pannelli a sinistra mostrano i pattern di localizzazione Dlg (rosso). I terzi pannelli a sinistra mostrano schemi lineari dei lati apicali (rossi) e basali (blu) degli strati epiteliali e del GFP-exprEssing scrib-clone di knockdown (verde). I cloni dopplasti negli strati epiteliali sono mostrati in verde chiaro (B e C) mentre i cloni neoplastici spostati dall&#39;epitelio sono mostrati in magenta (D e E). Le frecce bianche indicano cloni di scorrimento a scomparsa che mostrano il fenotipo tumorigenico. I nuclei sono stati etichettati con DAPI (blu). Barra di scala = 50 μm. Il fenotipo del tumore di ogni clone è stato classificato secondo il diagramma di flusso mostrato in Figura 1 . Genotipi dettagliati: AE, hsFLP; UAS-Scrib-RNAi; Atto&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP (30 minuti scosso a 2 giorni AED, incubare 4 giorni a 25 ˚C dopo shock termico). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig6.jpg" /> Figura 6: DiagnosTic Esame di Ras V12 -espressione di fenotipi clonali. ( A ) Il pannello a sinistra mostra un disco imaginale dell&#39;ala di messa a vista della terza instar larva con cloni co-esprimendo oncogenic Ras V12 e GFP (verde) 4 giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, colorati per Dlg (rosso). Il pannello a destra mostra un disegno schematico della parte apicale degli strati epiteliali (blu) e dei cloni esprimenti GFP (verde). La barra di scala rappresenta 50 μm. ( B ) Sezioni verticali dei cloni esprimenti Ras V12 indicati nel pannello destro di (A). I secondi pannelli a sinistra mostrano i pattern di localizzazione Dlg (rosso). I terzi pannelli a sinistra mostrano schemi lineari dei lati apicali (rossi) e basali (blu) degli strati epiteliali e dei cloni esprimenti Ras V12 e GFP (verde). Barra di scala = 25 μm. ( C ) Disco imaginale dell&#39;ala di mosaico della terza larga instar con cloni coespressi &lt;Em&gt; Ras V12 e GFP (verde) 4 giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, macchiati per MMP1 (rosso). Barra di scala = 100 μm. Genotipi dettagliati: AC, hsFLP; UAS-Ras V12 ; Atto&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP ( scongelato a caldo 45 minuti a 2 giorni AED, incubare 4 giorni a 25 ° C dopo shock termico). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55901/55901fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55901/55901fig7.jpg" /> Figura 7: Esame diagnostico di Yki 3SA- esprimendo i fenotipi clonali. ( A ) Il pannello sinistro mostra un disco imaginale della terza instar larva con cloni co-esprimendo Yki 3SA e GFP (verde) costruttivamente attivi 4 giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, colorati per Dlg (rosso). Il pannello di destra mostra come<html> La linea chimica del lato apicale degli strati epiteliali (blu) e dei cloni esprimenti GFP (verde). Barra di scala = 50 μm. ( BC ) Sezioni verticali dei cloni esprimenti Yki 3SA indicati nel pannello destro di (A). I secondi pannelli a sinistra mostrano i pattern di localizzazione Dlg (rosso). I terzi pannelli a sinistra mostrano schemi lineari dei lati apicali (rossi) e basali (blu) degli strati epiteliali e dei cloni esprimenti Yki e GFP (verde). Barra di scala = 25 μm. ( D ) Disco imaginale dell&#39;ala di mosaico della terza instar larva con cloni che coesprimono Yki 3SA e GFP (verde) 4 giorni dopo l&#39;induzione del caldo-shock, macchiati per MMP1 (rosso). Barra di scala = 100 μm. Genotipi dettagliati: AD, hsFLP ;; UAS-Yki 3SA / act&gt; CD2&gt; GAL4, UAS-EGFP (30 minuti a caldo a 2 giorni AED, incubare 4 giorni a 25 ° C).5901fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

L&#39;analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali.

Induzione e diagnosi dei tumori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K Views.  SOKENDAI.  L'analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali. 

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Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissezione di dischi immaginale da larve 3 Instar Drosophila

Biologia

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Medicina

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Biologia dello sviluppo

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Dissezione e Immunostaining di immaginale dischi da<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

drosofila Dissezione del disco immaginale larvale: un metodo per osservare lo sviluppo degli epiteli

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

Induzione e diagnosi dei tumori in

Riepilogo

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