Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

אנו מודים לג &#39;ואוגן על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ JSPS KAKENHI מענק מספרים 26891025, 15H01500 ו Takeda מדע הקרן מענק מחקר YT

1. לטוס צלבים ואינדוקציה משובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הזבובים בבקבוקון 12 שעות לפני איסוף זבובים בתולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הזבובים בבקבוקון על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום עף על גבי כרית זבוב CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 - 20 נשים בתולה ו -10 גברים מן CO 2 לטוס כרית לתוך בקבוקון טרי דגירה ליום 1 ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים אלה לתוך בקבוקון טרי דגירה במשך 12 שעות ב 25 ° C. הערה: להשליך את הבקבוקון הראשון כמו נקבות בתולה לא להניח מספיק ביצים ביום הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור משפר- GAL4 שורות, להסיר את הזבובים למבוגרים דגירה בקבוקון על 25 מעלות צלזיוס עד לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, להסיר את הזבובים המבוגרים דגירה בקבוקון עבור 2 - 4 ימים על 25 מעלות צלזיוס. זמן דגירה לפני הלם חום תלויה המטרה הניסויית. הלם חום 2 ימים לאחר הביצה בתצהיר (א.ד.) מייצר שיבוטי פסיפס בשנייה לא בוגר- אפיתיל דמיוני. הלם חום לאחר 3 או 4 ימים א.ד. מייצר שיבוטים פסיפס ב מובחן מוקדם עד אמצע השלישי epithelia הדמיון. הערה: חשוב לבחון את ההשפעה של תזמון חום שהשתנה על פנוטיפים טומוריגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אינדוקציה של שיבוטים פסיפס על ידי להעיף החוצה- GAL4, הלם חום הבקבוקון על ידי טבילה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 - 45 דקות ואחריו הדגירה של 2-3 ימים על 25 מעלות צלזיוס. הערה: מידע על זמן הזעזוע החום, העיתוי וזמן הדגירה בכל ניסוי מוצג באיור האגדות. </li></ol> 2. דיסקציה של הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נודדים instar השלישי עם מקל עץ או מלקחיים קהה, גנוטיפ אותם על ידי סמנים ניאון המתאים ( למשל , EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי פלואורסצנטי ומניחים אותם צלחת לנתיחה עם PBS (פוספט שנאגרו מלוחים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הזחלים PBS ידי pipetting עם 2 מ&quot;ל pipettes העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צבוט את מרכז הזחל עם מלקחיים אחת ולקרוע את הגוף לשניים עם מלקחיים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קמצוץ את הפה של החצי הקדמי עם מלקחיים אחד לדחוף את הפה לכיוון הגוף עם מלקחיים אחרים כדי להפוך את הגוף פנימה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חומרים מיותרים כגון בלוטות הרוק או גופים שומן עם מלקחיים. </li></ol> 3. קיבוע נוגדן מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלק הקדמי גזור של הגוף הזחל (כולל דיסקים כנפיים דמיוני) כדי צינור פלסטיק 1.5 מ&quot;ל לתקן 1 מ&quot;ל של פתרון תקן (פורמלדהיד 4% ב PBS) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך עם סיבוב עדין. זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לו פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. הערה: בחלק זה, כל השלבים מתרחשים על נוטאטור בטמפרטורת החדר בחושך, אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון תקן וזורקים. לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT (0.3% Tritב X-100 ב PBS) שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT ולהוסיף 1 מ&quot;ל של PBTG (0.2% אלבומין בסרום שור 5% בסרום עירום נורמלי PBT) לחסימת ו nutate 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBTG ולהוסיף פתרון נוגדן ראשוני בדילול נאות עם PBTG (ראה טבלה חומרים ) ו nutate לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון נוגדן ראשוני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל PBT שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBT ולהוסיף פתרון נוגדנים משני כראוי בדילול מלא עם PBTG (1: 400). Nutate עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדנים משני לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הכתם F- אקטין, להסיר PBT ולהוסיף פתרון Phalloidin בדילול נאותה PBS (1:40). ואז nutate במשך 20 דקות. הסר את הפתרון Phalloidin לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להדוף DNA גרעיני, להסיר PBT ולהוסיף DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של DAPI ב PBS). ואז nutate 10 דקות. זהירות: DAPI יש פוטנציאל מסרטן. ללבוש כפפות מגן ובגדים כדי למנוע מגע עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון DAPI לשטוף את הרקמות עם 1 מ&quot;ל של PBT פעמיים במשך 15 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף פעם 1 מ&quot;ל של PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 500 μL של גליצרול 100% כמו המדיום מראש הרכבה. </li></ol> 4. הרכבה על גבי שקופיות מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמות המוכתמות בשקופית מיקרוסקופ באמצעות פיפטה העברת פלסטיק 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמות טיפות של המדיום גובר על שקופית מיקרוסקופ אחר עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את קצה הרקמה גזור עם מלקחיים אחת ולמשוך משם דיסקים antennal העין עם מלקחיים אחרים. הערה: לשמור על המוח גזור למקום אותם ליד הדיסק דימיון כנף. המוח לפעול כפלטפורמה המונעת את coverslip מ מוחצת את האגף דיסקים דמיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד את הדיסק כנפיים הדימיון להחזיק בקצה של רקמה גזור עם מלקחיים אחד בעדינות לגרד את קיר הגוף ולקרוע את הדיסקים עם מלקחיים אחרים. הערה: אם קשה למצוא דיסקיות דימויים כנפיים, לקלף את קנה הנשימה מן האחורי אל הצד הקדמי. כנפיים דיגיטליות כנפיים מקל על קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לכסות את הדיסקים הדמיוניים עם coverslip וחותמת עם לק. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש תמונות confocal באמצעות מיקרוסקופ confocal להגדיר תמונה פרמטרים הרכישה כולל טווח של גל פליטה, עוצמת לייזר, רווח, היסט, מהירות סריקה גודל התמונה 24 . הערה: לקבלת הליך מפורט של הגדרות רכישת תמונות, עיין במדריך ההוראות המצורף על ידי כל יצרן מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ללכוד שיתוף יחידקטעים nfocal של דיסק שלם אגף כולו, להשתמש בעדשה אובייקטיבית 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 3-ממדי תמונות על ידי Z- מחסנית סריקה בגודל צעד של 0.5 - 1.0 מיקרומטר באמצעות עדשות 40X או 60X. הערה: כדי לנתח פנוטיפים סלולריים ברזולוציה גבוהה, גודל התמונה צריך להיות גדול מ 512 x 512 פיקסלים. </li></ol> 6. ניתוח תמונה באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיג &#39;י, קוד פתוח ImageJ התוכנה התמקדה ביולוגי ניתוח התמונה (https://fiji.sc/) 25 , לרכוש ולנתח confocal z- מחסנית תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש חלקים אנכיים, לפתוח את z- ערימת תמונות ImageJ ובחר פריט בתפריט &quot;תמונה / ערימות / Reslice.&quot; הערה: ניתן לבחור בציר XZ או בציר YZ בתפריט Reslice. סעיף אנכי ניתן להשיג גם בכיוון שרירותי על ידי ציור קו ישר או מלבן על התמונה z- מחסנית. </li></ol> 7. אבחון פנוטיפים ניאופלסטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את האנכימקטעים (XZ או ציר YZ) המתקבל קבוצה אחת של z- מחסנית תמונות ולנתח פנוטיפים מורפולוגיים מכתים נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אבחון של פנוטיפים הגידול, בעיקר להתמקד בשלוש נקודות הבאות: (1) אם מסה התא, כולל שיבוטים מציאה, סוטה מן השכבה אפיתל הראשי, (2) אם לוקליזציה subcellular של חלבונים jnctional משתנה מסה זו התא , ו (3) אם הקוטר של מסת התא הזה הוא גדול מ 4 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיווג פנוטיפים הגידול לפי תרשים זרימה המתואר בתרשים 1 . </li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role.">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li><li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+proliferation+control:+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors.">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li><li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+alterations+in+carcinoma:+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators.">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger/TNF+signaling+in+Drosophila.">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li><li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Lgl+and+Mahjong/VprBP+in+cell+competition.">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter.">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition.">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li><li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia.">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li><li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots,+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment.">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).</li><li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila.">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li><li>Men&#233;ndez, J., P&#233;rez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway.">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li><li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells.">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li><li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells.">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells.">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li><li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels.">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li><li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDAC:+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals.">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+6,300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li><li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc,+Yorkie,+Wingless+and+ribosome+biogenesis.">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li><li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states.">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation.">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li><li>Colombani, J., Andersen, D. S., L&#233;opold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing.">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li><li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation.">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מערכת GAL4-UAS הוא אחד הכלים הגנטיים החזקים ביותר עבור ביטוי גנים ממוקד תסיסנית 26 ומאפשר מאוד אינדוקציה תא הגידול וניתוח ב vivo 4 . מערכת זו מאפשרת את הדור של שיבוטים נושאת מציאה של גנים מדכאי גידול או overexpression של אונקוגנים בתוך רקמת אפיתל wild-type, מצב דומה מאוד בשלבים הראשונים של סרטן האדם שבו תאים פרו תאים סרטניים מוקפים בתאי אפיתל נורמלי. GAL4 קווי הנהג מוסדר על ידי רצפים משפר כגון GAL4 משפר קווי מלכודת או קווי Janelia GAL4 27 יש ייחודי, spatiotemporally מוגבלים הביטוי patters. לכן, אלה משפר- GAL4 שורות שימושיים כדי לגרום לגידולים באופן עקבי באזורים מוגבלים של דיסקים דמיוניים. בנוסף sd-GAL4 ו עדכון GAL4 המוצג במחקר זה, אנו אישר כי lgl- knockdown המושרה בקווי GAL4 y משפר-מלכודת אחרים, כולל engrailed-GAL4 (en-GAL4), קיפוד GAL4 (hh-GAL4), optomotor סמיות-GAL4 (OMB-GAL4), תוקנו-GAL4 (PTC-GAL4) ו spalt-המייג&#39;ור GAL4 ( salm-GAL4 ) יכול לייצר גידולים ניאופלסטיים באזורי הצירים של דיסקים דמיוניים כנפיים. אם דפוס הביטוי GAL4 משפר צריך להיות נשלט זמנית, שילוב של GAL4 וגירסת טמפרטורה רגישה של GAL80 (GAL80 TS ) היא אופציה. GAL80 TS מדחיק GAL4 פונקציה ב 18 מעלות צלזיוס, אבל לא ב 29 ° C, אשר מאפשר ביטוי UAS- טרנסגנים להיות מופעל או כבוי לפי הצורך 28 . מערכת הפסיפס של ה- GAL4, המשלבת את מערכת FLP-FRT ומערכת ה- GAL4-UAS 3 , יוצרת שיבוטים אקראיים בדיסקים דמיוניים. על ידי שילוב של פליפז הלם- in-flipase (hsFLP) עם פליפ החוצה GAL4, העיתוי של שיבוט generatיון הוא לשליטה. מכיוון שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי הדיסק הדמיוני עשוי להיות תלוי בשלב ההתפתחותי, באינדוגנציה אנדוגנית, ו / או בידול תאים 29 , 30 , חשוב מאוד לבחון את ההשפעה של תזמון חום מזערי על פנוטיפים טומוריגניים. הוכח בעבר כי שיבוטים מוטנטים nTSG עוברים אפופטוזיס תלויי תא, כאשר הם מוקפים בתאי wild-type 10 , 11 , 12 , 18 , דבר המצביע על כך שמוטציות מרובות נדרשות לשינוי תאים במהלך התפתחות הסרטן. למעשה, overexpression של ראס oncogenic או יקי ב lgl או שיבוט מוטציה סופר הופך אותם לגידולים אגרסיביים 10 , 18 , 31 בעוד misביטוי של ראס V12 או Yki 3SA אינו גורם neoplasm ממאיר לבד ללא מוטציות nTSG. כפי שמוצג כאן בעבר 16 , Pro- הגידול שיבוטים nTSG-knockdown שנוצר דיסקים כנף wild-type גם עוברים אפופטוזיס לא מראים tumorigenesis בכיס כנף 16 . במקביל, שיבוטים nTSG-knockdown הממוקם בצירים &quot;נקודות חמות&quot; להתפתח לגידולים neoplastic ללא כל מוטציות oncogenic נוספים. באזורים הצירים, תאים nTSG לקוי לחטוף endusous Janus kinase / מתמר אות activator של שעתוק (JAK / STAT) איתות לנהוג tumorigenesis 16 . לכן, צירים ספציפיים GAL4s כגון עדכון GAL4 הם כלים שימושיים לעקב באופן עקבי היווצרות הגידול נויפלסטי על ידי RNAi מוכות המכות של גנים מדכאי הגידול. למרות flip-out-GAL4-Induced nTSG-downdown פסיפס שיבוט גם לגרום לגידולים ניאופלסטיים מחדש צירGions, תופעת tumorigenesis תלויה בגודל שיבוט ראשוני: שיבוטים גדולים שנוצרו על ידי הלם חום מעל 20 דקות בדרך כלל לגרום לגידול, ואילו רוב שיבוטים קטנים שנוצר על ידי הלם חום קצר מ 10 דקות יבוטלו לחלוטין (KM ו- YT, נתונים שלא פורסמו). מספר מחקרים שנעשו לאחרונה על התפתחות הגידול וסרטן השימוש להשתמש תסיסנית דיסקים דמיוניים כמערכת מודל 32 , 33 . המשותף למחקרים אלה כולל מספר סמנים של גידולים ניאופלסטיים: מסות תאים סמויות, צורות דיסק מעוותות, הצטברות של F-actin, רכיבה על תאים משופרת (שילוב של BrdU / EDU או ביטוי PH3), הפעלת איתות JNK ומטרה MMP1 למיקוד במורד, קרום המרתף הפרעה ו / או חוסר תפקוד אפיתלי, כולל אובדן או חלוקה תת-תאית של חלבונים המעורבים בקוטביות תא אפית-בקאלית (פירורים, סטארדאסט, פאט`, אפ&quot;ק, בזוקה / PAR-3 או PAR-6)(Lgl, Scrib, Dlg או Coracle), או דבקות בצמתים (E-Cadherin או Armadillo). פנוטיפים אלה הם לזיהוי בקלות על ידי מכתים נוגדן קונבנציונאלי. למרות שקשה לקבוע אם פנוטיפ המשובש הוא היפרפלזיה, דיספלסיה, ניופלסמה שפירה או ניאופלזמה ממאירה בשלב מוקדם של הגידול, זה צריך להיות פשוט יותר ב epishelia דיסוזופיל הדימיון המורכב של monolayer אפיתל יחיד. במחקר זה, הצגנו שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים גידולים המושרה monolayer אפיתל ( איור 1 ). שיטה זו מחייבת תצפיות זהירות של חמישה קריטריונים באמצעות z- מחסנית confocal תמונות; כל קריטריון אבחון ניתן לבדוק על ידי מכתים נוגדן קונבנציונלי הדמיה confocal. אחד הקריטריונים החדשים שהצגנו בשיטה זו הוא &quot;קריטריונים בקוטר 4 תאים&quot; אשר מפלה בין דיספלסיה ו neoplasm בדיסקים דמיוניים. תאים Pro-tumor כגון שיבוטים מוטציה nTSG הם תכופיםLy extruded מ שכבות אפיתל באמצעות תחרות תא או איזון ציר , 15 , 16 , 34 . ברוב המקרים, תאים אלה extruded אפופטוז, ולכן הם לא יכולים להתרבות. למרות שזה עשוי להיות אפשרי כי תאים Pro הגידול לעבור חלוקה התא פעם במהלך שחול ופעם או פעמיים יותר לאחר שחול, זה עושה מסת התא של בקוטר 2-3 תאים. לכן, אם המסה התא של תאים Pro הגידול סוטה משכבת ​​אפיתל גדול יותר בקוטר 4 תאים, אנו יכולים לקבוע כי הם שורדים ו מתרבים כמו ניאופלזמה מחוץ לשכבת אפיתל. למרות ששיטת אבחון זו היא פשוטה, זה קריטי לקחת קורס זמן של פנוטיפים, כמו התפתחות הגידול ממאירות מתקדמת לאורך זמן. לדוגמה, דיספלסיה היא רקמה חריגה מבחינה ציטולוגית ומצב מעבר בין גידולים שפירים לחלוטין לבין אלה שהם מראשמַמְאִיר. לכן, גם אם שיבוט שנצפה מוגדר דיספלסיה על פי תרשים זרימה ( איור 1 ), ייתכן כי דיספלסיה לאחר מכן מתפתח לתוך ניאופלזמה. למרות שלב הזחל מוגבל בזמן (5 - 6 ימים ב 25 ° C או 4 - 5 ימים ב 29 ° C א), גידול הגידול בדיסקים דמיוניים מאריך את שלב הזחל באמצעות עיכוב דמוי אינסולין עיכוב המושרה של pupariation 35 , 36 . לכן, היווצרות גידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיוניים מאפשר לראות את הגידול המשוערת הגידול פנוטיפי במשך כמה ימים נוספים. שיטת סיווג פשוטה שלנו עשוי להיות ישים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

רקמות אפיתל הן מערכות מאורגנות מאוד, כי יש יכולת הומיאוסטית יוצאת דופן לשמור על הארגון שלהם באמצעות פיתוח מחזור התא. מערכת זו עצמית מאורגנת, עם זאת, הוא שיבשו בהדרגה במהלך התפתחות הגידול. בתחילת התפתחות הגידול, תאים מוטציה בודדים הנובעים הפעלה אונקוגן או גידולים סרטניים inactivation להתגלות בתוך שכבת אפיתל. כאשר זה השתנה &quot;Pro-הגידול התא&quot; מתחמק בסביבה מדכאת, משבש ארגון אפיתל, ומתחיל התפשטות בלתי מבוקרת, tumorigenesis מתרחשת 1 . במהלך העשורים האחרונים, התקדמות טכנולוגית יוצאת דופן בגנטיקה וביולוגיה מולקולרית עשו התקדמות מדהימה על מחקר הסרטן. במיוחד, מחקרים שנעשו לאחרונה באמצעות כלי ניתוח פסיפס גנטית ב תסיסנית melanogaster , כגון FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase היעד) recombin מיטוטיAtion 2 ו flip-out-GAL4-UAS (במעלה מפעיל רצף) מערכות 3 , תרמו רבות להבנה טובה יותר של המנגנונים הגנטיים המעורבים היווצרות גרורות של גידולים 4 , 5 , 6 . מחקרים של קבוצת גני תסיסנית גידול משתיק משומרים, זחלי ענק קטלניים (LGL), דיסקים גדולים (dlg), ולקשקש (scrib), הדגישו את הקשר הקריטי בין הפסד של ארגון אפיתל התפתחות גידולים, כמו גנים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים ב ויסות קוטביות תא אפית, ותאי תאים ברקמות אפיתל 7 . בעוד שדיסקופיית הדיסקופיליה היא בדרך כלל אפיתיל מונוליר, מוטציות הומוזיגיות בכל אחד משלושת הגנים האלה גורמים לתאים לאבד מבנה וקוטביות,לשכור, overproliferate, ובסופו של דבר להרכיב multorayered המוני אמורפיים כי הפתיל עם רקמות סמוכות 7 . כמו כן, הפרעה של גנים אלה יונקים מעורב בפיתוח של גידולים ממאירים 8 , 9 . הפנוטיפים הניאופלסטיים המוצגים על ידי הרקמות המוטנטיות הובילו לסיווגם של שלושה גנים אלה כגנים משמרים, נויפלסטיים, מדכאי גידולים (nTSG) 7 , 8 . עם זאת, כאשר תאים הומוזיגיים nTSG מוטציה הם שנוצר באופן ספורדי בפיתוח wild-type דימויים דמיוניים באמצעות רקומבינציה מיטבית FLP-FRT בתיווך, תאים מוטציה מסולקות מן הרקמה דרך אפקטוזיס C- יוני K- מסוף (JNK), אפופטוזיס תלויים 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , שחול 15 , 16 , או engulfment ו phagocytosis על ידי השכנים 17 . ב אפיתל זה מוזאיקה גנטית, אפופטוזיס הוא זוהה בעיקר בתאי מוטציה nTSG הממוקם בגבול שיבוט, דבר המצביע על כך תאים נורמליים סמוכים מפעילה אפופטוזיס של תאים nTSG מוטציה 10 , 11 , 12 , 18 . מחקרים שנערכו לאחרונה בתאי יונקים אישרו כי חיסונים אלה התומכים בתאי גזע של תאים פרו-סרטניים הם מנגנון הגנה עצמית אפיתלי משומר מבחינה אבולוציונית נגד סרטן 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . מחקר שנערך לאחרונה תסיסנית דיסקים דמיוניים, לעומת זאת, הראה כי פסיפס nTSG-knockdown שיבוט גורם גידולים ניאופלסטיים specifאיזורים של כנפיים דימויים דימויים 16 . היווצרות ראשונית של הגידול נמצאה תמיד באזור &quot;ציר&quot; הפריפריאלי ולא נצפתה באזור המרכזי של &quot;שקיק&quot; של אפיתל הדיסק של האגף, דבר המצביע על כך שהפוטנציאל הטומוריגני של תאי NTSG-knockdown תלוי בסביבה המקומית. אזור שקיק מרכזי פונקציות כמו &quot;coldspot הגידול&quot; שבו תאים Pro הגידול אינם מראים overgroastic דיספלסטי, ואילו באזור ציר ההיקפי מתנהג כמו &quot;נקודה חמה&quot; 16 . ב &quot;coldspot&quot; אזורים שקיק, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד הבסיסי ועוברים אפופטוזיס. לעומת זאת, כמו &quot;נקודה חמה&quot; תאים הציר להחזיק רשת של מבנים cytoskeletal חזקים על הצדדים הבסיסיים שלהם, תאים nTSG-knockdown delaminate מן הצד האפי של אפיתל וליזום צמיחת יתר של טומוריגנית 16 . לכן, ניתוח של פנוטיפים הגידול בדיסקים דמיוניים דורש consi זהירשל רגישות ספציפית לאזור לגירויים טומוריגניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לעורר היווצרות הגידול neoplastic בתקליטורים כנף תסיסנית הדיסק באמצעות מערכת GAL4-UAS- RNAi שבו תאים nTSG-knockdown נוצרים epithelia דיסק epaghelia רגיל. למרות אלו מערכות ניסיוניות שימושיים ללמוד את השלבים המוקדמים של סרטן, שיטה סיווג ברור להעריך את השלבים של התקדמות הגידול ב epithelia דיסק דמיוני לא תוארה בבירור לפני. לכן, אנו מציעים גם שיטת אבחון לסווג פנוטיפים המשובטים הגידול המושרה epithelia דיסק האגף לשלוש קטגוריות: hyperplasia (הצטברות של מספר מופרז של תאים מופיעים נורמלי עם התפשטות מוגברת), דיספלסיה (רקמה prealignant מורכב להופיע באופן חריג תאים), ו neoplasia (גידול שפיר או ממאיר המורכב של תאים בעלי מראה חריג דפוס התפשטות לא נורמלי).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;tubulin&lt;/span&gt;</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Act&gt;CD2&gt;GAL4 (flip-out GAL4)&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>second chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

בשלבים המוקדמים של הסרטן, תאים מוטנטיים שהשתנו מראים תקלות ציטולוגיות, מתחילים בשגשוג בלתי מבוקר, ומפריעים בהדרגה לארגון הרקמות. תסיסנית melanogaster התפתחה כמערכת מודל ניסיוני פופולרי ביולוגיה של סרטן ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. בפרט, כלים גנטיים עבור דיסוזופיל דימיוני דיסקים (לפתח epithelia בזחלים) לאפשר יצירת תאים Pro- הגידול הופכים ברקמה אפיתל רגיל, מצב דומה לשלבים הראשונים של סרטן האדם. מחקר שנערך לאחרונה על tumorigenesis בדיסקופיית כנפיים תסיסנית , לעומת זאת, הראה כי ייזום הגידול תלוי cytoarchitecture המהותית ואת הסביבה microenviron המקומית, דבר המצביע על כך חשוב לשקול את האזור ספציפי רגישות לגירויים tumorigenic בהערכת פנוטיפים הגידול בדמיון דיסקים. כדי להקל על ניתוח פנוטיפי של הגידול progressiב דיסקים דמיוני, כאן אנו מתארים פרוטוקול ניסויים גנטיים באמצעות מערכת GAL4-UAS כדי לגרום לגידולים ניאופלסטיים בדיסקים דמיון כנף. בנוסף, אנו מציגים שיטת אבחון כדי לסווג את פנוטיפים של נגעים משובצים המושרה epithelia דמיוני, כמו שיטת סיווג ברור להפלות בשלבים שונים של התקדמות הגידול (כגון היפרפלזיה, דיספלזיה, או neoplasia) לא תוארה קודם לכן. שיטות אלה עשויים להיות חלים באופן נרחב על ניתוח המשוב של פנוטיפים הגידול באיברים שונים תסיסנית .

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.8K Views.  SOKENDAI.  ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את...

Video: Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

רצף הדור הבא לצורך זיהוי של מוטציות שניתן לפעול ב מוצק לנוזל גידולים

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

Biology

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

פרוטוקול גנטי אינדוקציה ויזואליזציה של גידולים שפירים ופולשני בסוג cephalic מכלולי<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Medicine

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Developmental Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video