우리는 싱크로트론 데이터 수집시 지원을위한 스위스 광원, 폴 Scherrer의-연구소, Villigen, 스위스의 빔라인의 X06DA에서 직원을 감사드립니다. 우리는 우수한 기술 지원 모니카 Gompert에 감사하고 있습니다. 이 프로젝트는 쾰른 대학에서 지원과 독일 연구 협의회에서 INST 216 / 682-1 FUGG을 부여했다. CP에 개발 건강과 질병의 국제 대학원에서 박사 교제는 인정된다. 이러한 결과로 이어지는 연구는 보조금 계약 번호 283570 (BioStruct-X)에서 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 / 2007-2013)에서 자금을 받았다.

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The authors have nothing to disclose.

X 선 결정학은 여전히 단백질 (28)의 입체에 가까운 해상도 원자 구조를 결정하기위한 가장 빠르고 가장 정확한 방법이다. 그러나, 잘 정렬 된 단결정의 성장을 필요로한다. 이들은 종종 얻을 수 어렵고, 결정 상태는 인공이다. 그러나, 다른 방법에 의해 결정된 것과 X 선 결정학에 의해 결정된 구조 단백질의 비교 특히 NMR, 일반적으로 매우 잘 일치 함을 나타낸다. PPEP-1의 경우에, NMR 구조는 S 루프의 이동을 포함하여, 우리의 결정 구조 (14)가 최근 29 방송 잘 일치 출판. 이 프로토콜은 구조 연구 및 태그가없는 rPPEP-1의 결정화 및 구조 결정을위한 N 말단 그의-태그 rPPEP-1 단백질의 생산 및 정제에 대해 설명합니다. 단일 결정은이 경우에 성장하기 어려운했고, 특별한 microseeding 절차를 요구했다. t에서그는 절 다음 우리는 PPEP-1의 결과를 논의하고 프로토콜이 다른 단백질의 생산 및 결정화에 적용 할 수있는 방법을 나타냅니다. 구조 설계 및 발현에 변화 결정화가 의한 결정화 성공 및 단백질 구조 (30)에 미치는 가능한 영향에 다이제스트 트롬빈하여 그 태그를 제거하는 것이 바람직하다 같이 rPPEP-1은 N 말단 그의 태그가 변형 (도 1a)로 표현된다. 다른 단백질 것이거나 떠날 N을 단자 (예, 벡터 pET22b 및 3 &#39;말단에서 종결 코돈없이 역방향 프라이머 같은 제한 부위를 사용하여 복제) 추가로 C 말단 그의-태그 버전을 테스트하는 것이 바람직 할 수있다 태그 결정화시 도움이 될 수 있습니다 어떤 경우에는 그의 태그는, 비 절단. 는 C 말단 그의 - 태그 구조의 rPPEP-1 수율과 안정성을 위해 떨어진다. 가장들에 대한 또한, 초기 테스트oluble 단백질 발현은 다음 대장균에 포함되어야 BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS 균주 또는 Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) 코돈 플러스 RIPL 또는 로제타 2 (DE3), BL21 (DE3) 별 및 세 개의 상이한 온도 / 배양 시간에서 C41 (DE3) (37 ° C, 5 내지 30 ℃에서 시간 밤새 20 ℃에서 3-4 시간). 클로닝 전에 관심있는 단백질의 절단을 방지하기 ExPASy PeptideCutter 도구 (31)를 이용하여 내부의 트롬빈 절단 부위의 존재를 확인한다. 또한, HRV3C의 절단 부위를 제공 가능한 벡터가 (즉, EMBL의 PETM-14 32) 또는 TEV 단백질 분해 효소 (즉, EMBL의 PETM-11). 단백질 정제 rPPEP-1 구축을 위해 세포 용해는 얼음 / 물에 초음파를 통해 수행된다. 응집 또는 셀 교란이 이용 될 수도 관련된 더 &quot;부드러운&quot;세포 용해 방법을 석출하는 경향이 더 민감한 단백질디. 이러한 화학적으로 세포 용해 균법을 사용하는 경우 검출되지 않는 제 원심 분리 단계 후에 불용성 단백질 대량의 확인. rPPEP-1의 정제 일반적 NiNTA 수지 2의 용액을 이용 하였다. 선택된 수지의 단백질 결합 능력이 얼마나 큰에 대한 제조업체의 지침을 읽고 그에 따라 조정. rPPEP 1 수지의 1 ml의 단백질이 많은 컬럼에 바인딩시키고, 관류 (도 1D)에서 발견되었고, 사용 된 첫 정제를한다. 정제 된 단백질의 순도를 낮출 수있는 너무 많은 수지를 사용하는 반면에. NiNTA 행렬에 사용 된 그의 - 태그 구조의 결합 친화에 이미 다졸 농도를 조정합니다. 단계적 세정 절차가 여기에 바람직하다 (즉, 10 mm의 30 mm의 50 mm의 70 mM의 이미 다졸)를 A280 모니터링하고 각 단계에서 기준선에 도달하도록 허용되는. 이런 식으로 어떤 단백질은이 기간 동안 용출 할 경우에도 손실되지 않습니다(50 또는 70 mM의에서 예) 고 이미 다졸 세척 단계. 의 경우 NHIS-rPPEP -1- 일부 단백질은 이미 다졸 30 밀리미터로 용출하지만, 나타내는 단백질 종 어떤 불분명하다. 이미 다졸은 투석 또는 단백질 용액에서 희석하면 일부 단백질 / 응집체를 침전. 이러한 경우에 비해, 이미 다졸없이 버퍼의 5~10 배량을 넣은 비커에 넣고, 용출 이미 다졸의 농도를 저하 예 150 mM의 용출 완충제 이미 다졸의 농도 및 높은 다졸 농도에 노출되는 시간을 줄일 계획 용출 볼륨. 밤새 4 ° C에서 단백질의 밀리그램 당 2 단위의 트롬빈과 NHIS-rPPEP-1 배양의 경우 거의 100 %로 자신의 태그를 절단하기에 충분하다. 20 ° C 4 ° C에서 mg의 단백질 당 1-10 단위를 사용하여 관심있는 단백질 트롬빈의 양을 조절합니다. 5 ~ 10 분 간격의 원심 한외 여과 장치의 일시 중지를 사용하여 페이지를 혼합 단백질을 농축 할 때rotein은 집중에 건물 농도 구배를 균질화한다. 그렇지 않으면 고농도의 단백질은 / 침전물을 집계 할 수 있습니다. 결정화 rPPEP -1- 끊임없이 X 선 회절 분석에 적합하지 않은 높은 (intergrown)의 결정 (단결정, 따라서 다수의 결정 격자를 갖는 각각의 위에 성장) 생성한다. 설명은 너무 많은 핵 이벤트가 위상도 (그림 7)의 핵 영역에서 발생되는 수 있습니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/55022/55022fig7.jpg" /> 그림 7 : 단백질 결정화 실험의 단계도. 단백질이 과포화 될 때 결정에만 형성 할 수있다. 핵은 준 안정 영역에서 핵 영역과 결정 성장이 일어난다. 단백질은 포화되지 때 드롭은 명확 유지됩니다. &lt;그런 다음 rPPEP-1의 어떤 핵을 상황을 개선하지 않습니다 단백질 또는 침전제 농도의 저하 P 클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 더 이상 관찰과 방울 분명히있어. 작은 핵이 rPPEP-1의 결정은 결국 성장하는 준 안정 영역 (그림 7)에 직접 가져대로 Microseeding는 선택의 방법이었다. 원래의 조건 (2.4 M 암모늄, 인산, 0.1 M 트리스 pH를 8.5)를 위치 C5 (도 4) (pH 및 침전물의 농도보다는 높은 단부)에 위치되는 방식으로 새로운 대부분 최적화 화면을 설계함으로써 조건은 준 안정 영역 (16) (도 7)의 일부를 나타내는데, 높은 성향 하부로 과포화 상태에 대응한다. 따라서, 파종시에하게된다 핵은 잠재적으로 큰 단결정으로 성장 할 수 있습니다. 원래 종자 재고 (10)를 희석 할 수있는 절차 (새로 형성된 결정의 양과 크기)를 최적화하려면 <suP&gt; -2 (10) -5. 여기에 시드 주식의 여러 희석이 큰 단일 결정의 생산에 가장 적합한 종자 희석을 확인하기 위해 테스트 할 수있다. 또는 동물 수염이나 꼬리 머리 (토끼, 고양이, 칠 또는 말)를 사용하여 연속 파종은 33 사용될 수있다. 절차는 제품 펩티드 rPPEP-1의 기질 펩티드 공동 결정화하기 위해 사용될 수있다. 최적화 절차에서 250 : 1.25 Å까지 회절 공간 그룹 P2 (1)의 크리스탈이 씨앗 주식에서 얻었다는 1 희석. 두 공간 군 1 2 1 2 1 (비 결합 단백질) 및 P2 (1) (복합 구조) (P2)의 최적화 프로 시저의 인산 암모늄 화면 내의 매우 유사한 조건에서 발생하는 동안 결정이 성장한다. 때문에 모두 R-PPEP-1 결정 형태, 활성 부위의 초회 항원 자극 측면을 해결 주로 모든 작은 분자 및 펩티드에있는 크리스탈 포장에 혼자 soake 수결정에 거라고. 분자의이 팀은 결정에 존재하는 용매에서 액세스 할 수 있습니다. 서브 사이트 또는 프라임 측 모두 어드레싱 분자 만 S 루프 개구로서 rPPEP -1-와 공동 결정화 될 필요하지만 활성 사이트들을 수용하기 위해 요구된다. 또한, 상기 3 잔기 기질 펩티드의 길이를 제한하는 사실 - 또한 rPPEP-1 S3&#39;site (이 영역의 결정 콘택트 판촉) 근처의 기질 결합 부위로부터의 출구에 인접 분자에 의해 접촉 이 두 가지 결정 형태로 끝났다면. 크리스탈 장착 및 극저온 보호 단백질 결정의 설치하면 실체 현미경 하에서 조작에 약간의 기술이 필요하므로 연습을 필요로하는 방법이다. backgroun에 기여하는 결정의 주위 용매의 과량을 방지 할 나일론 루프 (또는 원하는 다른 루프 예 litholoop)의 최적 길이를 선택D 산란 회절 데이터 잡음비 따라서 낮은 신호. 최적의 루프 크기 / 길이 또한 루프를 통해 미끄러하지 않는 결정으로 쉽게 결정의 낚시를합니다. 약 100 내지 200 ㎛의 긴 치수이다 rPPEP-1의 결정에 대해서는, 0.1 ~ 0.2 mm 크기의 나일론 루프가 선택되었다. 크라이-보호제는 극저온 상태로 전송 될 때 결정이 삼투압 충격이 발생할 수 있으므로, 데이터 품질의 악화에 기여할 수있다. 이 방해 또는 결정의 내부 질서를 파괴 할 수있다. 조심스럽게 극저온 보호제의 종류와 농도를 선택합니다. rPPEP -1- 결정 크라이 보호 20 % 글리세롤, 30 %의 자당과 하나였다. 다른 리간드 rPPEP-1의 기질 펩티드 복합체 또는 복합 결정화, 자당 크라이 보호제로서 선택해야하는지 글리세롤 rPPEP 1 기판 (14)의 결합 부위의 프라임 위치에 결합있다. 구조 결정 AutoSol 솔루션은 49.2 ± 18.4의 베이 즈-CC, 0.41의 FOM (장점의 그림), 0.17의 스큐와 0.85의 상관 RMS를 획득했습니다. 모델 맵의 상관 관계는 0.86이고, R / R 무료 요소는 0.21 / 0.24이다. 모든 이들 파라미터는 성공적인 구조 용액을 나타낸다.

클로스 트리 디움 디피는 원내 항생제 관련 설사 감염 1의 주요 원인 중 하나입니다. 이 그람 양성 혐기성 세균은 분변 - 경구 경로를 통해 그 포자 양식을 통해 전송된다. 지난 10 년, 새로운 &#39;전염병&#39; &#39;또는&#39; &#39;hypervirulent&#39; &#39;균주 (/ 027 예를 들어, BI / NAP1)는 북미와 유럽이 새로운 감염과 사망률의 급격한 증가가 발생했습니다. C. 디피 -associated 질환 (CDAD)는 높은 사망률 3 생명을 위협하는 대장 염증이다. 증상은 설사 4에서 위 막성 대장염 (5)와 종종 치명적 독성 거대 결장 (6)에 이르기까지 다양합니다. 유독 균주 다제 내성 및 재발 7 높다으로 CDAD 치료가 어렵다. 현재 치료법은 항생제 메트로니다졸, fidaxomicin 또는 반코마이신 또는 repetiti에 포함에서vely 재발하는 경우 분변 미생물 이식. 새로운 치료 전략이 시급히 8 필요하다. 일부 진보가 C. 디피 독소 B (9)을 대상으로, 치료 단클론 항체 Bezlotoxumab로 기록, 최근 성공적으로 임상 3 상을 통과하고 FDA 및 EMA에 승인을 신청했다. 또한, 새로운 항생제 임상 시험 (10)의 다른 단계에서 순간에서 시험되고있다. 새로운 치료 표적을 식별해야 효과적인 치료를 개발합니다. (; CD2830 / Zmp1, PPEP-1 EC 3.4.24.89)가 최근 C. 디피 단백질 분해 효소 프롤린 - 프롤린 엔도 펩 티다 제-1 발견 노크 아웃 변형에 PPEP-1의 부족 등 유망한 대상이되고, C의 독성을 감소 . 생체 내 11 디피. PPEP-1은 C 말단에 두 C. 디피의 adhesins를 절단 분비 메탈로 12, 13 (13), 따라서 부착 bacter를 해제인간의 장내 상피 세포에서 아이오와. 따라서, C. 디피의 정착과 운동성 표현형 사이의 균형을 유지에 관여한다. PPEP-1에 대해 선택적 저해제를 개발하고 그 기판의 입체 구조의 자세한 지식이 필요 불가결 인식하는 방식을 이해하는 것이. 우리는 기질 펩티드 14 PPEP-1 단독 컴플렉스의 제 결정 구조를 해결했다. PPEP-1은 제 1 공지 프로테아제 두 개의 프롤린 잔기 (15) 사이를 선택적으로 절단하여 펩티드 결합. 이것은 이중 꼬임 방식으로 기판에 결합하고, 프로테아제 활성 부위 (14)를 덮는 S 루프에있는 잔기 연장 된 지방족 - 방향족 네트워크를 통해 안정화. 이 기판 결합 모드는 PPEP-1에 고유하며 현재까지 인간의 단백질 분해 효소에서 찾을 수 없습니다. 이것은 유망한 약물 표적하게, 매우 가능성 억제제의 오프 대상 효과. 화면 선택 PPEP-1 INH 개발하려면ibitors은 향후 순수한 단 분산 PPEP-1 단백질의 다량이 필요하다. 또한, 결정되어야 할 것이다 PPEP-1 제 억제제, 공동 결정 구조의 결합 모드를 결정한다. 우리의 손에 PPEP-1은 지속적으로 (intergrown)의 결정을 생성합니다. 따라서 우리는 PPEP-1의 단일 회절 품질의 결정을 생성하는 최적화 과정을 개발 하였다. 이 프로토콜에서 우리는 구체적으로 PPEP-1 (14)의 생산, 정제, 결정화 및 구조 솔루션을 설명합니다. 우리는 분비 신호 서열, 정제 태그의 제거와 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피 부족한 PPEP-1 변이체의 대장균 세포 내 발현을 사용하여, 아연의 단일 파장 이상 분산을 통해 최적화 화면 구조 결정에 16 microseeding 이어 (아연 SAD) 17. 이 프로토콜은 (다른 단백질의 제조 및 구조 결정에 적용 할 수있다 예를 들어, &lt;/ EM&gt; 메탈로) 및 (intergrown)의 결정을 생산하는 단백질 관한 것이다. 요청시 구조물의 플라스미드 DNA는 (는 pET28a-는 NHIS-rPPEP-1)의 회절 데이터는 교육 목적으로 제공 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Genes / Vectors / cell strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a vector</td><td>Merck-Millipore</td><td>69864</td><td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; strain BL21 (DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td>RNase H deficient</td></tr><tr><td>Codon-optimized gene (for &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;) of PPEP-1 (CD630_28300)</td><td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td><td>custom</td><td>amino acids 27-220</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td>aqueous-silicone emulsion</td></tr><tr><td>Agar</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A1008</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>any</td><td></td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem</td><td>A1073</td><td>Buffer grade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215996</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>any</td><td></td><td>purest grade</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>any</td><td></td><td>for storage and cryocooling of crystals</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (general)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>any</td><td></td><td>providing temperatures of 20 &amp;deg;C - 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glassware</td><td>any</td><td></td><td>baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8 L)</td></tr><tr><td>Centrifuge for large culture volumes</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge for processing volumes up to 12 L</td></tr><tr><td>Sonicator Vibra-Cell VCX500</td><td>Sonics</td><td>SO-VCX500</td><td>or any other sonicator / cell disruptor</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>any</td><td></td><td>centrifuge providing speeds up to 150,000 x g</td></tr><tr><td>NiNTA Superflow resin</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Empty Glass Econo-Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7371007</td><td>or any other empty glass or plastic column</td></tr><tr><td>Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography system &amp;Auml;kta Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td>or any other chromatography system</td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectra/Por 3</td><td>Spectrum Labs</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing closures</td><td>Spectrum Labs</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafiltration units (concentrators) 10,000 NWCO</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spectrophotometer</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment (crystallography)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low volume pipette 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Positive displacement pipette Microman M10</td><td>Gilson</td><td>F148501</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization robot</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells</td><td>TTP</td><td>4150-05810</td><td>or any other 96-well crystallization plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24-well CombiClover Junior Plate</td><td>Jena Bioscience</td><td>EB-CJR</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Clear Sealing Tape</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-511</td><td></td></tr><tr><td>Siliconized Glass Cover Slides</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-225</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++</td><td>Jena Bioscience</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>JBS Beads-for-Seeds</td><td>Jena Bioscience</td><td>CO-501</td><td></td></tr><tr><td>CrystalCap SPINE HT (nylon loops)</td><td>Hampton Research</td><td>diverse</td><td>loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm</td></tr><tr><td>CrystalCap Vial</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-904</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 800 ml</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-673</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Foam Dewar 2 L</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-675</td><td></td></tr><tr><td>Vial Clamp, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-670</td><td></td></tr><tr><td>CrystalWand Magnetic, Straight</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-729</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane 6 Vial Holder</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-711</td><td></td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-708</td><td></td></tr><tr><td>CryoCane Color Coder - White</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-713</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight microforcep</td><td>any</td><td></td><td>for manipulation of sealing tape. &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Acupuncture needle</td><td>any</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from a pharmacy</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>any</td><td></td><td>for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X</td></tr></tbody></table>

production, crystallization and structure determination of c. difficile ppep-1 via microseeding and zinc-sad

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

rPPEP-1은 대장균 BL21 (DE3) 스타 (도 1C)에서 가장 높은 수율로 여러 대장균 균주에서 과발현된다. 제 NiNTA 친 화성 크로마토 그래피 단계 후 6xHis 태그가 성공적으로 단백질의 대부분으로부터 절단 될 수 있으며, 상기 제 NiNTA 단계에서 소화되지 않은 단백질은 완전히 트롬빈 분해 단백질 (도 1D)로부터 분리 될 수있다. 가끔 대부분의 아마 이량 종 (그림 2A)에 해당하는 잘난척와 모노머와 같은 S200 16/600 열 태그가없는 rPPEP-1를 마이그레이션합니다. 단백질은 (도 2b) 순수 수율 대장균 배양 한 L 내지 약 50 mg의 단백질이다. rPPEP -1- 종종 인산염을 포함하는 다양한 조건 (도 3)의 결정화. 결정은 매우 모든 조건에서 (intergrown)의, 그래서 결정 최적화를 수행했다있다. 그림 4는 schem을 묘사최적화 절차의 전자는 상태 상업적 화면 SaltRx E4 (52) (그림 3B-C)에서 발생하는 결정에 대해 수행. 다시 (intergrown)의 결정은 우물 A6-D6 (그림 4)에서 나타났다. microseed 스톡은 최적화 화면 상태 C6 (2.55 M 암모늄, 인산, 8.5, 0.1 M 트리스 pH가)에서 성장 된 결정의 제조 1 희석 : 모액 1000. 두 7 일 분명 높은 회절 품질의 큰 단일 격자 결정은 대부분의 상품에 (그림 5) 관찰되었다 방울 다른 나머지 20 조건에 희석 씨의 재고와 함께 파종 후. 1.67 Å 해상도로 나일론 루프 (도 5E)의 회절 데이터로 결정의 장착 후에 비정상적인 신호를 2로 연장 아연 SAD (표 1)로 구조 분석을 위해 수집 하였다. 또한, 1.4 Å 해상도 네이티브 회절 데이터는 HIG의 측정을 위해 수집했다H - 해상도 구조 (표 1). rPPEP-1의 결정 구조 (그림 6)과 R에 세련된 기본 구조의 모델을 해결할 수 / 1.4 Å 해상도에서 0.156 / 0.182 무료 요인을 R (PDB ID : 5A0P) (14) (더 정제에 대한 통계는 표 참조 1). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 구조 / 데이터 세트 </td><td> 피크 아연-SAD </td><td> 원주민 </td></tr><tr><td> 데이터 수집 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 공간 그룹 </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td></tr><tr><td> A, B, C의 (a) </td><td> 43.17, 71.68, 117.70 </td><td> 43.17, 71.77, 117.80 </td></tr><tr><td> α, β, γ (°) </td><td> 90, 90, 90 </tD&gt; <td> 90, 90, 90 </td></tr><tr><td> 파장 (Å) </td><td> 1.28254 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 해상도 (Å) </td><td> 45.5-1.67 (1.72-1.67) </td><td> 45.5-1.40 (1.49-1.40) </td></tr><tr><td> 관찰 번호 </td><td> 779,717 (34,025) </td><td> 310,074 (45,851) </td></tr><tr><td> 독특한 반사의 번호 </td><td> 80,960 (5597) </td><td> 71,874 (11,172) </td></tr><tr><td> 다수 </td><td> 9.6 (6.1) </td><td> 4.3 (4.1) </td></tr><tr><td> 완전성 (%) </td><td> 99.2 (93.0) </td><td> 98.2 (95.6) </td></tr><tr><td> Rmerge (%) </td><td> 6.8 (56.5) </td><td> 5.2 (52.6) </td></tr><tr><td> &lt;I / σ (I)&gt; </td><td> 21.86 (2.81) </td><td> 15.66 (2.48) </td></tr><tr><td> CC (1/2) (%) </td><td> 100 (85.1) </td><td> 99.9 (85.5) </td></tr><tr><td> 제련 통계 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> R의 w오크 / R 무료 D (%) </td><td></td><td> 15.60 / 18.17 </td></tr><tr><td> 비 H 단백질 원자 번호 </td><td></td><td> 3109 </td></tr><tr><td> 물 분자의 번호 </td><td></td><td> (532) </td></tr><tr><td> 이온 / 무거운 원자 번호 </td><td></td><td> 이 아연 </td></tr><tr><td> 다른 분자의 번호 </td><td></td><td> - </td></tr><tr><td> TLS 그룹의 번호 / 체인 </td><td></td><td> 9 </td></tr><tr><td> 제곱 평균 제곱근 편차 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 결합 길이 (Å) </td><td></td><td> 0.006 </td></tr><tr><td> 본드 각도 (°) </td><td></td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> 보통 B 인자 (2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 모든 단백질 원자 </td><td></td><td> 16.12 </td></tr><tr><td> 물 </td><td></td><td> 29.74 </td></tr><tr><td> 다른 원자 </td><td></td><td> 10.12 </td></tr><tr><td> 라마 찬드 란 조사 구 전자 (%) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 가장 선호 </td><td></td><td> 98.72 </td></tr><tr><td> 또한 허용 </td><td></td><td> 1.28 </td></tr><tr><td> 허용 </td><td></td><td> 0 </td></tr><tr><td> PDB 항목 </td><td></td><td> 5a0p </td></tr></tbody></table> 표 1 : 데이터 수집 및 정제 통계.

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

11.5K 조회수.  University of Cologne. Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein. 

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

연구

화학

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

생화학

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

면역학 및 감염병학

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

생물학

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

생산, 결정화 및 구조 결정의

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