Wir danken dem Personal an der beamline X06DA an der Synchrotron Lichtquelle Schweiz, Paul-Scherrer-Institut, Villigen, Schweiz, für Unterstützung bei der Synchrotron-Datenerfassung. Wir sind für einen ausgezeichneten technischen Support zu Monika Gompert dankbar. Das Projekt wurde von der Universität zu Köln unterstützt und gewähren INST 216 / 682-1 fugg von der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Ein Promotionsstipendium von der International Graduate School in Entwicklung Gesundheit und Krankheit zu CP quittiert. Die Forschung zu diesen Ergebnissen geführt haben, wurden von der Europäischen Gemeinschaft Siebten Rahmenprogramm (FP7 / 2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr 283570 (BioStruct-X) erhalten.

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The authors have nothing to disclose.

Röntgenkristallographie ist immer noch die schnellste und genaueste Methode zur Bestimmung dreidimensionaler nahe Strukturen mit atomarer Auflösung von Proteinen 28. Es erfordert jedoch das Wachstum von gut geordneten Einkristallen. Diese sind oft schwer zu bekommen und der kristalline Zustand ist künstlich. Ein Vergleich der Proteinstrukturen durch Röntgenkristallographie mit den durch andere Verfahren bestimmt jedoch, insbesondere NMR, zeigt im Allgemeinen eine sehr gute Übereinstimmung. Im Falle von PPEP-1, veröffentlicht ein NMR kürzlich 29 zeigt eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit unseren Kristallstruktur 14, einschließlich der Beweglichkeit der S-Schleife. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Reinigung von N-terminal His-tagged rPPEP-1-Protein für Strukturuntersuchungen und die Kristallisation und Strukturbestimmung von unmarkierte rPPEP-1. Einkristalle waren schwierig in diesem Fall, zu wachsen und eine spezielle microseeding Verfahren erforderlich. in ter folgenden Abschnitt werden wir die Ergebnisse für PPEP-1 und zeigen diskutieren, wie das Protokoll für die Herstellung und Kristallisierung eines anderen Proteins angepasst werden könnte. Variationen über Konstrukt Design und Ausdruck rPPEP-1 wird als N-terminal His-Tag - Variante (Abbildung 1A) ausgedrückt wird , als für die Kristallisation ist es bevorzugt , 30 das His-Tag durch Thrombin verdauen aufgrund ihrer möglichen Auswirkungen auf die Kristallisation Erfolg und Proteinstruktur zu entfernen. Für andere Proteine kann es sinnvoll sein , zusätzlich ein C-terminal His-markierte Version zu testen (zB geklont die gleichen Restriktionsstellen unter Verwendung der Vektor pET22b und einen Rückwärtsprimer , ohne Stoppcodon am 3&#39; - Ende) oder die N-terminal zu verlassen His-tag ungespalten, wie in einigen Fällen ein Etikett während der Kristallisation kann helfen. Für rPPEP-1 die Ausbeute und Stabilität eines C-terminal His-tagged Konstrukt war minderwertig. Darüber hinaus wird eine erste Tests für die besten soluble Proteinexpression sollte in den folgenden E. coli - Stämme enthalten sein: BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS oder Lemo21 (DE3), BL21 (DE3) Codon sowie RIPL oder Rosetta 2 (DE3), BL21 (DE3) Star und C41 (DE3) bei drei verschiedenen Temperaturen / Inkubationszeiten (3-4 h bei 37 ° C, 5 h bei 30 ° C und über Nacht bei 20 ° C). Vor dem Klonen, überprüfen Sie die Existenz eines internen Thrombinschnittstelle durch die ExPASy PeptideCutter Werkzeug 31 Spaltung des Proteins von Interesse zu verhindern. Alternativ gibt es Vektoren zur Verfügung eine Schnittstelle für HRV3C (dh des EMBL PETM-14 32) oder TEV - Protease (dh des EMBL PETM-11) bereitstellt. Proteinreinigung Für rPPEP-1-Konstrukte wird Zelllyse über Beschallung auf Eis / Wasser durchgeführt. Für empfindlichere Proteine, die Verwendung zu aggregieren oder eine &quot;sanfte&quot; Zell-Lyse Verfahren, das die eine Zelle Disruptor neigen auszufallen sein könnted. Check für große Mengen an unlöslichem Protein nach dem ersten Zentrifugationsschritt, die nicht erkannt werden, wenn Lyseverfahren wie chemische Zelllyse verwendet. Zur Reinigung von rPPEP-1 in der Regel 2 ml der NiNTA-Harz verwendet wurden. Lesen Sie den Anweisungen des Herstellers, wie groß die Proteinbindungskapazität des gewählten Harzes und entsprechend anpassen. In den ersten Aufreinigungen von rPPEP-1, wobei nur 1 ml Harz verwendet wurde, wurde eine Menge von Protein an die Säule gebunden und wurde nicht in den Durchströmungs (1D) gefunden. Auf der anderen Seite zu viel Harz unter Verwendung könnte die Reinheit des gereinigten Proteins zu senken. Stellen Sie die Imidazol-Konzentration auf die Bindungsaffinität des verwendeten His-tagged Konstrukt zur NiNTA Matrix. Eine schrittweise Waschverfahren wird hier bevorzugt (dh 10 mM, 30 mM, 50 mM, 70 mM Imidazol), in dem die A280 überwacht wird und erlaubt wird , um die Basislinie bei jedem Schritt zu erreichen. Auf diese Weise wird kein Protein verloren, auch wenn es während einer eluieren würdehohe Imidazol Waschschritt (zB bei 50 oder 70 mM). Im Falle von NHis-rPPEP-1 einige Protein eluiert bereits bei 30 mM Imidazol, aber es ist unklar, welche Art von Proteinspezies, die sie darstellt. Einige Proteine ​​auszufällen / Aggregat beim Imidazol dialysiert oder aus der Proteinlösung verdünnt. In solchen Fällen reduzieren , um einen 5-10-fachen Volumen an Puffer ohne Imidazol der Konzentration von Imidazol in dem Elutionspuffer auf 150 mM und die Zeit der Exposition gegenüber hohen Konzentrationen Imidazol, beispielsweise eine Verringerung der Konzentration von Imidazol durch Elution in ein Becherglas , das im Vergleich zu die geplante Elutionsvolumen. Für NHis-rPPEP-1-Inkubation mit 2 Einheiten Thrombin pro mg Protein über Nacht bei 4 ° C ausreichen, um das His-Tag zu fast 100% zu spalten. Stellen Sie die Menge an Thrombin für das Protein von Interesse unter Verwendung von 1-10 Einheiten pro mg Protein bei 4 ° C bis 20 ° C. Wenn die Konzentration des Proteins eine Zentrifugal-Ultrafiltrationseinheit Pause in Intervallen von 5-10 min mit und die p mischenrotein zum Konzentrationsgradienten homogenisieren im Konzentrator aufzubauen. Ansonsten hochkonzentrierte Protein könnte aggregieren / Niederschlag. Kristallisierung rPPEP-1 produziert ständig stark verwachsene Kristalle (Einkristalle wachsen auf der jeweils anderen, so dass mehrere Kristallgitter aufweisen), die für die Analyse Röntgenbeugung nicht geeignet sind. Die Erklärung könnte sein , dass zu viele Nukleation Ereignisse in der Keimzone des Phasendiagramms passiert sind (Abbildung 7). <img alt="7" src="/files/ftp_upload/55022/55022fig7.jpg" /> Abbildung 7: Phasendiagramm eines Proteinkristallisationsexperiment. Kristalle können nur bilden, wenn das Protein übersättigte. Nukleation erfolgt in der Nukleierungszone und das Kristallwachstum in der metastabilen Zone. Wenn ein Protein untersättigter ist, wird der Tropfen klar bleiben. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Senkung des Proteins oder Fällmittel Konzentrationen die Situation nicht verbessern, da dann keine Nukleation von rPPEP-1 wird nicht mehr beobachtet und die Tropfen bleiben klar. Microseeding war die Methode der Wahl, als winzige Kerne direkt in die metastabile Zone gebracht werden, in denen rPPEP-1 Kristalle schließlich wachsen (Abbildung 7). Durch die Optimierung Bildschirm in einer Weise zu gestalten , dass der ursprüngliche Zustand (2,4 M Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 M Tris pH 8,5) an der Position C5 liegt (Abbildung 4) ( und nicht das obere Ende des pH - Werts und Fällmittel Konzentration) die meisten der neuen Bedingungen entsprechen mit geringeren Übersättigung mit einer hohen Neigung zu einem Zustand 16 eines Teils der metastabilen Zone darzustellen (Abbildung 7). Somit werden die Kerne, die bei der Aussaat in kann gebracht werden wachsen möglicherweise zu große Einkristalle. Zur Optimierung dieses Verfahrens (Menge und Größe der neu gebildeten Kristalle) die ursprüngliche Saatgut 10 verdünnt werden <sup&gt; -2 bis 10 -5. Hier sind mehrere Verdünnungen der Saatgut getestet werden, um die besten seed Verdünnung zur Herstellung großer Einkristalle zu bestimmen. Alternativ Streifen Impfen ein Tier Whisker oder Schweifhaar (Kaninchen, Katze, Chinchilla oder Pferd) 33 verwenden könnte eingesetzt. Das Verfahren kann verwendet werden, um Produkt-Peptide und Substrat-Peptide rPPEP-1 co-kristallisieren. Kristalle in der Raumgruppe P2 1 Beugen bis zu 1,25 Å wurden aus Samen Aktien erhalten 1: 250 verdünnt in der Optimierungsprozedur. Kristalle wachsen in den zwei Raumgruppen 1 2 1 2 1 (ungebundenes Protein) P2 und P2 1 (komplexe Strukturen), während sie von sehr ähnlichen Bedingungen innerhalb des Ammoniumphosphat Bild des Optimierungsverfahrens stammen. Aufgrund der Kristallpackung in beiden r-PPEP-1 Kristallformen gefunden, hauptsächlich alle kleine Moleküle und Peptide, die die ungestrichenen Seite der aktiven Stelle Adressierung könnte allein Elemente dringenD in die Kristalle. Diese Seite des Moleküls von dem Lösungsmittel in dem Kristall zugänglich. Jedoch Moleküle sowohl Unterseiten oder die grundierte Seite Adressieren nur mit rPPEP-1, wie S-loop Öffnung zu co-kristallisiert benötigen würde benötigt, um sie in der aktiven Stelle unterzubringen. Zusätzlich rPPEP-1 durch die benachbarte Moleküle am Austritt aus dem Substrat-Bindungsstelle in der Nähe des S3&#39;site (Förderung von Kristall Kontakte in diesem Bereich) kontaktiert - eine Tatsache, die auch die Länge der Substratpeptide begrenzt bis 3 Reste am grundierte Seite in diesen beiden Kristallformen. Kristall Montage und Kryo-Schutz Montage von Proteinkristallen ist eine Methode, die etwas Geschick bei der Manipulation unter dem Stereomikroskop erfordert und muss daher etwas Übung. Wählen Sie die optimale Länge der Nylonschlaufe (oder andere Schleife der Wahl, zB litholoop) den Überschuss an Lösungsmittel um den Kristall zu verhindern , die zu backgroun trägtd Streuung und damit ein niedrigeres Signal-Rausch-Verhältnis der Beugungsdaten. Die optimale Schleifengröße / Länge macht auch Fischen der Kristalle leichter als der Kristall nicht rutscht durch die Schlaufe. Für rPPEP-1-Kristalle, die etwa 100 bis 200 &amp; mgr; m in der längsten Abmessung sind, Nylonschlaufen von 0,1-0,2 mm Größe wurden ausgewählt. Die Kryo-Schutzmittel kann auch zu einer Verschlechterung der Datenqualität beitragen, wie der Kristall einen osmotischen Schock, wenn auf die Kryo-Zustand übertragen auftreten können. Dies kann behindern oder sogar die innere Ordnung des Kristalls zu zerstören. Wählen Sie sorgfältig die Art und Konzentration des Kryo-Schutzmittel. rPPEP-1 Kristalle wurden Kryo-geschützt mit entweder 20% Glycerol oder 30% Saccharose. Wenn Kristallisieren einem Substrat-Peptid - Komplex oder einem Komplex aus rPPEP-1 mit einem anderen Liganden sollte Saccharose als Kryo-Schutzmittel ausgewählt werden , wie bindet Glycerin auf die grundierte Stelle der Substratbindungsstelle von rPPEP-1 14. Strukturbestimmung Die autosol Lösung erhalten einen BAYES-CC von 49,2 ± 18,4, eine FOM (Figure of Merit) von 0,41, eine Schrägstellung von 0,17 und eine Korrelation von 0,85 RMS. Das Modell Karte Korrelation beträgt 0,86 und die R / R frei Faktoren sind 0,21 / 0,24. Alle diese Parameter deuten auf eine erfolgreiche Strukturlösung.

Clostridium difficile ist eine der Hauptursachen für nosokomiale Antibiotika-assoziierter Diarrhoe Infektionen 1. Diese grampositive anaerobe Bakterium wird durch seine Sporenform über die fäkal-oral übertragen. In den letzten zehn Jahren neue &#39;&#39; Epidemie &#39;&#39; oder &#39;&#39; hyper &#39;&#39; Stämme (zB BI / NAP1 / 027) führte zu einer drastischen Zunahme der Neuinfektionen und Todesraten in Nordamerika und Europa 2. C. difficile - assoziierten Erkrankungen (CDAD) ist eine lebensbedrohliche Kolon Entzündung mit einer hohen Sterblichkeitsrate 3. Die Symptome reichen von Durchfall 4 bis Pseudomembrankolik 5 und der oft tödlich verlauf toxisches Megakolon 6. Die Behandlung von CDAD ist schwierig , da die virulente Stämme multiresistente und die Rate Wiederholung sind hoch 7. Im Moment Therapie umfasst die Antibiotika Metronidazol, Fidaxomicin oder Vancomycin oder in repetitively rezidivierende Fälle fäkale Mikrobiota Transplantation. Neue therapeutische Strategien sind dringend 8 benötigt. Einige Fortschritte als therapeutische monoklonale Antikörper Bezlotoxumab aufgezeichnet zielt, C. difficile Toxin B 9, wurde vor kurzem erfolgreich Phase III der klinischen Studien bestanden und wurde für die Zulassung bei der FDA und EMA eingereicht. Zusätzlich neue Antibiotika in verschiedenen Stadien der klinischen Versuche im Augenblick geprüft 10 werden. Zur Entwicklung wirksame Behandlung neue therapeutische Targets identifiziert werden müssen. Die vor kurzem entdeckte C. difficile - Protease - Prolin-Prolin - Endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) ist so ein vielversprechendes Ziel, wie der Mangel an PPEP-1 in einem Knock-out - Stamm nimmt die Virulenz von C . difficile in vivo 11. PPEP-1 ist ein sekretiertes Metalloprotease 12,13 Abspalten zwei C. difficile Adhäsine an ihrem C-Terminus 13 somit die Freigabe der anhaftenden bacteria aus dem menschlichen Darmepithel. Daher ist es bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts zwischen dem sessile und motile Phänotyps von C. difficile beteiligt. Zur Entwicklung selektiver Inhibitoren gegen PPEP-1 und zu verstehen, wie sie ihre Substrate intime Kenntnis der dreidimensionalen Struktur erkennt ist unverzichtbar. Wir haben die erste Kristallstruktur PPEP-1 allein und im Komplex mit einem Peptid - Substrat 14 gelöst. PPEP-1 ist der erste bekannte Protease spaltet Peptidbindungen zwischen zwei Prolinreste 15 selektiv. Es bindet das Substrat in einem zwei geknickte Weise und stabilisiert sie über einen längeren aliphatisch-aromatischen Netzwerk von Resten in der S-Schleife angeordnet, die die Protease - aktiven Stelle 14 erstreckt. Dieses Substrat-Bindungsmodus ist einzigartig für PPEP-1 und nicht in der menschlichen Proteasen bisher gefunden. Dies macht es ein vielversprechendes Medikament Ziel, und Off-Target-Effekte von Inhibitoren sehr unwahrscheinlich. Zur Entwicklung und Bildschirm selektive PPEP-1-INHibitors in der Zukunft eine große Menge an reinem und monodisperse PPEP-1-Protein benötigt. Weiterhin ist die Art der Bindung der ersten Inhibitoren, Co-Kristallstrukturen mit PPEP-1 zu bestimmen, wird bestimmt werden müssen. In unseren Händen PPEP-1 produziert ständig verwachsene Kristalle. So haben wir ein Optimierungsverfahren zur Herstellung von einzelnen Beugungs Qualität Kristalle von PPEP-1 entwickelt. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich in der Produktion, Reinigung, Kristallisation und Strukturlösung von PPEP-1 14. Wir verwenden die intrazelluläre Expression in Escherichia coli einer PPEP-1 - Variante die Sekretions - Signalsequenz, Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie unter Entfernung des Reinigungsmarkierung fehlt, gefolgt von 16 microseeding in einem Optimierungs Bildschirm und Strukturbestimmung mittels Zink Einwellenlängen-anomale Dispersion (Zink-SAD) 17. Dieses Protokoll kann für die Produktion und die Strukturbestimmung von anderen Proteinen (zB angepasst werden &lt;/ Em&gt; Metalloproteasen), insbesondere für Proteine ​​verwachsene Kristalle zu erzeugen. Auf Wunsch Plasmid-DNA des Konstruktes (pET28a-NHis-rPPEP-1) und Beugungsdaten können für Bildungszwecke zur Verfügung gestellt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="657">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Genes / Vectors / cell strains</td>
			<td style="width:83px;"></td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pET28a vector</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>69864</td>
			<td>Thrombin cleavable N-terminal His-tag</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain BL21 (DE3) Star</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C601003</td>
			<td>RNase H deficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300)</td>
			<td>Geneart (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>custom</td>
			<td>amino acids 27-220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Yeast extract</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tryptone</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antifoam B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5757</td>
			<td>aqueous-silicone emulsion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-HCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1087</td>
			<td>Buffer grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Buffer grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNaseI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1073</td>
			<td>Buffer grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>215996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 100%</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>purest grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for storage and cryocooling of crystals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment (general)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shaking incubator</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>providing temperatures of 20 &#176;C - 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glassware</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>baffled Erlenmeyer flasks (50 ml - 2.8L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge for large culture volumes</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>centrifuge for processing volumes up to 12 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator Vibra-Cell VCX500</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>SO-VCX500</td>
			<td>or any other sonicator / cell disruptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>centrifuge providing speeds up to 150.000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NiNTA Superflow resin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Empty Glass Econo-Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7371007</td>
			<td>or any other empty glass or plastic column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;">28989335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chromatography system &#196;kta Purifier</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28406264</td>
			<td>or any other chromatography system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dialysis tubing Spectra/Por 3</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dialysis tubing closures</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name</td>
			<td style="width:83px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment (crystallography)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low volume pipette 0.1-10 &#181;l</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Positive displacement pipette Microman M10</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F148501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Crystallization robot</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells</td>
			<td>TTP</td>
			<td style="width:136px;">4150-05810</td>
			<td>or any other 96-well crystallization plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well CombiClover Junior Plate</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>EB-CJR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Crystal Clear Sealing Tape</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized Glass Cover Slides</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>diverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>diverse</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JBS Beads-for-Seeds</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CO-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CrystalCap SPINE HT (nylon loops)</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>diverse</td>
			<td>loop sizes 0.025 mm - 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CrystalCap Vial</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Cryogenic Foam Dewar 800 ml</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:247px;">Cryogenic Foam Dewar 2L</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vial Clamp, Straight</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CrystalWand Magnetic, Straight</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CryoCane 6 Vial Holder</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CryoSleeve</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CryoCane Color Coder - White</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Straight microforcep</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for manipulation of sealing tape. etc.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acupuncture needle</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>e.g. from a pharmacy</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Stereo microscope</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production, crystallization and structure determination of c. difficile ppep-1 via microseeding and zinc-sad

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

rPPEP-1 wird in verschiedene E. coli - Stämmen überexprimiert, mit der höchsten Ausbeute in E. coli BL21 (DE3) Star (Abbildung 1C). Nach dem ersten Chromatographieschritt NiNTA Affinität der 6xHis-Tag erfolgreich von den meisten werden können des Proteins und in dem zweiten Schritt NiNTA unverdaute Protein vollständig von Thrombin-verdautem Protein (1D) abgespalten getrennt werden können. Auf einer S200 - Säule 16/600 unmarkierte rPPEP-1 wandert als Monomer mit gelegentlichen Front wahrscheinlich auf die dimere Spezies (2A) entspricht. Das Protein ist reines (2B) , und die Ausbeute liegt bei etwa 50 mg Protein aus 1 l E. coli - Kultur. rPPEP-1 kristallisiert in verschiedenen Zuständen (Abbildung 3), oft Phosphat enthält. Die Kristalle werden in allen Bedingungen stark verwachsen, so hatte Kristalloptimierung durchgeführt werden. Figur 4 zeigt die scheme des Optimierungsverfahrens zur Herstellung von Kristallen durchgeführt , mit Ursprung aus Bedingung kommerziellen Bildschirm SaltRx E4 (52) (3B-C). Wiederum erschien verwachsene Kristalle in Vertiefungen A6-D6 (Abbildung 4). Ein microseed Lager wurde von den Kristallen in Bedingung C6 gewachsen (2,55 M Ammoniumhydrogenphosphat, 0,1 M Tris pH 8,5) des Optimierungs Bildschirm vorbereitet und verdünnt 1: 1000 in Mutterlauge. Zwei bis sieben Tage nach der mit dem verdünnten Saatgut in die anderen verbleibenden 20 Bedingungen Impfen mit klaren Tropfen großen Einzelgitterkristalle hohe Beugungsqualität beobachtet wurden (Abbildung 5) in den meisten Tropfen. Nach der Montage der Kristalle in Nylonschlaufen (5E) Beugungsdaten auf 1,67 Å Auflösung wurden für die Strukturbestimmung über Zink-SAD (Tabelle 1) gesammelt, mit ein anormales Signal zu 2 A erstreckt. Zusätzlich nativen Beugungsdaten bis 1,4 Å Auflösung wurden zur Bestimmung eines hig gesammelth aufgelöste Struktur (Tabelle 1). Die Kristallstruktur von rPPEP-1 konnte (Abbildung 6) und das Modell der nativen Struktur auf R / R frei Faktoren von 0.156 / 0.182 bei 1,4 Å Auflösung (PDB ID: 5A0P) raffiniert gelöst werden 14 (für die weitere Verfeinerung Statistiken siehe Tabelle 1). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Struktur / Daten - Set </td><td> Spitzen Zn-SAD </td><td> Einheimische </td></tr><tr><td> Datensammlung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Raumgruppe </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td><td> P2 1 2 1 2 1 </td></tr><tr><td> a, b, c (Å) </td><td> 43.17, 71.68, 117.70 </td><td> 43.17, 71.77, 117.80 </td></tr><tr><td> α, β, γ (°) </td><td> 90, 90, 90 </td&gt; <td> 90, 90, 90 </td></tr><tr><td> Wellenlänge (Å) </td><td> 1,28254 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Auflösung (a) </td><td> 45,5 bis 1,67 (1,72-1,67) </td><td> 45,5 bis 1,40 (1,49-1,40) </td></tr><tr><td> Anzahl der Beobachtungen </td><td> 779.717 (34.025) </td><td> 310.074 (45.851) </td></tr><tr><td> Anzahl der einzigartigen Reflexionen </td><td> 80960 (5597) </td><td> 71874 (11172) </td></tr><tr><td> Vielzahl </td><td> 9.6 (6.1) </td><td> 4.3 (4.1) </td></tr><tr><td> Vollständigkeits (%) </td><td> 99,2 (93,0) </td><td> 98,2 (95,6) </td></tr><tr><td> Rmerge (%) </td><td> 6.8 (56.5) </td><td> 5.2 (52.6) </td></tr><tr><td> &lt;I / σ (I)&gt; </td><td> 21.86 (2.81) </td><td> 15.66 (2.48) </td></tr><tr><td> CC (1/2) (%) </td><td> 100 (85.1) </td><td> 99,9 (85,5) </td></tr><tr><td> Refinement Statistiken </td><td></td><td></td></tr><tr><td> R work / R frei d (%) </td><td></td><td> 15.60 / 18.17 </td></tr><tr><td> Anzahl der Nicht-H-Protein-Atomen </td><td></td><td> 3109 </td></tr><tr><td> Anzahl der Wassermoleküle </td><td></td><td> 532 </td></tr><tr><td> Anzahl der Ionen / schwere Atome </td><td></td><td> 2 Zn </td></tr><tr><td> No. anderer Moleküle </td><td></td><td> - </td></tr><tr><td> Anzahl der TLS Gruppen / Kette </td><td></td><td> 9 </td></tr><tr><td> Root mean square Abweichungen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bindungslängen (Å) </td><td></td><td> 0,006 </td></tr><tr><td> Bindungswinkel (°) </td><td></td><td> 1,022 </td></tr><tr><td> Durchschnittlich B - Faktor (A 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alle Protein-Atome </td><td></td><td> 16,12 </td></tr><tr><td> Wasser </td><td></td><td> 29.74 </td></tr><tr><td> andere Atome </td><td></td><td> 10,12 </td></tr><tr><td> Ramachandran - Plots e (%) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Die meisten begünstigt </td><td></td><td> 98,72 </td></tr><tr><td> Zusätzlich erlaubt </td><td></td><td> 1,28 </td></tr><tr><td> ungültig </td><td></td><td> 0 </td></tr><tr><td> PDB-Eintrag </td><td></td><td> 5a0p </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Datensammlung und Verfeinerung Statistiken.

Watch this Scientific Journal Video about Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD at JoVE.com

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

production-crystallization-structure-determination-c-difficile-ppep-1

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

11.5K Aufrufe.  University of Cologne. Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein. 

Serie: Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its precursor p100. p52 functions as a homodimer or heterodimer with another NF-&#954;B subunit, RelB. These dimers in turn regulate the expression of hundreds of genes involved in inflammation, cell survival, and cell cycle. IKK1/&#945; primarily remains associated with IKK2/&#946; and NEMO as a ternary complex. However, a small pool of it is also observed as a low molecular weight complex(es). It is unknown if the p100 processing activity is triggered by activation of IKK1/&#945; within the larger or the smaller complex pool. Constitutive activity of IKK1/&#945; has been detected in several cancers and inflammatory diseases. To understand the mechanism of activation of IKK1/&#945;, and enable its use as a drug target, we expressed recombinant IKK1/&#945; in different host systems, such as E. coli, insect, and mammalian cells. We succeeded in expressing soluble IKK1/&#945; in baculovirus infected insect cells, obtaining mg quantities of highly pure protein, crystallizing it in the presence of inhibitors, and determining its X-ray crystal structure. Here, we describe the detailed steps to produce the recombinant protein, its crystallization, and its X-ray crystal structure determination.

I&#954;B Kinase 1/&#945; (IKK1/&#945; CHUK) is a Ser/Thr protein kinase that is involved in a myriad of cellular activities primarily through activation of NF-&#954;B transcription factors. Here, we describe the main steps necessary for the production and crystal structure determination of this protein.

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice of detergent is critical, because it affects both the stability and monodispersity of the complex. We recently determined the crystal structure of an active state of bovine rhodopsin coupled to an engineered G protein, mini-Go, at 3.1 &#197; resolution. Here, we detail the procedure for optimizing the preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. Dark-state rhodopsin was prepared in classical and neopentyl glycol (NPG) detergents, followed by complex formation with mini-Go under light exposure. The stability of the rhodopsin was assessed by ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, which monitors the reconstitution into rhodopsin of the light-sensitive ligand, 9-cis retinal. Automated size-exclusion chromatography (SEC) was used to characterize the monodispersity of rhodopsin and the rhodopsin&#8211;mini-Go complex. SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) confirmed the formation of the complex by identifying a 1:1 molar ratio between rhodopsin and mini-Go after staining the gel with Coomassie blue. After cross-validating all this analytical data, we eliminated unsuitable detergents and continued with the best candidate detergent for large-scale preparation and crystallization. An additional problem arose from the heterogeneity of N-glycosylation. Heterologously-expressed rhodopsin was observed on SDS-PAGE to have two different N-glycosylated populations, which would probably have hindered crystallogenesis. Therefore, different deglycosylation enzymes were tested, and endoglycosidase F1 (EndoF1) produced rhodopsin with a single species of N-glycosylation. With this strategic pipeline for characterizing protein quality, preparation of the rhodopsin&#8211;mini-Go complex was optimized to deliver the crystal structure. This was only the third crystal structure of a GPCR&#8211;G protein signaling complex. This approach can also be generalized for other membrane proteins and their complexes to facilitate sample preparation and structure determination.

This report describes screening of different detergents for preparing the visual GPCR, rhodopsin, and its complex with mini-Go. Biochemical methods characterizing the quality of the complex at different stages during purification are demonstrated. This protocol can be generalized to other membrane protein complexes for their future structural studies.

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The overall process involves i) vitrifying the specimen in a thin film supported on a cryoEM grid; ii) screening the specimen to assess particle distribution and ice quality; iii) if the grid is suitable, collecting a single particle dataset for analysis; and iv) image processing to yield an EM density map. In this protocol, an overview for each of these steps is provided, with a focus on the variables which a user can modify during the workflow and the troubleshooting of common issues. With remote microscope operation becoming standard in many facilities, variations on imaging protocols to assist users in efficient operation and imaging when physical access to the microscope is limited will be described.

Structure determination of macromolecular complexes using cryoEM has become routine for certain classes of proteins and complexes. Here, this pipeline is summarized (sample preparation, screening, data acquisition and processing) and readers are directed towards further detailed resources and variables that may be altered in the case of more challenging specimens.

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...