이 프로토콜은 UNbound 형태로 NEMO의 IKK 바인딩 도메인의 성공적인 구조 측정을 용이하게 합니다. 그리고 생산 및 결정화의 세부 사항. 이 프로토콜은 결정화 및 구조 측정을 용이하게 하는 코일 코일 어댑터를 통해 NEMO의 IKK 바인딩 도메인 단편의 네이티브 확인을 이 안정화를 활용합니다.
NEMO의 구조 생물학은, 표적으로, 선동적이고 자가면역 질병 및 암의 처리를 위한 NEMO 억제제의 발달에 있는 중요한 이점을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 약물 발견 또는 최적화를 위한 펩타이드 또는 소분자 억제제와 함께 NEMO 복합체의 구조 적 결정으로 확장될 수 있다. 단백질 재접및 농도는 단백질 생산 단계에서 순수 NEMO 이량체를 얻는 데 기본적입니다.
결정화 조건에서 집계를 제한하고 용해도를 보장합니다. 절차를 시연하는 것은 타마와 에이미, 우리의 실험실에서 대학원생이 될 것입니다. 훌륭한 국물 용액의 20 밀리리터를 추가하여 시작합니다.
그리고 암피실린의 밀리리터 스톡 솔루션당 100 밀리그램의 20 마이크로리터. 125 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에. 다음 셀 글리세롤 주식의 몇 마이크로 리터, 에서 80 섭씨 저장, BL21DE3 유능한 세포의.
벡터로 변환됩니다. 하룻밤 동안 스타터 문화를 흔들어 37섭고 분당 220회전에서 세포를 0.1 밀리리터의 OD600과 250 밀리리터로 희석시. 그리고 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 최종 농도에 암피실린을 추가합니다.
배양의 OD600이 0.8 대 1에 도달하면, 500 마이크로몰라 농도에 IPTG를 배양에 추가한다. OD600이 6~10도에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 성장시다. 배양의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 퇴적.
그리고 리시스 버퍼의 40 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 다시 중단된 세포를 20~25밀리리터 알리쿼트로 분할합니다. 그리고 프랑스 언론을 사용하여 차가운 방에서 알리쿼트 당 2 ~3 회, 세포에 압력의 평방 인치 당 약 25, 000 파운드를 적용합니다.
다음으로, 8개의 어금니의 최종 농도에 세포 용액에 우레아를 추가한다. 그리고 실온에서 2~16시간 동안 흔들 플랫폼에서 셀 용액을 배양합니다. 다음 날 아침, 용양을 초원심분리기 튜브로 옮기고, 튜브당 적어도 3쿼터로 옮습니다.
그리고 45 분 동안 lysates를 ulrta 원심 분리합니다. 슈퍼네이트를 50밀리리터 원뿔 튜브로 데칭합니다. 그리고 요소 인큐베이션 된 상체를 IMAC 열에 분당 3 밀리리터로 로드합니다.
모든 상체가 컬럼을 통과하면 10개의 열 볼륨에 대한 열을 분당 3밀리리터로 바인딩 버퍼로 세척합니다. 그리고 12컬럼 부피 그라데이션을 통해 10에서 500 밀리머 이미다졸에서 NEMO-EEAA 단백질의 그라데이션 용출을 수행합니다. 용액의 밀리리터 알리쿼트 1개를 분수 컬렉션 플레이트로 수집합니다.
SDS 페이지 분석 후, 표준 프로토콜에 따라, 순수한 표적 단백질을 포함하는 분획을 당기고 브래드포드 분석에 의한 단백질 농도를 측정한다. 단백질을 함유한 피각을 선택합니다. HIS6 태그를 크리브하고 샘플에서 과도한 imidazole를 제거하기 위해 TEV 프로테아제를 TEV 크리브 단백질의 1 대 10 중량 비율로 표적 단백질 샘플에 추가합니다.
그리고 20 밀리머 트리의 네 리터에 하룻밤 샘플을 팽창. 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨과 2 개의 밀리머 DTT 용액. 다음 아침, TEV cleaved NEMO-EEAA 샘플을 분당 1 밀리리터로 두 번째 IMAC 열에 로드합니다.
96 그릇 분수 수집 플레이트에서 1 밀리리터 분획으로 흐름을 수집합니다. 20 밀리머 트리, 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨 및 10 밀리머 이미다졸 용액의 5 권으로 컬럼을 분당 1 밀리리터로 세척하십시오. 마지막 세척 후, TEV를 엘테우고 삼촌 HIS6 NEMO-EEAA, 3 개의 컬럼 볼륨20 밀리머 트리스, 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨, 500 밀리머 imidazole와 2 밀리머 DTT 솔루션, 50 밀리 리터 플라스크에.
갈라진 NEMO-EEAA 구조를 포함하는 분획을 통해 흐름을 당기고 교반된 세포 농축기로 샘플을 5밀리리터로 농축합니다. 야간 투석 후, 샘플의 5 밀리리터를 16밀리미터에 60센티미터 크기의 배제 크로마토그래피 컬럼으로 적재합니다. 필요에 따라 반복, 샘플 볼륨에 따라.
분당 1 밀리리터, 2밀리머 트리, 100 밀리머 염화 나트륨 및 2 밀리머 DDT 용액. 디메라 NEMO-EEAA에 대응하는 분획을 당긴 후, 3킬로달톤의 멤브레인을 차단하는 분자량으로 교반된 세포 농축기에서 샘플을 113 마이크로몰라의 최종 농도로 농축한다. 그런 다음 최대 1개월 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있는 단백질을 알리쿼트합니다.
희소 매트릭스 스크리닝의 경우, 2개의 드롭 챔버 결정화 플레이트의 96개의 우물 각각에 스파스 매트릭스 용액 60마이크로리터를 추가합니다. 앉아서 증기 확산을 드롭합니다. 그리고 로봇 낙하 세터에 단백질 용액을 추가합니다.
다음으로, 로봇 낙하 세터를 사용하여 밀리리터당 1.65 밀리그램의 단백질 용액 100나노리터를 1대 1비율로 1대 1비율로 1,000나노리터의 최종 부피에 분배합니다. 또한 134나노리터의 저수지 용액을 가진 66나노리터의 단백질 용액을 200나노리터의 최종 부피에 2개의 나노리터를 추가합니다. 그런 다음 3 인치 너비의 밀봉 테이프로 즉시 접시를 밀봉하십시오.
그런 다음 트레이를 결정화 이미저 저장소에 섭씨 20도에 저장합니다. 플레이트를 저장한 후 2일부터 크리스탈의 존재를 위해 자동으로 수집된 이미지를 확인합니다. 종자 스톡 생성의 경우, 관심의 결정을 포함하는 전체 낙하를 종자 생성 키트로부터 제공된 바이알에서 결정화 조건 용액 50 마이크로리터로 전송한다.
그리고 3 분 동안 맥동 20 초 와 10 초의 휴식으로 종자 스톡을 소용돌이. 그런 다음 종자 주식을 1-10 단위로 1개에서 10, 000까지 희석합니다. 그리고 추가 사용까지, 섭씨 4도에 희석을 저장합니다.
1~2일 전에 싱크로트론으로 발송하기 전에, 관심의 결정과 함께 우물 꼭대기에서 테이프를 잘라냅니다. 그리고 12%1, 2개의 프로판 디오 냉동보호제를 함유한 결정화 용액0.5 마이크로리터를 웰에 직접 추가합니다. 저온 루프로 크리스탈을 부드럽게 빼냅니다.
잘에서 결정을 반복하고, 액체 질소에 침지 퍽에 냉동 루프를 포함하는 크리스탈을 저장, X 선 회절에 대한 선적까지. X선 회절 데이터를 받은 후 STAR 및 ISO 서버에서 확장된 강도를 처리합니다. 데이터에 대한 회절 제한 표면에 대해 1.2의 X 선 결정 학인 차단을 사용하는 평균을 차단합니다.
그리고 피닉스에 로드합니다. 구조를 결정하려면, 분자 대체를 위한 검색 모델로 GCN4의 X선 구조를 사용하여, 피닉스에서 MRage를 사용하여. 4DMD 구조는 앙상블로 정의됩니다.
그리고 MRage 솔루션은 NEMO-EEAA의 말단 코일 코일 어댑터에 대응하는 구조 부로 성공적으로 구축할 것입니다. 디머의 두 체인에 대해 검색 모델에. 오버 발현 단백질은 밴드에서, 약 14킬로달톤의 분자량 마커에서, 첫번째 IMAC 컬럼 정화의 앞에 나타납니다.
그리고 첫 번째 용출 후 각각 14 킬로톤과 28 킬로달톤에서 단조로운 밴드와 이머 밴드를 표시합니다. TEV 분열은 두 번째 IMAC 열을 통해 용출에 따라 실질적으로 완료됩니다. 거의 전적으로 이량으로, 예상 된 분자량에서.
크기 제외 크로마토그래피는 60~65밀리리터를 제외한 단일 피크를 표시하며, 이량에 반응합니다. 미세 한 스크리닝은 데이터 수집을 위해 NEMO-EEAA 결정의 생산을 위해 종자 재고를 생산하는 데 활용할 수있는 결정을 생성합니다. 여기서, 대표적인 NEMO-EEAA 결정 회절 프로파일이 표시됩니다.
NEMO-EEAA 단백질의 구조적 분석은, 동종 불규칙한 병렬 코일, 길이약 175개의 협질등을 나타낸다. 일반 코일 코일 영역은 종단말의 이상적인 코일 어댑터 시퀀스를 포괄합니다. 그리고 NEMO 적절한 시퀀스의 처음 두 heptads.
C 종결에는 정기적인 코일 코일도 존재합니다. NEMO 잔류물 97에서 시작하여 C 단자 이상적인 코일 어댑터를 포괄합니다. IKK 베타 바운드 구조는 리간드를 수용하기 위해 보다 개방적인 코일 코일 확인을 표시합니다.
이 지역에서 1~2.2앙스트롬의 간격이 더 커진 다. NEMO의 리간드 구조는 계산 방법을 통해 억제제 설계에 대한 새로운 표적을 제공합니다. 그리고 작은 분자 라이브러리와 결합 포켓의 시각적 스크리닝을 위해.
우리는 지금 작은 분자 리간드가 있는 복합체에서 엔지니어링된 NEMO 구조물의 결정화를 위한 통로가 있습니다. 새로운 종류의 억제제개발 및 최적화를 돕습니다.
