JDM은 INSERM / Région Aquitaine의 PhD 펠로우쉽에 의해 후원되었으며 Mount Sinai School of Medicine의 박사후 ARC 펠로우쉽과 Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. EH는 Ministère de l&#39; Enseignement Supérieur et de la Recherche의 박사 과정에서 지원됩니다. ZE는 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 박사후 연구원이 후원합니다. CM은 Mount Sinai School of Medicine의 Tisch Cancer Institute에서 지원하고 JJBC는 NIH / NCI 보조금 K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund 및 Mount Sinai School of Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. 이 작업은 ANR-13-JJC-JSV1-0005의 보조금으로 지원되었습니다. FS는 &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot;에 의해 지원됩니다. VM 및 FS는 &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot;및 National de Cancer Institut, INCA_8036 및 PLBio2012에서 자금을 지원받습니다.

참고 : 고정하기 전에 모든 단계는 멸균 층류 후드에서 완료됩니다. 1. 2D 매트릭스 참고 : 2D 행렬은 침입자를 형성하는 세포의 비율과 세포 당 매트릭스 분해 영역을 결정하는 데 사용됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> 그림 1 : 프로토콜. 젤라틴 및 콜라겐 I 매트릭스를 제조하는 데 사용 된 프로토콜 요약. 젤라틴 매트릭스 만 만들거나 젤라틴과 콜라겐 혼합 매트릭스를 만들 수 있습니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 젤라틴 매트릭스 참고 : 형광 젤라틴 매트릭스는 매트릭스 분해를 정량화하는 데 사용되며 비 형광 젤라틴은 콜라겐 I 섬유의 접착을 촉진하는 데 사용됩니다. 형광 젤라틴 매트rices는 또한 podosome 및 invadopodia 연구에 사용됩니다 ( 그림 1 참조). <ol><li> 멸균 층류 후드 아래에서 작업 영역에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓고 70 % 에탄올로 소독합니다. </li><li> 1 ㎝ 간격으로 줄 지어 1 ㎎ / mL 젤라틴의 분액 20 μL 액적; 방울 조직에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오. </li><li> 각 20 μL 젤라틴 방울을 압력솥 유리 coverslip (직경 12 mm)로 덮으십시오. </li><li> 실온에서 20 분 동안 품어 낸다. 젤라틴이 형광등 인 경우 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 1 분 1 초 인산염 완충 식염수 (PBS)에 0.5 % 글루 타르 알데히드 40 μL의 작은 방울을 각각 1.1.3 단계의 커버 슬립 줄 아래 약 1 cm 간격으로 배치합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 정착 제입니다. 장갑을 착용하고 흡입하지 마십시오. </li><li> 보석 포셉을 사용하여 각 젤라틴 코팅 coverslip을 glutaraldehyde 방울로 이동하십시오. 참고 : Itparafilm에 작은 젤라틴 물방울이 남는 것이 정상입니다. 이것을 다른 실험에 다시 사용하지 마십시오. </li><li> 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. 형광 커버 슬립의 경우 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 24 잘 세포 배양 접시를 가지고 멸균 1X PBS의 500 μL로 각 우물을 작성하십시오. 각 우물에 coverslips, 젤라틴면을 올려 놓으십시오. </li><li> 5 분 각각에 대해 1x PBS로 두 번 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 coverslips는 실험에 사용하거나 4 ° C에서 1x PBS에 저장할 수 있습니다. 비 형광 coverslips은 일주일 동안 저장할 수 있으며, 형광 coverslips은 48 시간 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스 참고 : 섬유소 콜라겐 I 형 매트릭스는 선형인데 도좀 형성 및 관련 매트릭스 분해를 연구하는 데 사용됩니다. 형광 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 콜라겐 섬유와 invadosome 마커를 colocalize하는 데 사용됩니다 ( 예 : F - 굴지 나는원적외선 채널, 적색 채널의 콜라겐 I, 녹색 채널의 Tks5, 핵 얼룩의 Hoechst 염료). 반면에 비 형광성 콜라겐 I과 비 형광 젤라틴 coverslips의 조합은 염색 된 침입자 마커의 수를 최대화하기 위해 사용됩니다 ( 예 : 적색 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 코르 탁틴, 녹색 채널, 핵 염색을위한 Hoechst 염료). 마지막으로 형광이없는 콜라겐 I과 형광성 젤라틴 coverslips의 조합을 사용하여 젤라틴 관련 분해를 측정합니다 ( 예 : 원적외선 채널의 F- 액틴, 적색 채널의 Tks5, 녹색 채널의 Tks5 및 헴스트 염료 핵 염색을 위해) (그림 1 참조). Hoechst 염료는 핵을 염색하는데 사용되며, 또한 사용 된 세포주에서 정기적으로 수행되는 PCR 검사와 더불어 마이코 플라스마 오염을 검사합니다. <ol><li> 형광 콜라겐 I <ol><li> 0.02 N 아세트산에서 쥐 - 꼬리 힘줄에서 추출한 상업용 콜라겐을 사용하십시오.디. 콜라겐 I의 0.4mg / mL의 최종 농도에서 coverslip 당 500μL의 용액을 준비하는데 필요한 콜라겐의 양을 제거하십시오. </li><li> 콜라겐 I 용액 (nx 500 μL)의 최종 부피를 계산하여 10 μg / mL의 최종 농도로 5-carboxy x rhodamine succinimidyl ester를 첨가한다. </li><li> 위 아래로 pipetting하여 솔루션을 혼합하고 빛으로부터 보호, 실온에서 5 분 품어. </li><li> 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS)으로 최종 부피로 희석하고 직접 사용하십시오. </li></ol></li><li> 섬유소 콜라겐 나는 coverslip <ol><li> 이전에 단계 1.1에서 준비한 비 형광 또는 형광 젤라틴 coverslips를 사용하십시오. </li><li> 칼슘과 마그네슘을 함유 한 1X DPBS에서 0.4mg / mL의 최종 농도로 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 준비합니다. </li><li> 500 μL의 형광 또는 비 형광 콜라겐 I 용액을 추가합니다coverslip 24- 웰 세포 배양 접시에. </li><li> 콜라겐 중합을 위해 37 ° C에서 4 시간 동안 인큐베이션한다. </li><li> 부화 후, 매트릭스를 손상을 피하기 위해 (물론 coverslip에 아닙니다)의 측면에 플레이트와 pipetting 기울여하여 콜라겐 과잉을 제거합니다. 참고 :이 행렬은 저장할 수 없습니다. 과잉 콜라겐을 제거한 직후에 세포에 씨를 뿌린다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 세포 파종, 배양 시간 및 고정 <ol><li> 세포 유형에 따라, 적절한 배지에 세포를 준비하고 우물 당 500 μL의 최종 볼륨에 대한 세포를 추가합니다. </li><li> 선형 invadosomes를 형성하고 매트릭스를 저하시키는 세포주의 능력을 특성화하기 위해 선형 invadosome 형성 및 관련 저하 활동의 속도론을 결정하기 위해 콜라겐 I 매트릭스에 4 시간, 12 시간 및 24 시간 동안 세포를 플레이트하십시오. 참고 : 표 1 은 세포주실험실에서 테스트되었습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 세포주 </td><td> coverslip 당 세포의 수 </td><td> 선형 invadosome 부량을위한 모체와의 접촉 시간 </td><td> 선형 invadosome 분해 활성의 정량을위한 matrix와의 접촉 시간 </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40,000 </td><td> 4 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> HUH7 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> 서울대 398 호 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30,000 </td><td> 4 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6시 </td><td> 24 시간 </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 24 시간 후# 160; </td></tr><tr><td> 노골적인 </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40,000 </td><td> 12 시간 </td><td> 12 시간 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 세포 파종 및 배양 시간 참고. 이 표는 선형 invadosomes를 연구하는 데 사용되는 세포 라인의 비 포괄적 인 목록을 제공합니다. 이것은 매트릭스에 시드 할 세포의 수, 선형 침입자를 관찰하는 데 필요한 시간 및 관련 매트릭스 분해를 관찰하는 데 필요한 시간을 나타냅니다. 선형 침입자는 수명이 짧습니다. 세포의 최대 숫자에서 선형 invadosomes을 관찰 할 수 있도록, 세포는 시간이 짧은 기간 동안 콜라겐 전 매트릭스와 접촉해야합니다. 반면에,보고 된 젤라틴 분해를 시각화 할 수 있으려면 세포는 콜라겐 I 매트릭스와 위에 나열된 것보다 오랜 기간 동안 접촉해야합니다. </li><li> 세포 배양 배지를 제거한 후,1X PBS에 4 % paraformaldehyde 500 μL 10 분 coverslips을 수정. </li><li> 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 빛으로부터 보호 된 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 3. 면역 형광법 <ol><li> 신선하게 준비된 용액으로 10 분 동안 세포를 침투시킨다. 1X PBS 중 0.2 % Triton X-100. 이 솔루션을 다시 사용하지 마십시오. </li><li> coverslips를 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 벤치에 parafilm (20cm x 15cm) 조각을 놓습니다. </li><li> 재료 표 에 설명 된대로 1x PBS에 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 기본 항체를 희석합니다. </li><li> 한 줄에 1 차 항체 용액을 50 μL 나누어 각각 약 1 cm 간격으로 둡니다. </li><li> 각 coverslip을 물방울에 놓습니다. </li><li> 빛으로부터 보호 된 실온에서 40 분 동안 품어 낸다. </li><li> 잠복기 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 2 차 항체, phalloidin, Hoechst dye를 1 % BSA 4 %PBS. </li><li> 분량 50μL의 혼합 액을 각각 이전에 행한 것처럼 coverslips의 첫 번째 줄 아래 약 1cm 간격으로 배치합니다. </li><li> 각 coverslip을 물방울에 놓습니다. </li><li> 빛으로부터 보호 된 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. </li><li> 부화 후, 1x PBS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 증류수로 한 번 씻어서 소금을 제거하십시오. </li><li> 마운팅 매체 중합과 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재하십시오. </li><li> 현미경 검사 전에 실온에서 밤 사이에 커버 슬립을 건조시켜 빛으로부터 보호하십시오. </li></ol> 4. 수량 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> 그림 2 : 선형 침입 정량. 매크로는 F - 굴지와 Tks5 얼룩 (형식 : 1,024 X 1,024)의 공 촛점 이미지가 필요합니다. ( A ) 먼저 F-actin 그림을 열고 가면을 만드십시오. ( B ) 그런 다음, openTks5 그림과 그것을 임계 값. 매크로를 적용하십시오. ( C ) 분석 결과는 두 테이블에 나타납니다. 셀당 선형 침입자의 수와 셀의 선형 침입자가 사용하는 백분율 영역과 같은 기타 정보는 요약 테이블에 있습니다. 각 선형 침입자의 크기는 결과 테이블에 표시됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 선형 invadosomes를 형성하는 세포의 백분율 <ol><li> 선형 invadosomes를 형성 셀을 계산, coverslip 당 약 100 세포 (기술 triplicates를 사용). n 당 3,000 개 이상의 세포를 정량화하십시오. </li><li> 세 번의 독립적 인 실험의 평균을 취하여 선형 인베 돌좀을 형성하는 세포의 백분율을 계산하면 900 개의 정량 세포가 생성됩니다. </li></ol></li><li> 세포 당 선형 침입 크기 및 수 <li> 보충 매크로와 함께 ImageJ를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 세포 당 분해 <ol><li> 조건 당 3 개의 커버 슬립을 사용하십시오. </li><li> 형광 젤라틴과 Hoechst 얼룩 핵의 coverslip 당 30 이미지를 가져 가라. </li><li> Martin KH et al. 에 설명 된대로 ImageJ 소프트웨어를 사용하십시오 . 9 . </li></ol></li></ol> 5. 3D 콜라겐 침입 분석 <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> 그림 3 : 침입 분석 스키마. 침략 분석 프로토콜 요약. 콜라겐 I은 숙신 이미 딜 에스테르 염료와 가교 결합되어 37 ° C에서 1 시간 동안 중합됩니다. 세포는 혈청이없는 배지에 콜라겐 I 플러그 위에 첨가됩니다. 삽입물은 중간 크기10 % FBS. 콜라겐 I 플러그는 대조군에서 세포 파종 1 시간 후 및 실험 조건에서 세포 파종 3 일 후 세포의 침투 용량을 결정하기 위해 고정시켰다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 콜라겐 I 준비 플러그 <ol><li> 세포 유형에 따라 젤에 침략의 속도론을 결정하는 첫 번째 실험에 대한 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간의 시간 과정을 확인하십시오. 각 실험마다 침입이 일어나지 않을 때 기준 시점으로 1 시간 지점을 추가하십시오. </li><li> 멸균 층류 후드 아래 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 준비합니다. 3 개의 Boyden 챔버 인서트 용 용액 500 μL를 준비하십시오. </li><li> 상업용 쥐 - 꼬리 콜라겐 1mg을 흡인하여 2mg / ml 콜라겐 I의 최종 농도를 갖는 용액을 제조하십시오. </li><li> 5- 카르복시 x 로다 민 석신 이미 딜 에스테르를콜라겐 I 용액 (이 경우, 500 μL)의 최종 부피에 대해 계산 된 1 μg / mL의 최종 농도. </li><li> 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 멸균 층류 후드 아래 얼음 위에서 5 분 동안 품어 라. </li><li> 얼음처럼 차가운 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)을 얼음 저온의 여과 된 10X PBS와 6.25 μL의 50 μL를 첨가한다. </li><li> 식 443.75 - x μL의 콜라겐 I에 따라 멸균 수를 추가하십시오. </li><li> Boyden chamber insert 당 100 μL의 용액을 첨가하십시오. </li><li> 중합을 허용하기 위해 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 풍부한 세포 배양 배지를 새로운 우물에 첨가한다. 이 우물에 삽입물을 넣으십시오. </li><li> 콜라겐 위에 씨앗 30,000 개의 세포를 넣고 FBS가없는 배지를 연결합니다. </li><li> 37 ° C에서 세포를 배양 후, 1X PBS에 4 % paraformaldehyde에 30 분 동안 콜라겐 제가 플러그 수정. </li><li> 다음 단계를 제외하고 3 단계에서와 같이 완전한 면역 형광법을 사용하십시오 : 투과 액30 분 동안 10 분이 아닌 1 x PBS에서 0.2 % Triton X-100으로 ze 처리; 각각 40 분 및 30 분이 아닌 1.5 시간 동안 1 차 및 2 차 항체 용액과 함께 배양하십시오. 세포를 국한시키기 위해 F- 액틴 또는 핵에 염색합니다. </li><li> immunofluorescence 후, 삽입물의 멤브레인 주위를 잘라하고 유리 바닥 접시에 콜라겐 내가 플러그를 신중하게 메스를 사용합니다. 콜라겐 I 플러그의 꼭대기가 유리와 접촉되어 있는지 확인하십시오. 플러그의 완전성을 유지하기 위해 삽입 막을 콜라겐 바닥에 붙이십시오. 참고 : 콜라겐 I 플러그는 유리 바닥 접시에 그대로 남아 있습니다. 유리 바닥과 유리 바닥을 감싸는 플라스틱 사이의 깊이는 플러그의 두께와 동일합니다. </li><li> 콜라겐 I에 coverslip을 놓고 마개가 막히는 것을 막기 위해 중합 매체를 장착합니다. </li><li> 콜라겐 I 이미지를 이미지화하기 위해 역상 공 촛점 현미경을 사용하십시오. 정상플러그가 접시의 유리 바닥과 접촉합니다. <ol><li> 세포 침입을 시각화하기 위해 연결하는 콜라겐의 상단에서 하단까지 z 스택을 얻습니다. 세포가 이미징 분야에 얼마나 깊이 침투 하는지를 조사하여 z-stack의 두께를 결정하십시오. 0.25x의 z- 스텝 크기를 가진 512x512 포맷의 40X 오일 대물 렌즈로 수집을 수행하십시오. 참고 : 참고로, MDA-MB-231 세포의 평균 z-stack은 seeding 3 일 후에 30 μm입니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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고전적으로, invadosomes는 microenvironment 및 세포가 도금되는 매트릭스에 관계없이 체외에서 공부 하고 있습니다. 젤라틴, fibronectin, vitronectin 또는 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC) 7,11을 포함하여 여러 유형의 매트릭스가 현재 사용됩니다. 그러나, 이들은 종종 세포가 존재하고 생리 학적으로 관련이없는 미세 환경을 대표하지 못한다. 여기에는 젤라틴과 섬유소 I 형 콜라겐 사이의 결합으로 구성된 새로운 유형의 매트릭스가 사용되었습니다. I 형 콜라겐 원 섬유의 사용은 우리가 생리 학적 구조에서 콜라겐 I 상에 특이 적으로 형성하는 선형 침입자 (invadosomes)로 알려진 새로운 종류의 침입자를 강조 할 수있게한다. 콜라겐에 라벨을 붙이면 섬유를 따라 선형 침입자를 관찰하고 Tks5와 코르 탁틴과 같은 세포 마커를 사용하여 그 형성을 정량화 할 수 있습니다. 마일 사용하기우리는 새로운 수용체, 선형 invadosomes 8 의 형성에 관여 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)을 확인했습니다. 2D 혼합 매트릭스는 zymography in situ 분석을 통해 선형 인베도 솜의 기질 분해 활성을 정량화합니다. 이 분석은 형광 젤라틴 층에서 블랙 홀의 존재를 분석하여 MMP의 단백질 분해 활성을보고합니다. 흥미롭게도, 선형 invadosomes로 F - 굴지의 조직은 젤라틴 전용 7에 비해 매트릭스 저하 활동을 증가시킵니다. 이 분석의 한 가지 한계는 젤라틴이 비 생리 학적 매트릭스이며, 생리 학적 기질이 미세 환경에 대한 세포 반응을 변화 시킨다는 것이 증명되었습니다. MMP 활성이 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스상에서 정량화되는 방식에 추가적인 한계가있다. 콜라겐 If 아래에 국한되는 젤라틴 분해 만bril layer는 정량화 될 수있다. 따라서 이것은 콜라겐 I 매트릭스 분해를 정량화하는 간접적 인 방법입니다. 선형 침입자의 분해 활성을 시각화하는 또 다른 방법은 콜라겐 절단 부위 (Col1-3 / 4C, 면역 글로불린)에 대한 특이 항체로 콜라겐 I 섬유를 표지하는 것이다. 이것은 immunofluorescence에 의해 cleaved 섬유의 시각화 수 있습니다. 그러나, 세포 이동으로 인해,이 항체는 선형 invadosome 형성으로 인해 2D에서 매우 특이 적이지 않다. 콜라겐 I 섬유의 분해 활성을 시각화하고 정량화하는 또 다른 방법은 다 광자 현미경 및 2 차 고조파 생성 8을 사용하는 것 입니다. 이 방법은 얼룩없이 콜라겐 I 섬유를 이미징 할 수 있습니다. I 형 콜라겐을 중합하는 우리의 방법은 문헌 12 , 13 에서 사용 된 다른 방법과 비교하여 다릅니다. 예를 들어, Artym <em&gt; 외. α 헬릭스 콜라겐 I 용액으로 코팅 된 커버 슬립을 원심 분리하고 30 분의 짧은 중합을 허용한다. 이 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC)은 우리의 콜라겐 I 섬유보다 훨씬 뻣뻣하고 밀도가 높지만 중합이 적습니다. 이 매트릭스 구조의 차이는 invadosome shape을 linear에서 dot-like로 바꾼다. 시간, pH, 농도 및 온도는 ECM 중합을 위해 제어되어야하는 매개 변수이다. 예를 들어, 중합 온도가 낮을수록 섬유가 커집니다. 세포 침입에 선형 침입자의 관련을 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그 분석이 사용되었습니다. 3D 콜라겐 I 플러그는 이미 침입 과정에서 침입 구조 또는 metalloproteinases의 관련을 연구하기 위해 과학계에서 사용됩니다 14 , 15 , 16 . 이러한 유형의 3D 행렬에는강성 - 예를 들어 3D 콜라겐 I 플러그는 2D 매트릭스보다 덜 단단합니다. 또한, 콜라겐의 종류와 기원은 생체 내 콜라겐 섬유의 다른 구성에 관해서도 중요합니다. 마지막으로, 생체 내 미세 환경 조성과 관련하여, 세포 외 기질의 한 요소 인 I 형 콜라겐 만이 초점을 맞추었다. 더 많은 연구가 생체 내 선형 invadosomes의 관련성을 결정하는 데 필요합니다. 선형 침입자의 연구 외에도, 여기에 기술 된 혼합 매트릭스는 fibronectin, vitronectin 및 다른 유형의 collagens ( 예 : IV 콜라겐)와 같은 다른 유형의 매트릭스 구성 요소와 함께 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 관심있는 행렬 요소의 유형과 연구 할 프로세스에 따라 조정될 수 있습니다. 그러나 복잡하고 생리적 인 매트릭스를 생성하면 ne세포 이동, 이동 및 침입에 관여하는 경로.

세포 외 기질 (ECM) 재 형성은 혈관 신생 및 종양 세포 침범과 같은 생리적 및 병리학 적 과정 중에 발생한다. 생리 조건에서 대부분 조혈 계통의 많은 세포 유형이 ECM 요소를 분해 할 수 있습니다. 예를 들어, 대 식세포는 조직에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘을 수 있으며 파골 세포는 칼슘 항상성을 보장하기 위해 골질을 분해합니다. 전 세계적으로 신체의 모든 매트릭스가 물리적, 화학적 특성을 유지하기 위해 갱신됩니다. 암 조직에서 종양의 미세 환경 구성이 변경됩니다. 예를 들어, 유방암과 폐암에서 I 형 콜라겐은 과발현되어 종양 주위에 축적됩니다. 더욱이,이 축적은 전이를 일으킬 위험도가 높아진다. 암 전이는 암 세포가 ECM을 저하시키고 인접 조직을 침범하는 능력에 달려 있습니다. 그만큼세포의 침입 성 활동은 침입자 (invadosome)로 알려진 특이한 액틴 풍부 구조에 기인한다. 이 용어는 정상 세포와 암 세포 ( 예 : 대 식세포, 내피 세포, MDA-MB-231 유방암 세포주와 같은 암세포)에 각각 존재하는 포도 솜 (podosomes)과 인다도 포디 아 (invadopodia)를 포함합니다. 시험 관내 에서, invadosome은 점, 집계, 또는 장미와 같은 다양한 형태로 구성 될 수 있습니다 3 . 고전적으로, invadosomes은 integrins과 vinculin 4 와 같은 접착 플라크 분자로 둘러싸인 scaffold protein Tks5와 cortactin과 같은 여러 단백질을 함유 한 F-actin 코어로 구성됩니다. 최근 Tks5와 RhoGTPase Cdc42가 기능성 침입자의 최소 분자 표지로 사용될 수 있음이 밝혀졌습니다 5 . 이러한 구조는 MT1-MMP 및 MMP-2와 같은 특정 메탈로 프로테아제 단백질의 동원 및 활성화를 통해 ECM을 분해 할 수있다. 이전 연구에서 I 형 콜라겐 원 섬유와 I 형 콜라겐 원 섬유의 특이 적 수용체 인 디스코 딘 도메인 수용체 1 (DDR1) 사이의 상호 작용이 선형 침입자라는 새로운 종류의 침입자를 형성한다고보고했습니다. Linear invadosome은 I 형 콜라겐 원 섬유에 따라 형성된다. 이러한 구조는 MT1-MMP / MMP2의 동원 및 활성화를 통해 I 형 콜라겐 섬유질을 분해 할 수 있습니다. 또한, 그들의 형성은 Tks5와 Cdc42 5 에 달려있다. 시험관 내 에서, 우리는 선형 invadosomes의 존재와 DDR1의 형성과 활동 8 의 참여를 보여 주었다 : i) 형광 젤라틴 코팅 coverslips, ii) 형광 타입 I 콜라겐 피 브릴 코팅 된 coverslips, 그리고 iii) 3D 타입 I 콜라겐 플러그. 다른 행렬의 사용으로 인해 우리는 공부할 수 있었고 성격도 좋았습니다.선형 invadosome 형성과 그들의 분해 활성을 감소시킨다. 7 , 8 . 마지막으로 침입 세포의 생물학적 특성을보다 잘 이해하기 위해 종양 미세 환경 조성의 복잡성을 모방 한 2D 및 3D 배양 시스템에서 ECM 구성 요소의 조합을 사용했습니다. 아래는 2D 및 3D 배양 시스템에서 젤라틴 / I 형 콜라겐으로 커버 슬립을 코팅하기위한 프로토콜입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

세포 접착, 이동 및 침입은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에 관여한다. 예를 들어, 전이가 형성되는 동안 종양 세포는 혈액이나 림프관에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘어 침입하고 주변 조직을 통해 이동해야합니다. 이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 사이의 상호 작용을 필요로합니다. 세포 수준에서, 대부분의 암세포를 포함하여 많은 세포가 ECM을 분해 할 수있는 F- 굴지 기반 구조 인 침입자를 형성 할 수 있습니다. Invadosome은 matrix metalloproteinases (MMPs)를 모집하고 활성화시키는 돌출 액틴 구조입니다. ECM의 분자 구성, 밀도, 조직 및 강성은 침입자 형성 및 활성화를 조절하는 데 중요합니다. 시험 관내 에서, 젤라틴 분석은 침입자 분해 작용을 관찰하고 정량화하는데 사용되는 표준 분석법이다. 그러나, 변성 콜라겐 I 인 젤라틴은 생리적 매트릭스가 아니며준비. I 형 콜라겐 원 섬유를 사용하는 새로운 분석법이 개발되어이 생리 학적 매트릭스가 침입자의 강력한 유도제임을 입증합니다. 콜라겐 원 섬유를 따라 형성되는 침입자는 섬유상에서 선형 구조로 인해 선형 침입자로 알려져 있습니다. 또한, 선형 invadosomes의 분자 분석은 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)은 그들의 형성에 관여 수용체임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기 위해 생리 학적으로 관련이있는 매트릭스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 분명히 보여줍니다.

젤라틴과 I 형 콜라겐의 두 가지 유형 ( 그림 1 과 4 )의 조합을 사용하여 선형 침입자로 알려진 새로운 유형의 침입자를 강조했습니다. 이러한 매트릭스의 라벨링은 콜라겐 I 섬유 및 그 분해능에 따른 선형인데 돔 형성의 관찰을 허용한다 ( 도 5 ). 침입 구조의 수는 이전에 설명한 매크로 (단계 4.2)에 의해 정량화 될 수 있으며, 분해 활성도는 Martin 등이 기술 한 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 및 Diaz et al. 9 , 10 . 혼합 된 매트릭스는 선형 invadosome 형성과 기능에 필요한 수용체로서 DDR1을 정의함으로써 선형 invadosomes의 특성화를 가능하게합니다 ( 그림 6 ). 그림 3 및 7 ). 이 분석을 통해 우리는 z-stack 재구성을 사용하여 이동 한 거리뿐 아니라 콜라겐 I 플러그에 침입 한 세포의 수를 결정할 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig4.jpg" /> 그림 4 : 공 촛점 현미경을 사용하여 젤라틴과 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스의 비교. 상단 패널에 형광 젤라틴 coverslips의 조직을 보여주는 도식 표현. ( A ) 공 촛점 z - 스택 재구성은 형광 젤라틴 매트릭스가 coverslip의 전체 표면을 덮는 얇고, 균일 한 레이어를 형성하고 있음을 보여줍니다. ( B ) 혼합 매트릭스에서, coverslips에 형광 젤라틴의 증착 후, 입력 콜라겐 섬유소상단에 중합. 콜라겐 I 피 브릴은 빨간색으로 얼룩 져 있습니다. 콜라겐 I 매트릭스는 커버 슬립에서 두껍고 이질적입니다. 콜라겐 I 섬유의 분포는 콜라겐 I α 사슬의 중합에 의존한다. 눈금 막대 = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig5.jpg" /> 그림 5 : 젤라틴 및 젤라틴 - 콜라겐 I 매트릭스가 침입자 형성 및 활성에 미치는 영향. 이 검사에 사용 된 세포는 MDA-MB-231 유방암 세포입니다. ( A ) 도식 표현은 상단 패널에 형광 젤라틴 coverslip에 심어 세포를 보여줍니다. 형광의 감소로 인해 분해 영역이 검은 색으로 시각화됩니다. Tks5 염색은 침입 마커로 사용되었습니다. 젤라틴에서는 inv형태를 이루는 adosomes은 점으로 구성됩니다. ( B ) 도식 표현은 젤라틴과 콜라겐 I의 혼합 매트릭스에 시딩 된 세포를 보여줍니다. 콜라겐 I은 빨간색으로 표시되어 있습니다. 타입 I 콜라겐 섬유소의 첨가는 세포가 젤라틴을 분해하는 능력을 증가시킨다. 흥미롭게도, 침입 마커 Tks5가 재조직되고, 도트는 선형 침입자를 나타내는 선형 구조로 대체된다. 형광의 감소로 인해 분해 영역이 검은 색으로 시각화됩니다. 스케일 바 = 5 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig6.jpg" /> 그림 6 : 젤라틴 및 혼합 매트릭스 조건에서의 invadosomes의 분자 구성 및 구성에 대한 공 촛점 현미경 분석. ( A ) gelatin condition에서 invadosomes는 점으로 구성되어 있고 F-actin (빨간색)은 Tks5 (녹색, 아래쪽 패널)와 함께 현지화되지만 DDR1 (녹색, 상단 패널)과는 동일하지 않습니다. 이들은 고전적인 침입자입니다. 스케일 바 = 5 μm. ( B ) 젤라틴 - 콜라겐 I 혼합 매트릭스 조건에서, DDR1 (녹색, 상부 패널)은 콜라겐 I 피 브릴 (적색, 상부 패널), Tks5 (녹색, 바닥 패널) 및 F- 액틴 (적색, 바닥 패널). 제 1 형 콜라겐 원 섬유는 선형 침입자의 형성을 유도한다. 스케일 바 = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig7.jpg" /> 도 7 : 콜라겐 I 플러그에서의 MDA-MB-231 세포의 세포 침윤 분석. 세포를 파종 한 지 1 시간 후, 대조군 삽입물이 고정되고 염색된다. ( A ) z- 스택 a콜라겐 I 플러그의 획득은 공 촛점 현미경을 사용하여 수행됩니다. 이 시점에서 세포가 콜라겐을 침범하지 않습니다. 오히려, 그들은 콜라겐 I 플러그의 위에 남아 있습니다. 따라서 침입이 발생하지 않는 경우를 제어 시점으로 사용합니다. MMP 활성화는 세포가이 밀도에서 콜라겐 I 플러그를 침범하는 데 필요합니다. ( B ) 씨 뿌리기 3 일 후, 일부 세포가 콜라겐 I 플러그를 침범합니다. 이 분석은 세포 침입의 관찰 및 정량화를 허용합니다. 또한 다양한 약물이나 siRNA의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.

선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K 조회수.  INSERM U1053.  이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다. 

비디오: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

연구

생체공학

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

양적 Confocal 반사 현미경을 통해 3D 매트릭스에 포유류 세포 분열

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...