JDM, INSERM / Région Aquitaine&#39;den bir doktora bursuyla desteklendi ve artık doktora sonrası ARC bursu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. EH, Ministère de l&#39;Enseignement Supérieur et de la Recherche&#39;den bir doktora tarafından desteklenmektedir. ZE, Agence Nationale de la Recherche&#39;den (ANR) doktora sonrası bir burs tarafından desteklenmektedir. CM, Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;ndeki Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir ve JJBC, NIH / NCI hibe K22CA196750, TCI Genç Bilim İnsanı Kanseri Araştırma Ödülü JJR Fonu ve Mount Sinai Tıp Fakültesi&#39;nde Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, ANR-13-JJC-JSV1-0005&#39;den bir hibe ile desteklendi. FS, &quot;Ligue nationale contre le cancer&quot; tarafından desteklenmektedir. VM ve FS, &quot;Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016&quot; ve Institut National du Cancer, INCA_8036 ve PLBio2012 fonlarıyla desteklenmektedir.

NOT: Sabitlemeden önce, tüm basamaklar steril bir laminer akış davlumbazında tamamlanır. 1. 2D matris NOT: 2B matrisler, invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini ve hücre başına matris bozunum alanını belirlemek için kullanılır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig1.jpg" /> Şekil 1: Protokol. Jelatin ve kollajen I matrislerini hazırlamak için kullanılan protokolün özeti. Sadece jelatin matrisi veya bir jelatin ve kollajen I karışık matris yapmak mümkündür. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Jelatin matrisi NOT: Floresan jelatin matrisleri, matris bozunumunu nicelemek için kullanılır ve floresan olmayan jelatin, kollajen I liflerinin yapışmasını arttırmak için kullanılır. Floresan jelatinli matPirinç podozom ve invadopodia çalışmaları için de kullanılır (bkz. Şekil 1 ). <ol><li> Steril bir laminer akış kaputunun altında, çalışma alanına bir parça parafilm (20 cm x 15 cm) yerleştirin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Yaklaşık 1 cm aralıklarla bir çizgi halinde, 1 mg / mL jelatin parçacıkları 20 uL&#39;lik damlacıklar; Damlacık organizasyonu için Şekil 1&#39;e bakın. </li><li> Otoklavlanmış bir cam lamel (çap 12 mm) ile her 20 mcL jelatin damlacık örtün. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Jelatin floresan ise ışığa karşı koruyun. </li><li> Her biri, adım 1.1.3&#39;teki lamellerin hattının yaklaşık 1 cm altında bir aralıkla 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 0.5 glutaraldehit damlalıkları 40 uL&#39;lik damlacıklar. DİKKAT: Glutaraldehit toksik bir sabitleyici maddedir. Eldiven kullanın ve nefes almayın. </li><li> Mücevherli forseps kullanarak, her jelatin kaplı lamel bir glutaraldehit damla aktarın. NOT: BuParafilm üzerinde küçük bir jelatin damlasının kalması normaldir. Bunu başka bir deney için tekrar kullanmayın. </li><li> Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Floresan lamelleri için onları ışıktan koruyun. </li><li> 24 yuvalı bir hücre kültürü plakası alın ve steril 1x PBS 500 mcL ile her kuyu doldurun. Lamelleri, jelatin tarafı yukarıya her kuyuya yerleştirin. </li><li> Her biri için 5 dakika boyunca iki kez 1x PBS&#39;de yıkayın. NOT: Bu adımda, lamelleri deneme için kullanılabilir veya 1 ° C PBS&#39;de 4 ° C&#39;de saklanabilir. Floresansız lamelleri bir hafta boyunca saklanabilir ve floresan lamelleri 48 saat boyunca saklanabilir. </li></ol></li><li> Fibriler kollajen tip I matris NOT: Fibriler kollajen tip I matrisi, lineer invadozom oluşumunu ve buna bağlı matris bozunumunu incelemek için kullanılır. Florasan kollajen I ve floresan olmayan jelatin lamelleri bir kombinasyonu, invadozom belirteçlerini kollajen liflerle ( örn., F-aktin i) birlikte yerelleştirmek için kullanılırKırmızı kanala, kırmızı kanalı I kolajenine, yeşil kanalda Tks5&#39;e ve nükleer bir leke için Hoechst boyasına). Öte yandan, floresan olmayan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kolajenin I kombinasyonu lekelenmiş invadozom belirteçlerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılır ( örn., Kırmızı-kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada kortaktin, Tks5&#39;de Yeşil kanal ve bir nükleer leke için Hoechst boyası). Son olarak, floresan jelatin lamelleri ile floresan olmayan bir kollajenin bir kombinasyonu, jelatin ile ilişkili bozulmayı ölçmek için kullanılır ( örneğin, kırmızı kanada F-aktin, kırmızı kanada, yeşil kanalda Tks5 ve Hoechst boyası Nükleer bir leke için) (bakınız Şekil 1). Çekirge boyası, çekirdeği leke yapmak için kullanılır ve kullanılan hücre hatlarında düzenli olarak yapılan bir PCR testine ek olarak, mycoplasma kontaminasyonunu kontrol eder. <ol><li> Floresan kollajen I <ol><li> 0.02 N asetik asitte sıçan-kuyruk tendonundan çıkarılan ticari kollajen kullanınd. 0.4 mg / mL kollajen I nihai konsantrasyonunda lamel başına 500 μL solüsyon hazırlamak için gerekli kolajen miktarını geri çekin. </li><li> Kollajen I solüsyonunun nihai hacmi (nx 500 uL) için hesaplanan 10 ug / mL nihai konsantrasyonda 5-karboksi x rhodamin sukkinimidil esteri ilave edin. </li><li> Pipetleme ile yukarı ve aşağı çözümü karıştırın ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 1X Dulbecco&#39;nun kalsiyum ve magnezyum içeren Fosfat Tamponlu Tuz (DPBS) ile son hacme kadar seyreltin ve doğrudan kullanın. </li></ol></li><li> Fibrillar collagen I lamelleri <ol><li> Daha önce 1.1 adımında hazırlanan floresan veya floresan jelatin lamelleri kullanın. </li><li> Kalsiyum ve magnezyum içeren 1X DPBS&#39;de 0.4 mg / mL son konsantrasyonda floresan veya floresan olmayan bir kollajen I çözeltisi hazırlayın. </li><li> Floresan veya floresan olmayan kollajen I çözeltisi başına 500 μL ekleyin.24 yuvalı bir hücre kültürü plakasındaki lamelleri. </li><li> Kollajen I polimerizasyonu için 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, plakayı eğip matrisin zarar görmesini önlemek için kuyunun (doğrudan lamel üzeri) pipetleme yaparak aşırı kolajen I&#39;i alın. NOT: Bu matris saklanamaz. Fazla kolajen I çıkardıktan hemen sonra hücreleri tohumladım. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hücre ekimi, kültür zamanı ve fiksasyon <ol><li> Hücre türüne bağlı olarak, hücreleri uygun kültür ortamında hazırlayın ve göz başına 500 uL&#39;lik nihai hacim için hücreler ekleyin. </li><li> Bir hücre çizgisinin lineer invadozom oluşturabilme ve matrisi bozma kabiliyetini karakterize etmek için lineer invadozom oluşumunun kinetiğini ve bununla ilişkili parçalanma aktivitesini belirlemek için hücreleri plakaları 4 saat, 12 saat ve 24 saat boyunca kollajen I matrisi üzerine yerleştirin. NOT: Tablo 1 , hücre hatlarının örneklerini içerirLaboratuarda test edilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td> Hücre çizgisi </td><td> Lamel başına hücre sayısı </td><td> Lineer invadozom nicelemesi için matriste temas süresi </td><td> Lineer invadozom bozulma aktivitesinin nicelleştirilmesi için matriste temas süresi </td></tr><tr><td> MDA MB 231 </td><td> 40.000 </td><td> 4 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> Huh7 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> HEP 3B </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> SNU 398 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> NIH 3T3 src </td><td> 30.000 </td><td> 4 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> A431 </td><td> 50,000 </td><td> 6 saat </td><td> 24 saat </td></tr><tr><td> A549 </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 24 saat &amp;# 160; </td></tr><tr><td> ÇİĞ </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 12 saat </td></tr><tr><td> PAE </td><td> 40.000 </td><td> 12 saat </td><td> 12 saat </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Hücre tohumlama ve kuluçka süresi referans. Bu tablo, lineer invadozomaları incelemek için kullanılan hücre çizgilerinin kapsamlı olmayan bir listesini sunmaktadır. Matriste tohumlanacak hücre sayısını, doğrusal invadozomları gözlemlemek için gerekli süreyi ve ilişkili matris bozulmasını gözlemlemek için gerekli süreyi belirtir. Doğrusal invadozomların ömrü kısadır. Maksimum sayıda hücrede doğrusal invadozomları gözlemleyebilmek için, hücrelerin kısa bir süre için kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir. Öte yandan, bildirilen jelatin parçalanmasını görselleştirebilmek için, hücrelerin, yukarıda listelenenlerden daha uzun süre, kollajen I matrisi ile temas halinde olması gerekir. </li><li> Hücre kültür ortamının çıkarılmasından sonra,1X PBS 500 mcL% 4 paraformaldehid 10 dakika lamelleri sabitleyin. </li><li> 1x PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Işıktan korunarak 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. İmmünofloresans <ol><li> Hücreleri, taze hazırlanmış bir solüsyon ile 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile yıkandı. Bu çözümü tekrar kullanmayın. </li><li> Lamelleri iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Tezgah üzerine bir parafilm parçası (20 cm x 15 cm) yerleştirin. </li><li> Birinci antikoru, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi 1x PBS içinde% 4 sığır serum albümininde (BSA) seyreltin . </li><li> Herbiri yaklaşık 1 cm aralıklarla birer birer birincil antikor çözeltisinin 50 uL damlacıkları. </li><li> Her lamel bir damla yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun. </li><li> Kuluçka döneminden sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> İkincil antikor, phalloidin ve Hoechst boyasını% 1 BSA içinde 1x&#39;de seyreltinPBS. </li><li> Karışımın 50 uL&#39;lik damlaları, her biri daha önce yapıldığı gibi lamellerin birinci satırının yaklaşık 1 cm altında aralıklarla yerleştirildi. </li><li> Her lamel bir damla yerleştirin. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun. </li><li> Kuluçkadan sonra, iki kez 1x PBS ile yıkayın. </li><li> Tuzları çıkarmak için bir kez distile su ile yıkayın. </li><li> Lamelleri, polimerize edici montaj ortamı olan bir cam slayt üzerine monte edin. </li><li> Lamelleri gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın, mikroskopi öncesi ışıktan koruyun. </li></ol> 4. Nicelikler <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig2.jpg" /> Şekil 2: Doğrusal invadozom nicelemesi. Makro, F-aktin ve Tks5 boyanmasının konform görüntülerini gerektirir (format: 1,024 x 1,024). ( A ) Önce, F-aktin resmini açın ve bir maske yapın. ( B ) Daha sonra açıkTks5 resmi ve eşik. Makroyu uygulayın. ( C ) Analiz edilen sonuçlar iki tabloda görünecektir. Hücre başına doğrusal invadozom sayısı ve hücredeki doğrusal invadozomlar tarafından kullanılan yüzdelik alan gibi diğer bilgiler, Özet tablosunda yer alır. Her doğrusal invadozomun boyutu Sonuçlar tablosunda olacaktır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Lineer invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesi <ol><li> Lineer invadozom oluşturan hücreleri sayın, lamel başına yaklaşık 100 hücre (teknik triplit kullan). N = 3 ile n başına en az 300 hücrenin nicelendirilmesi. </li><li> Üç bağımsız deneyin ortalaması alınarak doğrusal invadozom oluşturan hücrelerin yüzdesini hesaplayarak, 900 sayılı hücre elde edin. </li></ol></li><li> Doğrusal invadozom boyutu ve hücre başına sayısı <li> Ek makro ile ImageJ&#39;yi kullanın. </li></ol></li><li> Hücre başına düşüş <ol><li> Her durum için üç lamel kullanın. </li><li> Floresan jelatin ve Hoechst lekeli çekirdek lamelleri başına 30 görüntüleri alın. </li><li> ImageJ yazılımını Martin KH ve ark. 9 . </li></ol></li></ol> 5. 3D Kollajen İşgali Testi <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig3.jpg" /> Şekil 3: Invasion assay şeması. İstilâsyon tahlil protokolünün özeti. Kollajen I sukkinimidil ester boya ile çapraz bağlanır ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de polimerleştirilir. Hücreler serum içermeyen besiyerinde kolajen I eklenir. Ek parça orta ağırlıkta% 10 FBS. Kollajen I fişleri, hücre tohumlamasından 1 saat sonra ve hücre ekiminden 3 gün sonra hücrelerin işgal kapasitesini belirlemek için deneye tabi tutulur. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Collagen I fiş hazırlığı <ol><li> Hücre türüne göre jel içine işgali kinetiğini belirlemek için ilk deney için 4 saat, 12 saat, 24 saat, 48 saat ve 72 saatlik bir zaman rotası yapın. Her deney için, bir istila olmadığında bir referans zaman noktası olarak 1 saat zaman noktası ekleyin. </li><li> Kollajen I solüsyonunu steril bir laminar akış kaputunun altına hazırlayın. 3 Boyden oda ekleri için 500 μL solüsyon hazırlayın. </li><li> 2 mg / mL kollajen I&#39;in son konsantrasyonu ile bir çözelti hazırlamak için 1 mg ticari rat-kuyruk kollajeni I aspire edin. </li><li> 5-karboksi x Rhodamine suksinimidil esteri,Kollajen I çözeltisinin nihai hacmi için hesaplanan nihai konsantrasyon 1 μg / mL (bu durumda, 500 uL). </li><li> Iyi bir şekilde karıştırın ve ışığa karşı korunmuş steril laminer akış kaputunun altında buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. </li><li> Buzla soğutulmuş 50 μL, süzülmüş 10X PBS ve buz soğukluğunda 1 M sodyum hidroksit (NaOH) 6.25 μL ekleyin. </li><li> 443.75 - x mcL kollajen I formülüne göre steril su ekleyin. </li><li> Boyden oda girişi başına 100 μL çözelti ekleyin. </li><li> Polimerizasyona izin vermek için 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Yeni kuyucuklara fetüs sığır serumu (FBS) ile zenginleştirilmiş hücre kültürü ortamı ekleyin; Ek yerleri bu kuyulara yerleştirin. </li><li> FBS içermeyen ortamda kolajen I&#39;in üzerine 30.000 hücre tohum ekti. </li><li> Hücreleri 37 ° C&#39;de kültürledikten sonra, kollajen I fişi, 1x PBS içerisinde% 4 paraformaldehit içinde 30 dakika sabitleyin. </li><li> Aşama 3&#39;de olduğu gibi komple immünofloresans, aşağıdaki adımlar haricinde: permeabiliZe 10 dakika değil 30 dakika için 1x PBS içerisinde% 0.2 Triton X-100 ile; Primer ve sekonder antikor çözeltileriyle sırasıyla 40 dakika ve 30 dakika yerine 1.5 saat inkübe edin. F-aktin veya hücreleri lokalize etmek için çekirdekler lekeli. </li><li> İmmün floresans sonrasında, eklentinin membranını kesmek için bir neşter kullanın ve kollajen I fişini bir cam altı tabağa aktarın. Kolajen I fişinin üst kısmının camla temas ettiğinden emin olun. Tapanın bütünlüğünü korumak için insert membranı kolajen I tıpasının altına tutun. NOT: Cam tabağında kolajen I fişi kalır. Cam tabanı ve cam tabanı çevreleyen plastik arasındaki derinlik, tapanın kalınlığına eşdeğerdir. </li><li> Takılan kollajene lamel yerleştirin ve tıpanın kurumasını önlemek için polimerize edici montaj ortamı ile monte edin. </li><li> Taktığım kolajeni imgelemek için ters konfokal mikroskop kullanın; Üst kısmıTıpa tabağın cam altıyla temas halindedir. <ol><li> Hücrenin istilasını görselleştirmek için üstten alttan kollajen I fişine bir z-yığıtı bulun. Hücrelerin görüntüleme alanını ne kadar derine işgal ettiğini inceleyerek z-yığınının kalınlığını belirleyin. Z-adım boyutu 0.25 μm olan 512 x 512 formatında 40X yağ hedefi ile satın almalar yapın. NOT: Referans için, tohumlamadan 3 gün sonra MDA-MB-231 hücreleri için ortalama z-yığını 30 μm&#39;dir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors.">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).</li><li>Gilkes, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+prolyl+hydroxylases+are+essential+for+breast+cancer+metastasis.">Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis.</a> Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).</li><li>Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degrading+Devices:+Invadosomes+in+Proteolytic+Cell+Invasion.">Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).</li><li>Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'ins'+and+'outs'+of+podosomes+and+invadopodia:+characteristics,+formation+and+function.">The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).</li><li>Di Martino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+and+Tks5:+a+minimal+and+universal+molecular+signature+for+functional+invadosomes.">Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes.</a> Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).</li><li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+invasion+by+tumour+cells:+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia.">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+type+I+collagen+organization+induces+the+formation+of+a+novel+class+of+linear+invadosomes.">Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).</li><li>Juin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoidin+domain+receptor+1+controls+linear+invadosome+formation+via+a+Cdc42-Tuba+pathway.">Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway.</a> J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).</li><li>Martin, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+invadopodia-mediated+extracellular+matrix+proteolysis+in+single+and+multicellular+contexts.">Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts.</a> J. Vis. Exp. , e4119 (2012).</li><li>Diaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+detection+and+gelatin+degradation+assay.">Invadopodia detection and gelatin degradation assay.</a> Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).</li><li>Artym, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dense+fibrillar+collagen+is+a+potent+inducer+of+invadopodia+via+a+specific+signaling+network.">Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network.</a> J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+assemble+podosomes+that+degrade+matrix+and+protrude+through+basement+membrane.">Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane.</a> Blood. 121, 2542-2552 (2013).</li><li>Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basement+membrane+invasion+assays:+native+basement+membrane+and+chemoinvasion+assay.">Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).</li><li>Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeboid+shape+change+and+contact+guidance:+T-lymphocyte+crawling+through+fibrillar+collagen+is+independent+of+matrix+remodeling+by+MMPs+and+other+proteases.">Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases.</a> Blood. 102, 3262-3269 (2003).</li><li>Geraldo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).</li><li>Monteiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+WASH+and+exocyst+complexes+control+exocytosis+of+MT1-MMP+at+invadopodia.">Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia.</a> J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Klasik olarak, invadozomlar, mikro ortam ve hücrelerin kaplandığı matrise bakılmaksızın in vitro olarak incelenir. Şu anda, jelatin, fibronektin, vitronektin veya yüksek yoğunluklu fibriler kollajen (HDFC) 7 , 11 dahil çeşitli matris türleri kullanılmaktadır; Bununla birlikte, bunlar genellikle hücrelerin bulunduğu mikro çevreyi temsil etmez ve fizyolojik olarak uygun değildir. Burada, jelatin ile fibriler tip I kollajen arasındaki ilişkiden oluşan yeni bir matris tipi kullanıldı. I tipi kollajen fibrillerinin kullanımı, lineer invadozomlar olarak bilinen, özellikle fizyolojik mimarisinde 7 kolajeni oluşturan invadozomların yeni bir sınıfını vurgulamamızı sağlar. Kolajenin etiketlenmesi, lifler boyunca doğrusal invadozomaları gözlemlememize ve Tks5 ve kortaktin gibi hücresel belirteçleri kullanarak bunların oluşumunu nicelleştirmemize izin verir. Mi&#39;yi kullanmaXed matriksinde doğrusal invadozomların oluşumunda rol alan diskoidin alan reseptörü 1 (DDR1) yeni bir reseptör tespit ettik. 2D karışık matris, doğrusal invadozomların matriks bozunum aktivitesini zimografi in situ tahlil yoluyla nicelleştirmemizi sağlar . Bu analiz flüoresan jelatin katmandaki kara deliklerin varlığını analiz ederek MMP&#39;lerin proteoliz aktivitesini bildirir. İlginç olarak, doğrusal invadozomlara F-aktininin düzenlenmesi, jelatin-sadece 7&#39;ye kıyasla matris bozunum aktivitesini arttırmaktadır. Bu deneyin bir kısıtlaması, jelatinin fizyolojik olmayan bir matristir ve daha fizyolojik bir matrisin, mikro çevreye verilen hücresel tepkiyi değiştirdiğini göstermiştir. MMP aktivitesinin jelatin-kollajen I karışık matrislerinde nicelleştirilmesi yolunda ek bir sınırlama vardır. Sadece kollajen I fi&#39;nin altında lokalize olan jelatin parçalanmasıParlak katman sayılabilir; Bu nedenle, bu, kollajen I matris bozunmasını niceleştirmek için dolaylı bir yöntemdir. Lineer invadozomların bozunma aktivitesini görselleştirmek için alternatif bir yöntem, kollajen I liflerinin kolajen bölünme bölgelerine (Col1-3 / 4 C immünoglobulin) karşı spesifik bir antikorla etiketlenmesidir. Bu, parçalanmış liflerin immünofloresan ile görselleştirilmesine olanak tanır. Bununla birlikte, hücre göçü nedeniyle, bu antikor 2B&#39;de lineer invadozom oluşumu nedeniyle parçalanma için çok spesifik değildir. Kollajen I liflerinin bozunma aktivitesini görselleştirmek ve ölçmek için başka bir yol, çok ışıklı mikroskopi ve ikinci harmonik nesil kullanmaktır. Bu yöntem, herhangi bir boyama olmadan kollajen I liflerinin görüntülenmesine izin verir. Tip I kollajeni polimerize etme yöntemimiz, literatürde kullanılan diğer yöntemlere kıyasla farklıdır 12,13. Örneğin, Artym <em&gt; Et al. Alfa sarmal kollajen I çözeltisi ile kaplanmış santrifüj lamelleri ve 30 dakika kısa bir polimerizasyona izin verin. Bu yüksek yoğunluklu fibriler kollajen (HDFC), kolajen I elyaflarımıza kıyasla daha sert ve daha yoğundur ancak daha az polimerize olur. Matris yapısındaki bu farklılık, invadozom şeklini lineerden dot-like&#39;e kaydırır. Zaman, pH, konsantrasyon ve sıcaklık, ECM polimerizasyonu için kontrol edilmesi gereken parametrelerdir. Örneğin, polimerizasyon sıcaklığı ne kadar düşükse, lifler o kadar büyük olur. Hücrenin invazyonunda doğrusal invadozomların katılımını incelemek için 3D kollajen I fişi testi kullanıldı. 3D kollajen I fişi, invaziv yapıları veya metalloproteinazların invazyon sürecine katılımını incelemek için bilim camiasında zaten kullanılmıştır 14 , 15 , 16 . Bu tür 3D matrisler,R sertliği-örneğin 3D kolajen I fişi 2D matristen daha katıdır. Dahası, kollajen I&#39;in tipi ve kökeni, in vivo kollajen liflerinin farklı organizasyonu ile ilgili olarak da önemlidir 17 . Son olarak, in vivo mikro çevre kompozisyonu ile ilgili olarak, hücre dışı matriksin sadece bir elemanı, tip I kollajen üzerinde durulmuştur. İn vivo doğrusal invadozomların önemini belirlemek için ileri çalışmalar gereklidir. Lineer invadozomların çalışmasına ek olarak, burada açıklanan karışık matris, fibronektin, vitronektin ve diğer kolajenler tipleri ( örn., Tip IV kolajen) gibi diğer matris bileşenleri tipleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, ilgilenilen matris elemanlarının tiplerine ve incelenecek proseslere bağlı olarak uyarlanabilir. Bununla birlikte, karmaşık ve fizyolojik matrislerin üretilmesinin,Hücre tutunması, göç ve istila ile ilgili yollar.

Ekstraselüler matriks (ECM) yeniden şekillenmesi, anjiyogenez ve tümör hücresi invazyonu gibi fizyolojik ve patolojik süreçler sırasında ortaya çıkar. Fizyolojik koşullarda, çoğunlukla hematopoietik soytan gelen birçok hücre türü ECM elementlerini parçalayabilir. Örneğin, makrofajlar dokulara ulaşmak için anatomik engelleri aşabilir ve osteoklastlar kalsiyum homeostazını sağlamak için kemik matriksini parçalayabilir. Daha genel olarak, vücudun tüm matrisleri fiziksel ve kimyasal özelliklerini korumak için yenilenir. Kanser dokularında tümör mikro çevre bileşimi değişir. Örneğin göğüs ve akciğer kanserinde tip I kollajen aşırı eksprese edilir ve tümörün çevresinde birikir. Üstelik bu birikim, metastaz gelişme riski 1 , 2 ile ilişkilidir. Kanser metastazı, kanser hücrelerinin ECM&#39;yi bozma ve bitişik dokuları istila etme kabiliyetine bağlıdır. Hücrelerin invaziv aktivitesi invadosomes olarak bilinen özel aktin bakımından zengin yapılara atfedilir. Bu terim, normal ve kanser hücrelerinde ( örn., Makrofajlar, endotel hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hattı gibi kanser hücreleri) bulunan podozomları ve invadopodiyi içerir. In vitro olarak , invadozomlar farklı şekillerde organize edilebilir: noktalar, agregalar veya rozetler 3 . Klasik olarak, invadozomlar, integrinler ve vinculin 4 gibi adezyon plak molekülleri ile çevrili İskele proteini Tks5 ve kortaktin gibi birkaç protein ihtiva eden bir F-aktin çekirdeğinden oluşur. Son zamanlarda, Tks5 ve RhoGTPase Cdc42&#39;nin fonksiyonel invadozomlar için minimum bir moleküler imza olarak kullanılabileceği gösterildi 5 . Bu yapılar, MT1-MMP ve MMP-2 gibi spesifik metalloproteaz proteinlerinin işe alınması ve aktivasyonu yoluyla ECM&#39;yi bozabilmektedir. Önceki bir çalışmada, tip I kollajen fibrillerin spesifik bir reseptörü olan diskoidin alan reseptörü 1 (DDR1) arasındaki tip I kollajen fibrilleri arasındaki etkileşimin, lineer invadozomlar olarak adlandırılan invadozomların yeni bir sınıfının oluşumuna yol açtığını bildirdik. Doğrusal invadozomlar tip I kollajen fibriller boyunca oluşur 7 . Bu yapılar MT1-MMP / MMP2 alımında ve aktivasyonuyla tip I kollajen fibrillerini bozabilmektedir. Dahası, bunların oluşumu Tks5 ve Cdc42 5&#39;e bağlıdır. İn vitro olarak doğrusal invadozomların varlığını ve DDR1&#39;in oluşum ve aktivitelerine 8 dahil çeşitli matris elementlerinin kombinasyonundan oluşan farklı stratejileri kullanarak gösterdiklerini göstermiştir: i) flüoresan jelatin kaplı lamelleri, ii) flüoresan tip I kollajen fibril Kaplamalı lamelleri ve iii) 3D tip I kollajen fişleri. Farklı matrislerin kullanımı nedeniyle, çalışmak ve karakterLineer invadozom oluşumu ve parçalanma aktiviteleri 7,8. Son olarak, invaziv hücrelerin biyolojisini daha iyi anlamak için, 2D ve 3D kültür sistemlerindeki tüm ECM bileşenleri kombinasyonu kullanıldı ve tümör mikro çevre bileşiminin karmaşıklığını taklit etti. Aşağıda, 2D ve 3D kültür sistemlerinde jelatin / tip I kollajene sahip lamelleri kaplama protokolleri bulunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td>Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate</td>
			<td>Molecular probe life technologies</td>
			<td>G13186</td>
			<td>5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glasses</td>
			<td>Marlenfeld GmbH &#38; Co</td>
			<td>111520</td>
			<td>&#216;12mm No.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15960</td>
			<td>Dilute at 0.5 % in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>10010-015</td>
			<td>Use this PBS in all steps before fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat tail</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X + calcium + magnesium</td>
			<td>Gibco by life technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS buffer pH 7.4</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>Dilute at 1X in water Use in steps after fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tks5 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-30122</td>
			<td>Invadosome markers Dilution : 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cortactin 4F11 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>5180</td>
			<td>Invadosome markers Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DDR1 antibody</td>
			<td rowspan="2">Cell signaling</td>
			<td rowspan="2">5583</td>
			<td>Linear invadosome receptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution :1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FT-AZ0330</td>
			<td>Fibrillary actin marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>33258</td>
			<td>Nucleus marker Dilution :1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies FluoProbes</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-488 FP-547H or FP-647H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Dilute at 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G mounting medium</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP 483331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Public domain</td>
			<td></td>
			<td>http://www.macbiophotonics.ca/imagej/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353097</td>
			<td>8.0&#181;m pore size / 24 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2d and 3d matrices to study linear invadosome formation and activity

Hücre yapışması, migrasyonu ve istilası birçok fizyolojik ve patolojik süreçte yer alır. Örneğin, metastaz oluşumu sırasında, tümör hücreleri, kan veya lenfatik damarlara ulaşmak için çevresindeki dokuya istila etmek ve göç etmek için anatomik engelleri aşmak zorundadır. Bu, hücreler ile ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki etkileşimi gerektirir. Hücresel seviyede, kanser hücrelerinin çoğunluğu da dahil olmak üzere pek çok hücre, ECM&#39;yi düşürebilen F-aktin esaslı yapılar olan invadozomlar oluşturabilir. Invadozomlar, matriks metaloproteinazları (MMP&#39;ler) işe alıp aktive eden protrusif aktin yapılardır. ECM&#39;nin moleküler kompozisyonu, yoğunluğu, düzenlenmesi ve sertliği, invadozom oluşumunun ve aktivasyonunun düzenlenmesinde çok önemlidir. İn vitro olarak , bir jelatin testi, invadozom yıkım aktivitesini gözlemek ve ölçmek için kullanılan standart tahlildir. Bununla birlikte, denatüre kolajen I olan jelatin, fizyolojik bir matris değildir eelemanının net. Tip I kollajen fibriller kullanan yeni bir deney geliştirildi ve bu fizyolojik matrisin invadozomların güçlü bir uyarıcısı olduğunu göstermek için kullanıldı. Kollajen fibriller boyunca oluşan invadozomlar, fiberler üzerindeki lineer organizasyonu nedeniyle doğrusal invadozomlar olarak bilinirler. Dahası, lineer invadozomların moleküler analizi, diskoidin alan reseptör 1&#39;in (DDR1) oluşumunda yer alan reseptör olduğunu gösterdi. Bu veriler, hücreler ile ECM arasındaki karmaşık etkileşimleri anlamak için fizyolojik olarak önemli bir matrisin kullanılmasının önemini açıkça göstermektedir.

İki tip matris, jelatin ve tip I kollajen kombinasyonunu kullanarak ( Şekil 1 ve 4 ) doğrusal invadozomlar olarak bilinen yeni bir invadozom türüne dikkat çektik. Bu matrislerin etiketlenmesi, kollajen I lifleri boyunca doğrusal invadozom oluşumunun gözlemlenmesine ve bozunma kabiliyetlerine izin verir ( Şekil 5 ). Daha sonra invazif yapıların sayısı, daha önce açıklanan makro (adım 4.2) ile nicelleştirilebilir ve degradasyon aktivitesi, Martin ve ark. Tarafından tarif edildiği gibi ImageJ yazılımı kullanılarak da belirlenebilir . Ve Diaz ve diğ. 9 , 10 . Karışık matris, doğrusal invadozom oluşum ve işlevselliği için gerekli olan reseptör olarak DDR1&#39;i tanımlayarak doğrusal invadozomların karakterize edilmesine olanak tanır ( Şekil 6 ). Şekil 3 ve 7 ). Bu tahlil, z-yığını rekonstrüksiyonlarını kullanarak, kollajen I fişine işgal eden hücrelerin sayısını ve seyahat edilen mesafeyi belirlememizi sağlıyor. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig4.jpg" /> Şekil 4: Konfokal mikroskopi kullanılarak jelatin ve jelatin-kollajen I karışık matrislerin karşılaştırılması. Şematik olarak, üst paneldeki floresan jelatin lamelleri organizasyonunu gösterir. ( A ) Konfokal z-yığını yeniden yapılandırması, flüoresan jelatin matrisinin lamelin tüm yüzeyini kaplayan ince, tek biçimli bir tabaka oluşturduğunu gösterir. ( B ) Karışık matriste, lamelleri üzerinde flüoresan jelatin biriktirdikten sonra, tip I kollajen fibrillerÜstte polimerize edin. I fibriller kollajeni kırmızı renkte boyanmıştır. Kolajen I matrisi lamel üzerinde kalın ve heterojen. Kollajen I liflerinin dağılımı kolajen Iα zincirlerinin polimerizasyonuna bağlıdır. Ölçek çubuğu = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig5.jpg" /> Şekil 5: Jelatin ve jelatin-kollajen I matrislerinin invadozom oluşumu ve aktivitesi üzerindeki etkisi. Bu testler için kullanılan hücreler MDA-MB-231 meme kanseri hücreleridir. ( A ) Bir şematik gösterim, üst paneldeki floresan jelatin lamelleri üzerine ekilen hücreleri göstermektedir. Bozulma alanları flüoresan azalması nedeniyle siyah renkte görüntülenir. Tks5 boyaması bir invadozom markörü olarak kullanıldı. Jelatin üzerinde, invBu biçimdeki adosomlar noktalı olarak düzenlenmiştir. ( B ) Şematik bir gösterim, jelatin ve kollajen I&#39;in karışık bir matrisine ekilen hücreleri gösterir. Kolajen I kırmızı renkte etiketlenmiştir; Tip I kollajen fibriller ilavesi, hücrenin jelatin parçalanma yeteneğini arttırır. İlginç olarak invadozom belirteç Tks5 yeniden düzenlenir ve noktalar lineer invadozomları temsil eden lineer yapılarla değiştirilir. Bozulma alanları flüoresan azalması nedeniyle siyah renkte görüntülenir. Ölçek çubuğu = 5 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig6.jpg" /> Şekil 6: Jelatin ve karışık matris koşullarında moleküler kompozisyon ve invadozom organizasyonunun konfokal mikroskopik analizi. ( A ) gElatin durumu, invadozomlar noktalar halinde düzenlenir ve F-aktin (kırmızı) Tks5 (yeşil, alt panel) ile birlikte bulunur, ancak DDR1 (yeşil, üst panel) ile birlikte lokalize olmaz. Bunlar klasik invadozomlar. Ölçek çubukları = 5 μm. ( B ) Jelatin-kollajen I karma-matriks koşulunda DDR1 (yeşil, üst panel) kollajen I fibrilleri (kırmızı, üst panel), Tks5 (yeşil, alt panel) ve F-aktin (kırmızı, alt) ile kolokalize olur panel). Tip I kollajen fibriller doğrusal invadozomların oluşumuna neden olur. Ölçek çubukları = 10 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/54911/54911fig7.jpg" /> Şekil 7: Bir kollajen I fişinde MDA-MB-231 hücrelerinin hücre invazyon testi. Hücreleri tohumladıktan 1 saat sonra, kontrol ekleri sabitlenir ve boyanır. ( A ) z-stack aKonjokal mikroskopi kullanılarak kolajen I fişinin kazanılması gerçekleştirilir. Hücreler, bu noktada kollajen I&#39;i tıkamıyor; Aksine, taktığım kolajenin üstünde kalırlar. Böylece, bu, herhangi bir istila oluşmadığında kontrol noktası olarak kullanılır. MMP aktivasyonu, hücrelerin bu yoğunlukta bir kollajen I fişini istila etmeleri için gereklidir. ( B ) Ekimden üç gün sonra, bazı hücreler, fişi takılan kollajen I&#39;i istila eder. Bu test hücre invazyonunun gözlemlenmesi ve miktarının belirlenmesine izin verir. Buna ek olarak, örneğin, çeşitli ilaçların veya siRNA&#39;ların etkisini incelemek için kullanılabilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54911/54911fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity at JoVE.com

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Bu protokol, jelatin ve kollajen I&#39;den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir.

Doğrusal Invadozom Oluşumu ve Aktivitesi Çalışmak İçin 2D ve 3D Matrisler

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

2d-and-3d-matrices-to-study-linear-invadosome-formation-and-activity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Görüntüleme.  INSERM U1053.  Bu protokol, jelatin ve kollajen I'den oluşan bir 2D karışık matristin nasıl hazırlanacağını ve lineer invadozomaları incelemek için bir 3D kolajen I fünyesinin nasıl hazırlandığını açıklamaktadır. Bu protokoller lineer invadozom oluşumunun, matris bozulma aktivitesinin ve birincil hücrelerin ve kanser hücre çizgilerinin invazyon yeteneklerinin incelenmesine izin verir. 

Video: 2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Biyomühendislik

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable aljinat/jelatin hidrojel 3D Vitro Model sistemleri hücre küresel oluşumu teşvik

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Novel Process for 3D Printing Decellularized Matrices

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can provide mechanical stability similar to native tissue while biologic agents offer compositional cues to progenitor cells, leading to their migration, proliferation, and differentiation to reconstitute the original tissues/organs1,2. Unfortunately, many 3D printing compatible, bioresorbable polymers (such as polylactic acid, PLA) are printed at temperatures of 210 &#176;C or higher - temperatures that are detrimental to biologics. On the other hand, polycaprolactone (PCL), a different type of polyester, is a bioresorbable, 3D printable material that has a gentler printing temperature of 65 &#176;C. Therefore, it was hypothesized that decellularized extracellular matrix (DM) contained within a thermally protective PLA barrier could be printed within PCL filament and remain in its functional conformation. In this work, osteochondral repair was the application for which the hypothesis was tested. As such, porcine cartilage was decellularized and encapsulated in polylactic acid (PLA) microspheres which were then extruded with polycaprolactone (PCL) into filament to produce 3D constructs via fused deposition modeling. The constructs with or without the microspheres (PLA-DM/PCL and PCL(-), respectively) were evaluated for differences in surface features.

This protocol describes the production of polycaprolactone (PCL) filament with embedded polylactic acid (PLA) microspheres which contain decellularized matrices (DM) for 3D printing of structural tissue engineering constructs.

Matrisler roman işlemi 3D baskı için Decellularized

3D bioprinting aims to create custom scaffolds that are biologically active and accommodate the desired size and geometry. A thermoplastic backbone can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

IPSC türetilmiş Endotel Hücrelerinin Perfüzyonlu 3D Anjiyojenik Filizlenmesini İn Vitro Olarak İncelemek Için Standart ve Ölçeklenebilir Tsay

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...