우리는 DR - 자동차 기술을 개발하고 그들의 공헌에 대한 이완 Schie과 세바스찬 Wachsmann - Hogiu 감사하고 싶습니다. 타일​​러 윅스 로렌스 리버 모어 국립 연구소의 로렌스 학술 프로그램에 의해 지원을 인정한다. 토마스 허저는 보조금 프로그램을 통해 미국 심장 협회의 지원에 감사합니다. 이 작품 또한 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 기금에 의해 일부 지원되었다. Biophotonics, NSF 과학 기술 센터를위한 센터는 공동 계약 번호 PHY 0,120,999 아래 캘리포니아 데이비스 대학에 의해 운영됩니다. 지원도 연구 자원 (NCRR)에 대한 국립 센터에서 부여 번호 UL1 RR024146 아래 UCD 임상 Translational 과학 센터에서 인정받고 있습니다.

1. 자동차와 DR - 자동차 신호의 생성 자동차를 생성하고 DR - 자동차 신호는 동시에 세 조정할 수 및 동기 펄스 레이저 짧은 소스가 필요합니다 순서를 유지해야합니다. <ol><li> 우리가 한 10 W 레이저 (PicoTrain, HighQ 레이저, 주식 회사)로 시작하는 세 동기 펄스를 얻을 수 있습니다. 이 레이저는 1064 nm의 파장의 고정 7 PS의 고정 펄스 길이, 76 MHz의의 고정 반복 속도를했습니다. </li><li> 하프 웨이브 접시 일련의 사용 및 빔 스플리터를 편광하면 광선이 세 부분으로 나뉩니다 큐브. 편광 빔 스플리터 큐브와 함께 반 파장 판은 우리의 방향을 변경하지 않고 빔의 각 구성 요소의 전원의 양을 조절할 수 있습니다. 일반적으로, 두 광선은 ~ 4.5 W 각각 조정하고, 세 번째 빔이 남아있는 한 W.를 포함 아르 </li><li> 두 높은 전력 광선은 다음 두 개의 독립적인 광 파라메 트릭 발진기 (OPO의, 아반떼, 원숭이 GmbH를, 베를린, 독일)로 이동합니다. 다른 파장 두 개의 낮은 에너지 광자로 높은 에너지 광자를 변환하는 OPO의 사용 차이 주파수 생성. 이 효과를 달성하는 데 사용되는 크리스탈의 온도를 조절함으로써, 결과 광자의 파장은 0.1 nm의 시간을 제어할 수 있습니다. 으로 주파수 더블링이 신호를 1,064 NM의 고정 파장을 가진 레이저 지금 910 nm의에 780 nm의 사이 어디서나 조정할 수 있습니다 레이저 빔을로 변환하실 수 있습니다. 같은 1064 NM 원본과 두 개의 OPO의 펌핑함으로써, 우리는 자동으로 오리지널 펌프 레이저로 동기화 두 독립적으로 조정할 수있는 레이저 소스를 얻습니다. </li><li> 1,064 NM 펌프 레이저에서 세 번째 (최저 전력) 빔이 세 기둥이 (2 펌프 레이저에서 OPOs, 1) 나중에 recombined 수 있도록 이색성 거울의 조합에 의해 OPO의 주위에 이동합니다. 효율적으로 일관된 래맨 신호 광자를 생산하기 위해 recombined 펄스는 두 temporally과 공간 overlapped해야합니다. OPO의 각 레이저 펄스는 결정을 여러 번 통과하므로 링 충치를 포함하기 때문에, OPO의 여행을 통해 원래 펌프 빔에 비해 상당한 지연에 발생하는 여분의 거리를 보낸 빔. 이 거리는 그들이 이색성 거울을 사용 recombined 전에이 광선은 다른 두 사람과 같은 거리를 여행하도록 별도의 거울을 도입하여 세 번째 빔을 보상해야합니다. </li><li> 멋진 각각의 빔이 프리즘 retroreflectors를 사용하여 조정 지연 단계를 여행 경로의 길이 조정, 각각의 빔 경로로 소개를 제공하기 위해. </li><li> 하프 웨이브 플레이트 및 편광 빔 스플리터 조각의 또 다른 집합은 우리가 독립적으로 OPO의 입력에 영향을 미치지 않고 각 광선의 전원을 조정할 수 있도록 각 광선에 추가됩니다. </li><li> 이색성 거울 먼저 두 OPO의 다음 1064 NM 빔을에서 빔을 결합하는 데 사용됩니다. 케어는 대들보는 정확하게 (그들은 collinear 아르 IE와 유사한 발산을 가지고) overlapped되는 것을 보장하기 위해 이동해야합니다. 이 (~ 1m) 이색성 거울에서 가까운 빔 중복 (몇 cm 이내)와 지금까지를 비교하여 확인하실 수 있습니다. </li><li> 펄스 레이저를 사용하는 이점은 여전히​​ 낮은 평균 강도를 유지하면서 각각의 펄스는 일관된 래맨 신호의 효율적인 세대 수 있도록 샘플에서 하이 피크 에너지를 수있다는 것입니다. 높은 평균 강도는 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 추가로 최대 에너지를 희생하지 않고 평균 강도를 조절하기 위해 세 가지 결합 대들보는 우리 그 펄스의 반복 속도를 조절할 수있는 펄스 따는 등 전자 광학 변조기 (Pockel의 휴대폰, ConOptics) 기능을 통해 발송됩니다 샘플에 도착하므로 평균 강도. </li><li> 통합 레이저 광선은 다음 높은 NA의 목적으로 거꾸로 현미경으로 결합하고 있습니다. 목표는 일반적으로 우리 OPO의 tunability과 1,064 nm의 광선의 범위에 걸쳐 색수차에 대한 수정되었습니다 1.2의 수치 구경 (NA)와 60 X 물 객관적인 렌즈입니다. 높은 NA의 객관적인 렌즈에 의해 생성된 초점 꽉는 마이크론 규모의 일관된 래맨 신호의 가장 효율적인 세대 수 있습니다. </li><li> 통합 빔은 현미경 목표의 뒷면 포트를 너무 많이 넣다하기 위해 확장됩니다. 현미경 목표의 뒷면을 overfilling함으로써 우리는 최고의 초점 조건을 얻을 수 있으므로 우리의 현미경 시스템에서 최고의 공간 해상도. </li><li> 우리가 현미경의 목적 렌즈는 우리를 상업 빔 - 스캔 공촛점 현미경과 유사한 예제를 통해 빔을 래스터는 - 스캔하여 이미지를 얻을 수 있습니다 XYZ 압전 무대에 장착할 수 있습니다. </li></ol> 2. 쓰리 쇼트 펄스 레이저의 사용 다양한 C에서 여러 차량 신호의 생산 세 짧은 펄스 레이저 결과의 사용이 레이저뿐만 아니라 3 색 자동차와 세 레이저의 조합에서 DR - FWM 신호 ombinations. <ol><li> 신호의 파장은 서로 가까운 spectrally 거짓말을하실 수 있습니다. 신호가 가까이 함께하는 경우는 고정 파장 대역 통과 필터 및 이색성 거울을 사용하여 분석을 위해 그들을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이러한 이유로 우리의 신호는 공간 다른 파장의 신호를 분리하는 효율적인 단색 역할을 영상 분석기 (SpectraPro 2300i, 액튼 연구)에 전달됩니다. </li><li> 인하 위치에 분광계 내의 전자 actuated 플립 미러는 전체 신호 범위에 걸쳐 spectroscopic 정보를 제공하는 백업 조명 깊은 고갈 전하 결합 소자 (CCD) 카메라로 신호를 보내고 우리가 다양한 일관성을 파악하고 최적화할 수 있습니다 래맨 신호. </li><li> 우리가 이미지를 원하는되는 신호를 선택하려면 우리는 간단하게 변경 후 공급 업체 - 공급 제어 및 센터에 데이터 수집 소프트웨어 (WinSpec, 프린스턴 인 스트 루먼트), CCD 카메라에 대한 관심의 절정을 사용하여 분광계 내의 격자를 회전하고 단일 광자 계수의 눈사태 사진 다이오드 (APD)가 첨부되었습니다하기 위해 두 번째 출구 포트로이 신호를 리디렉션하는 플립 미러의 위치. </li><li> 목표 렌즈 다음 래스터 스캔되고 APD에 기록된 신호는 데이터 수집 소프트웨어 (SymPhoTime, Picoquant GmbH를, 베를린, 독일)를 통해 각 픽셀에 대한 계산 속도 광자를 표시하여 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. </li><li> 우리는 우리 후처리 동안 신호를 비교할 수 있습니다 각각의 원하는 일관된 래맨 신호에 대해이 이미징 절차를 반복합니다. </li></ol> 3. 샘플 준비 명확하고 재현성 이미지를 얻기 위해서는 몇 가지주의 샘플 준비에 촬영해야합니다. <ol><li> 샘플은 일반적으로 ~ 150 마이크론 두께의 유리 coverslips에 준비가되어 있습니다. 이러한 coverslips 일반적으로 사용되는 1.2 NA의 목표와 고해상도 이미징을위한 충분한 얇은 있습니다. </li><li> 레이저 빛이 작은 투명 개체를 통해 diffracted 때 유전체 개체의 광학 트래핑가 발생할 수 있습니다. 밀접하게 초점을 맞추고, 하이 피크 전력의 사용은 짧은 펄스 레이저 광선 다음 흐리게하거나 발랐습 이미지 결과 따라 작은 세포 또는 세균을 끌 수 있습니다. 이것을 방지하기 위해서는 첫번째 스핀 코팅에 의해 폴리 - L - 라이신의 얇은 레이어를 적용하여 유리 coverslip의 표면에 시료를 고정 할 수 있습니다. </li><li> 문화 전지 유리 바닥 문화 요리들은 세포 배양 성장 요리에서 세포를 분리하지 않고 이미지에 대해 허용되는 이용하실 수 있습니다. </li><li> 이 공헌 실험을 위해 우리는 먼저 포름 알데히드 - 고정 C. 입금 유리 커버 슬립에 엘레간스의 선충류 벌레. </li><li> 다음 웜 5 M 진정제를 맞았을 포도당 용액 20 μL 비말을 추가합니다. 진정제를 맞았을 포도당 솔루션은 독특하고 강력한 래맨 배경 서명을 제공합니다. </li></ol> 4. 샘플 분석 제대로 이중 - 공진 향상 효과를 활용하기 위해서는 두 래맨 - 공진 물질의 래맨 스펙트럼을 알 수 있어야합니다. <ol><li> 일단 샘플은 관련 자발적인 래맨 스펙트럼을 구하고 적절한 봉우리를 식별할 수 공촛점 래맨 현미경을 사용하여 그것이 분석되는 coverslip에 준비가되어 있습니다. </li><li> 우리가 -1 각각 2,845센티미터 -1과 2천1백21cm 수, 진정제를 맞았을 포도당과 관련된 일반적으로 lipids와 관련된 CH 스트레치 모드, 그리고 CD 스트레치 모드의 스펙트럼 위치를 식별 DR - 자동차를 수행합니다. </li><li> 이 레이저 사이의 주파수 차이가 분자 진동의 주파수를 일치하면 일관된 래맨 산란이 이루어진다. 1,064 NM 레이저 빔과 1,064 nm의 광선과 함께 때 2,121센티미터 -1 정상 프로브 것입 868 nm의에 다른 OPO를 조정하여 결합하면 817의 NM으로 튜닝 한 OPO으로 그것은 2천8백45cm -1 CH 모드를 조사합니다 . </li><li> 으로 래스터 - 스캐닝 우리가 지금 관심의 세 일관된 래맨 신호를 관찰할 수있는 자동차 현미경에 샘플을. 자동차는 진동을 스트레칭 CH를 프로빙 신호, 차량 CD 스트레치 모드, 모두 프로빙 DR - 자동차 신호를 프로빙 신호. </li><li> 우리는 섹션 2.3에서 설명한대로 각 피크를 선택하고 위에 설명된대로 이미지를 가져가라. </li></ol> 5. 이미지 처리 이 세 가지 이미지에 따라 추가 정보를 추출하는 것은 이제 몇 가지 매우 간단한 이미지 프로세싱이 필요합니다. <ol><li> 먼저 이미지를 정상화해야합니다. 이론 정규화의 각 신호 생성 과정에 관여 각 레이저의 강도에 대한 회계에 의해 얻을 수 있습니다. 실제로, 그러나 이것은 항상 비 균일한 스펙트럼 반응으로 인해 주로 작동하지 않습니다이색성 거울, 감지기, 그리고 통같이니다. </li><li> 정상화를위한 실용적인 방법은 순수한 lipids가 신호를 지배 지역에서 CD 공명 신호가 어떤 기여하지 말아야한다는 사실에 의존합니다. 마찬가지로, 순수한 포도당 솔루션의 지역 채널 공명 신호가 어떤 기여해서는 안됩니다. 마음이와 함께, 우리는 C. 밖에 잘 지역에 진정제를 맞았을 포도당 용액의 CD의 공명에서 얻은 DR - 자동차 이미지와 자동차 이미지를 정상화 어떤 채널 공진을 전시 없어야 엘레간스 웜. </li><li> 그럼 우리가 lipids 풍부하다 CH - 공진 자동차 이미지의 웜 내의 영역을 식별하고 표준 DR - 자동차 이미지 이내에 해당 지역에 정상화. 이 방법이 제대로 작동하기 위해서는 우리는이 지역 내의 깊은에는 진정제를 맞았을 포도당이 존재하지 않는 가정합니다. lipids은 소수성이며 솔루션을 혼합하지 않습니다 때문에 이것은 안전한 가정입니다. </li><li> 이제 표준 DR - 자동차 이미지에서 표준 CH - 공진 자동차 이미지를 빼서하여 우리는 그냥 증폭 CD - 공진 신호가 남아 있습니다. </li><li> 마찬가지로 표준 DR - FWM 이미지에서 표준 CD - 공진 자동차 이미지를 빼서하여 우리는 그냥 증폭 CH - 공진 신호가 남아 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 위에서 설명한 DR - 자동차 현미경 시스템의 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : C.의 화이트 빛 이미지 진정제를 맞았을 포도당 용액에 엘레간스 웜은 유리 coverslip에 대한 준비 및 이미징을위한 준비. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 :. alkyne 수정을 (탄소 트리플 결합 탄소 그룹)가 포함되어 수정된 올레의 산성 (불포화 지방산)의 래맨 스펙트럼이 2천8백45cm -1과 2천1백센티미터에서 alkyne 공명에 강한 채널 resonances -1 모두 아르 잘 일관된 래맨 이미징에 이상적 마커 만들기, 지문 영역 (밀도 포장 봉우리의 지역)에서 고립. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 :. 세 짧은 펄스 레이저가 시료 내에 overlapped 때 발생하는 일관된 래맨 신호의 일반적인 스펙트럼이 화살표는 에너지 도표로 표시 각 신호에 대한 책임 프로세스 (ES)를 가리 킵니다. 여기에 표시된 다이어그램에서 점선 화살표는 결과 신호를 나타내는 레이저와 OPO의와 고체 화살표에서 광자를 나타냅니다. 단단한 수평 라인 래맨 진동의 에너지를 표시하고 DR - 자동차, 동시에 프로브 두 개의 다른 래맨 진동을 같은 3 입력 광자 혼합, 시각적 표현을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5 : 이미징 C.에서 전형 결과 DR - 자동차와 자동차를 사용하여 엘레간스 벌레가. 맨 윗줄은 진정제를 맞았 포도당의 솔루션에 이미지 벌레를 그림 4에 표시된 세 가지 신호를 사용합니다. 두 번째 행에있는 이미지가 적절하게 표준화되었으며 세 번째 행에있는 차이 이미지는 DR - 자동차 이미지에서 자동차 이미지의 각을 빼서에 의해 생산되었다.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

래맨 분광법과 래맨 기반 이미징은 생체 과학의 강력한 새로운 도구입니다. 현재이 생체내와 lipids 처리 및 저장에 세포의 대사와 신진 대사 장애의 체외 연구에서 특히 사실입니다. 대부분의 바이오 macromolecules은 세포와 유기체에서 얻은 래맨 스펙트럼은 일반적으로 lipids, 단백질, 핵산, 당분의 기부금의 회선되도록 비슷한, 대부분 탄소 기반의 분자 채권의 큰 숫자를 포함하는 등 Lipids은 비교적 쉽습니다 때문에 밀도 방울이나 bilayers를 형성하기 위해 경향과 그들이 지방족 CH 채권의 큰 번호와 확장 체인을 포함하기 때문에, 이러한 복잡한 스펙트럼에서 분리합니다. 복잡한 세포 환경 내에서 특정 단백질, 아미노산, RNA 또는 DNA를 분리하는 능력은, 그러나 매우 제한됩니다. 관심이 분자는 아래에서만 μm의 농도에 존재하고있다면 이것은 특히 사실입니다. 여기, 우리의 새롭게 도입된 DR - 자동차의 차이 이미징 기술을 이용하여 약한 래맨 resonances을 탐사하는 능력은 그들의 화학 microanalysis 및 이미징을위한 잠재적으로 강력한 방법을 제공합니다. 틀림없이,이 프로토콜의 가장 복잡한 부분은 레이저 시스템의 정렬 및 동기화됩니다. 처음부터 시작하면, 펄스의 동기화, 즉 펄스가 그들이 펄스 autocorrelator의 사용에 의해 용이 걸릴 수있는 다른 경로에도 불구하고 시간에 overlapped 것을 보장. 일단 공간과 시간적 중복은 달성 자동차 DR - 자동차 신호를 쉽게 감지할 수 있어야합니다. 그러나, 최초의 정렬이 약하 신호의 결과로, 자주 원유입니다. 이 시스템을 잘 정렬을위한 가장 좋은 연습은 처음에 약한 신호를 생성하고 다음 각 경로를 따라 부드럽게 조정 거울 및 지연 단계를 사용하여 시간적 중복을 조정하여 신호 강도를 향상시키는 것입니다. , 룸 빛이 매우 효율적인 배플로 깨끗한 결과가 객실 조명으로 시스템을 운영함으로써 얻을 수있는 분광계 / 단색 행위가 비활성화 및 커튼 또는 렌즈 튜브는 다양한 광원 (예 : 컴퓨터 모니터의 도입 배경을 최소화하기 위해 있지만 표시기 조명, LED가 등). 우리의 특별한 설정은 단일 광자 계수의 눈사태 사진 다이오드 (APD) 감지기와 감지 5 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 하드웨어를 활용합니다. 이것은 비교적 낮은 소음이 있지만 여러 그룹에서 비슷한 측정을 만드는 유리 가변 이득과 함께 사진 배율 튜브 (PMT의) 발견 매우 약한 신호를 감지할 수 있습니다. PMT의 장점은 그들이 가변 이득을 제공하고 검출기의 정렬을 단순화하는 수있는 훨씬 더 큰 탐지 영역을 가지고있다. 또한, 설치 프로그램은 빔 스캔을 달성하기 위해 목표를 번역 압전의 단계를 사용합니다. 이 장점은 우리가 정확도 높은 학위를 이전에 스캔한 이미지 이내에 현장으로 돌아가 자연 래맨 스펙트럼을 포함하여 추가적인 측정을 취할 수있는 능력을 가지고있다. 다른 그룹은 스캐닝 미러 어셈블리, 또는 훨씬 빠르게 이미지를 제공하고 있지만 정확하게 이미지 내의 임의의 위치로 돌아가려는 능력 제한됩니다 올림푸스 FluoView 시스템으로도 전체 공촛점 스캔 장치를 이용하여 성공적으로되었습니다. 래맨 공명도 몇 가지 최적화가 필요할 수도 있습니다 중요한 단계와 일치하도록 레이저를 튜닝. 래맨 봉우리가 DR - 자동차와 자동차에서 얻은 최대 스펙트럼 피크 강도를 알고있을 수 있지만 반드시 자연 래맨 피크의 최대과 일치하지 않습니다. 이것은 자연 래맨 스펙트럼에 대한 상대 차량의 스펙트럼 왜곡이 아닌 공진 배경 신호 및 차량에 최고의 안경 웨이브 혼합에 의해 생성된 신호의 본질적인 간섭 때문입니다. 자동차 신호의 피크 스펙트럼 위치 계산하지만,보다 실용적인 접근 방식 래맨 공명의 예상 위치에 걸쳐 여러 개의 작은 스펙트럼 단계 OPOs를 조정하는 것입니다 수 있습니다. 이 프로세스는 명확 최대를 얻을 것입니다. 사실, DR - FWM에서 가장 감성 모두를위한 resonances이 최대로 조정해야합니다. DR - 자동차 접근법 중 하나는 마지막으로 잠재적인 문제도 논의되어야, 즉 DR - 자동차 신호 래맨 활성 확장 분자의 균일한 분포에 따라 달라집니다. 대부분의 생물 학적 개체의 경우이 잘 풍부하고 거의 편재는 물에서 광범위한 오의 공명이 될 수 있습니다. 물 그러나, 지질 모드를 증폭하기 위해 물의 공명을 이용하면 얻은 신호의 왜곡을 선도하는 등 지질 방울로 세포와 소수성 영역, 대상에서 제외됩니다. 우리의 예제에서, 우리는 우리의 생물 학적 샘플에 대해 쉽게 감지하고 풍부한 신호를 생성하기 위해 진정제를 맞았 포도당의 솔루션을 사용하고 있습니다. 마찬가지로, 물을 진정제를 맞았 또는 생물 학적 buffe를 진정제를 맞았같은 D - HEPES로 RS는 사용할 수 있습니다. C. 이내 예제에서는 지질이 방울 엘레간스 웜은 항상 시스템의 초점을 맞춘 레이저 스폿 이내에 진정제를 맞았 포도당 솔루션과 lipids 모두 포함할 정도로 작은되었습니다. 그러나 이것은 일반적으로 사실이 아니다. 특정 예제는 세포질 내에 비교적 큰 지질 방울을 생성 adipocytes, 것입니다. 이 의미는 DR - 자동차 기술로 실시하는 실험 결과를 확인하는 신중 준비 및 제어 실험을 필요로합니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

코히어런트 래맨 이미징 기술로 인해 높은 분자 특이성 1 라벨이없는 광학 이미징을 사용하는 그들의 약속에 대한 지난 10 년간 활동에 극적인 증가를 보았다. 이러한 기술의 감도 그러나, 밀리 어금니 분자 ​​농도의 1,2을 필요로하는, 형광보다 약한 정도의 많은 명령입니다. 여기, 우리는 강한 또는 풍부한 래맨 scatterers에서 얻은 자신의 신호를 증폭하여 래맨 - 활성 분자의 약하거나 낮은 농도의 검색을 활성화할 수 방법을 설명합니다. 생물 학적 샘플에서 짧은 펄스 레이저의 상호 작용은 샘플에 대한 고유의 화학적 정보를 가지고 각각의 일관된 래맨 산란 신호의 다양한 생성합니다. 일반적으로 이러한 신호, 예를 들어 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)의 하나는 다른 사람이 폐기하는 동안 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 그러나, 3 색 자동차, 4 파 혼합 (FWM)를 포함한이 다른 신호, 수집 및 자동차 신호에 비해 때, 정보를 검색하는 데 그렇지 않으면 어려운 3을 추출하실 수 있습니다. 예를 들어, 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차) 2 공진 신호 4 사이에 건설적인 간섭의 결과입니다. 우리는 보여주는 방법 lipids에 2,845cm -1 CH 스트레치 진동 및 진정제를 맞았 분자 (예 : 진정제를 맞았 설탕, 지방산 등)의 2,120cm -1 CD 스트레칭 진동 DR - 자동차 신호를 생성하는 데 필요한 세 가지 레이저의 튜닝 동시에 래맨 resonances을 알아내기 위해 이용하실 수 있습니다. 이러한 조건에서, 각 공명 모두도 생성 탐색 결합 DR - 자동차 신호에서 차량 신호뿐만 아니라 인치 DR - 차량 신호와 약한 신호 감도를 향상하는 데 사용할 수있는 풍부한 분자의 진동에서 증폭 신호의 차이를 검출하는 방법 우리는 보여줍니다. 우리는 더 이상 이러한 접근 방식도 용매의 강한 래맨 신호를 사용하는 예를 들면 희석 용질의 약한 래맨 신호를 향상시킬 수있는 이러한 두 신호가 서로 다른 분자에서 생성된 응용 프로그램에 확장 것을 보여줍니다.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS at JoVE.com

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K 조회수.  University of California, Davis. 세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

비디오: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

연구

생물학

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

생물 학적 시스템에서 산소 이미징에 대한 인광을 발하는 나노 프로브의 합성 및 교정

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Aggresome 같은 유도 구조에서 Photobleaching의 황색 형광 단백질 태그 p62 후 형광 복구

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...