Name: using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

애벌레 1. 준비 <ol><li> 일주일 행동을 기록하기 전에, 크로스 (25 처녀 5 남성의 최소)을 설정합니다. 25 ° C에서 모든 십자가와 자손을 유지한다. 주 : 배양 조건의 온도가 변경 될 수 있지만, 후술하는 타임 라인이 개발 속도의 변화를 고려하여 조절 될 필요가있다. </li><li> 오일 아침에 제일 먼저 녹음하기 전에, 한천 / 주스 캡과 한천 / 주스 캡의 중심에 효모 페이스트의 소량 (0.5 ml)로 수집 케이지에 십자가를 배치합니다. <ol><li> 컬렉션 케이지를 확인하려면 6온스에 구멍을 찌를. 광장 폴리에틸렌 초파리 병입니다. </li><li> , 한천 / 주스 캡을 원뿔형 플라스크에 600 ml의 물과 한천 18g을 혼합합니다. 200 ml의 사과 주스와 별도의 플라스크 믹스 20g 자당합니다. 고체 때까지 전자 레인지 용해된다. 혼합물을 60 ℃로 냉각 할 수 있도록 결합하고 교반한다. 95 % 에탄올 20 ml의 10 % 메틸 -p- 디 하이드 록시 벤조 에이트를 추가하고 약동하십시오. 추가 ~ 735 X 10mm 라운드 페트리 접시의 바닥 절반 ml의. 한천 / 주스 실온에서 1 시간 동안 응고하도록 허용합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 효모 페이스트을 볼륨 드라이 이스트와 물에 의해 동일한 부품을 추가합니다. 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 애벌레 컬렉션의 상태를 확인합니다. <ol><li> 아침에, 4 3 일 녹화 전에 캡을 제거하고 케이지에 신선한 캡을 배치합니다. 24 시간 계란의 수집 및 부화 유충을 얻기 위해 매일 같은 시간에 캡을 변경합니다. </li><li> 각각의 캡이 제거 된 후, 크로스 누워 얼마나 계란 참조하여 검토한다. 500 ~ 2,000 개의 알을 기대합니다. 필요한 경우, 성인의 수를 조정합니다. 주 : 몇 알이 유충으로 부화해야하고, 새로 부화 된 유충이 떨어져 효모 페이스트에서 발견됩니다. </li><li> 24 시간 동안 각각의 캡을 나이. 애벌레 건강 여부를 결정하기 위해 뚜껑을 다시 검토한다. 주 : 대부분의 알이 유충으로 부화해야하며, 유충은 너희로 크롤링해야AST 페이스트. 건강이 좋지의 징후는 면역 반응을 나타내는 복부에 상당한 어두운 패치와 깐 계란의 많은 수의, 멀리 효모 붙여 넣기에서 죽은 애벌레의 몸과 애벌레를 포함한다. 애벌레가 건강에 해로운 경우, 케이지를 변경 신선한 모자 / 효모 붙여 넣기를 확인하고 유전자형을 확인합니다. </li><li> 기존의 캡을 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 행동 레코딩을위한 애벌레를 수집합니다. <ol><li> 녹화 전에 모두 2 일일에서, 캡을 제거하고 신선한 캡으로 교체합니다. </li><li> 각각의 제거 캡 레이블을 25 ° C로 유지합니다. 이 행동 레코딩을위한 유충의 단계적 시리즈를 생성합니다. 두 번째 령 (24 ~ 48 시간의 부화)을 통해 (0-4 시간의 부화) 새로 부화에서 애벌레는 채널에서 사용할 수 있습니다. 일 연속에 레코딩을위한 모자를 저장합니다. </li><li> 48 시간 후 모두 대문자를 폐기하십시오. </li><li> 필요한 경우, 최대 5 추가 일 동안 1.4.1-1.4.3 단계를 반복합니다. 그 적은 후 수정란이 생성된다. </li></ol></li></ol><ol><li> 선형 채널 PDMS (폴리 디메틸 실록산, 실리콘 엘라스토머) 주형 (도 1a)를 준비한다. 금형 주조 PDMS는 요청시 Heckscher 실험실에서 사용할 수 있습니다. <ol><li> 이소 프로필 알코올로 주조 금형을 청소합니다. 공기 건조, 소량 실험실 와이프 건조 또는 통조림 공기를 사용합니다. </li><li> 10cm의 페트리 접시 뚜껑 또는 다른 용기에 주조 금형을 놓습니다. </li></ol></li><li> 준비하고 아가로 오스 솔루션을 붓는다. <ol><li> 완전히 용해 될 때까지은 전자 레인지로 물에 3 % 아가로 오스 용액 (100 ㎖ 3 g)을 확인합니다. </li><li> 55 ° C로 냉각, 기포가 표면으로 상승 할 수. </li><li> 몰드 막 피복되도록 주형을 함유하는 페트리 접시로 오스 혼합물을 붓는다. 응고 될 때까지 아가로 오스 세트를 보자. </li></ol></li><li> 주형에서 아가로 오스 채널을 제거합니다. 면도날 아가 디스크의 가장자리 트림. <ol><li> 채널을 넣어물에 침지 10cm 페트리 접시에의. 이들은 7 일 동안 4 ℃에서 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 기록 동작에 채널에 애벌레로드 (3) 참고 : 4 ° C에서 채널을 저장하는 경우, 채널 행동 기록을 위해 사용하기 전에 실온에 올 수 있습니다. <ol><li> 2 단계 (그림 2A)에서 제조 한 것과 하나의 채널을 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (그림 2B)에 채널 홈 측 업을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 커버 슬립의 크기와 두께가 촬상에 사용 된 특정의 범위에 따라 달라진다. </li><li> 1 단계에서 제조 된 한천 / 주스 캡에서 유충을 선택하고 절단 된 채널 (그림 2C)에 배치하는 미세 집게를 사용합니다. <ol><li> 유충을 짜내하지 마십시오. 겸자 타인의 끝으로 가볍게을 선택합니다. 좋은 점과 붓으로 유충을 조작 할 수있다. 참고 :이 중요하다 애벌레로 매우 센있다터치 sitive. 이들은 취급에주의하지 않으면, 통각 반응 실험의 처음 몇 초 동안 그 동작을 지배하는 것이다. </li><li> 간단히 물을 잠수하여 유충을 씻으십시오. </li><li> 절단 된 채널에 유충을 배치 한 후, 부드럽게 채널 숲에 유충을 애타게 겸자 타인의 팁을 사용합니다. 참고 : 대부분의 응용 프로그램 유충의 폭과 채널의 폭이 일치해야합니다. 개발의 다른 단계에서 유충의 평균 폭은 다음과 같습니다 : 0 시간의 부화 - 140 μm의, 24 시간 부화 - 180 μm의, 48 시간의 부화 - 320 μm의, 72 시간의 부화 - 500 μm의 96 시간의 부화 - 750 μm의 8. 다음 폭 올 채널 : 100, 150, 200, 250, 300 μm의 모든 채널은 150 ㎛의 깊이이다. </li><li> 채널 내의 유충의 위치를 ​​조정하는 셉 타인 또는 붓의 끝 부분을 사용합니다. 그것은 어떤 방향으로 배향 될 수있다 : 복부업, 복부 아래 복부 한쪽은, 어떤 구조에 따라서 묘화한다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 부드럽게 유충 커버 유리 지금되도록 통해 채널 플립. 그것을 물 (도 2D)를 채우도록 채널의 단부에 물을 한두 방울을 놓는다. <ol><li> 부드럽게 공기 방울을 제거하기 위해 채널의 측면을 들어 올립니다. </li><li> 유충의 방향을 조정합니다. 이렇게하려면 부드럽게 채널이 아닌 유충을 롤 커버 유리를 슬쩍 찌르다. 이 방향을 변경하지 않는 경우, 커버 유리를 제거하고 유충의 위치를 ​​조정한다. 유충은 몇 군데 준비가되어 있습니다. </li><li> 이미지 채널 / 거꾸로 현미경에 coverslip에. 직립 현미경 촬상 경우 단순히 채널 / 커버 슬립을 반전. </li></ol></li></ol> 행동 기록에 대한 관심 4. 측정 기능 <ol><li> 관심의 구조 (예, 꼬리, CNS)가 관심의 기능을 측정 (예 :시간이 지남에, 형광 강도, 위치). 참고 사항 : 머리와 꼬리 등의 구조는 수동으로 주석 할 수있다. 예를 들어, 헤드 어두운 H 형 입 고리를 함유하는 것으로 확인 될 수 있고, 꼬리 후방 spiricles 기관을 포함하는 것으로 식별 될 수있다. 이 논문은 신경 코드에 초점을 맞추고있다. 형광 중추 신경계 (CNS)를 레이블하는 UAS-MYR-GFP 유전자 (elav&gt; GFP) 9,10를 구동하기 위해 신경 GAL4 라인 elav-GAL4를 사용합니다. 중추 신경계는 후방 (그림 3) 확장 신경 코드에 부착이 앞쪽 뇌 로브가 포함되어 있습니다. </li><li> 각 시점 (t)에서의 신경 코드 (F (NC))의 화소 강도를 측정한다. 아래 수동 주석 방법을 설명하지만,이 공정은 자동화 될 수있다. <ol><li> &#39;분석&#39;메뉴에서 피지 (또는 유사한 소프트웨어)에서 평균 회색 값과 SLIC를보고 &quot;세트 측정 ...&quot;대화 상자를 사용하여전자 위치입니다. </li><li> 수동 동영상 (도 3)의 첫 번째 프레임에 신경 코드의 중앙에 박스를 그리는. 이 단계는 또한 이미지 분할 및 등록 알고리즘을 자동화 할 수 있습니다. </li><li> 관심의 박스 영역의 평균 픽셀 강도를보고 &#39;분석&#39;메뉴에있는 &quot;측정&quot;명령을 사용하십시오. 이것은 &quot;결과&quot;창을 생성합니다. </li><li> 다음 프레임에서, 수동 화살표 키를 사용하여 크기를 변경하지 않고 위치를 상자. 다시 &quot;측정&quot;명령을 사용하십시오. 업데이트 된 결과는 &quot;결과&quot;창에 표시됩니다. 관심의 각 프레임에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 파일 메뉴에서 상기 사용 &quot;결과&quot; &#39;다른 이름으로 저장 ...&#39;명령을 저장합니다. 결과는 .xls 파일로 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 5. 측정 분석 <ol><li> &lt;0과 1 (Z (t 사이의 값 (NC) 값)마다 F 정상화/ EM&gt;). <ol><li> 스프레드 시트 (또는 다른 프로그램)에서 Results.xls 파일을 엽니 다. 이 파일은 프레임 수와 평균 형광 강도를 나타내는 두 개의 열이있을 것이다. </li><li> 새 열을 확인하고 ([NC]를 F) 정규화 된 형광 값을 생성하는 식 Z (t) = F (NC [t])라는 우수한 성능을 나타내었다 (F [NC]) / 최대 (F [NC])라는 우수한 성능을 나타내었다를 사용 각 시점에 대응. </li></ol></li><li> 기록의 각 걸음의 보폭 기간을 결정합니다. 참고 : 보폭주기 앞으로에 대한 반복적 인 전신 운동의 단위이다 (그리고 역) 크롤링. 관례 등의 장 또는 CNS 1과 꼬리, 머리 및 기타 내부 장기의 전진과 함께 앞으로 보폭 시작 (및 종료). <ol><li> 수동으로 각 스트라이드의 개시 시간 (i)를 기록하는 행동을 조사하고 기록 (I (보폭 사이클 [N])). 참고 : 아래의 예에서, 전진중추 신경계의 스트라이드 사이클의 시작은 (도 3)으로 사용 하였다. </li><li> 각 보폭을 위해 기간 계산 : Δ의 t (보폭주기) = I (보폭주기 [N + 1]) -i (보폭주기 [N]). </li></ol></li><li> 기록의 각 시점에 대한 경과 스트라이드 사이클의 비율을 계산한다. <ol><li> 스트라이드 사이클 (c)의 개시부터 경과 시간을 나타내는 스프레드 시트 파일에 추가 열을 만든다. 설정 시간 각 걸음의 시작에서 0으로 보폭 개시 이후 (C (보폭주기 [N]) = 0). 이에 따라 개시 후 시간을 조정합니다. </li><li> . 경과 %의 보폭 사이클 (% 보폭 사이클) 경과 나타내는 스프레드 시트 파일에 추가 열을 확인 보폭 기간에 의해 조정 된 시간을 나누고 보폭주기의 비율로 변환 100을 곱 % 보폭주기 = (C (보폭주기 [N] )) / (Δ의 t (보폭주기) * 100). </li></ol></li></ol> 6. 극 크롤링주기에 걸쳐 관심의 구조 역학을 대표하는 플롯 좌표 생성 <ol><li> MATLAB에서, 업데이트 된 Results.xls을 가져 홈 탭의 &#39;데이터 가져 오기&#39;대화 상자를 사용합니다. </li><li> 확인 새로운 배열 &quot;시타&quot;를 포함 %의 보폭주기 값 (% 보폭주기). (VAR1는 % 보폭주기를 나타낸다 &quot;세타 = VAR1&quot;). </li><li> 새로운 배열 &quot;의 Rho는&quot;표준화 된 형광 값 (Z (t))를 포함합니다. (변수 2를 대입 할 때 변수가 Z (t을 나타냅니다 &quot;의 Rho = 변수 2를 대입 할 때 변수&quot;)). </li><li> 각도와 퍼센트 보폭주기 및 반경 ( &quot;polarplot (세타,의 Rho)&quot;)과 형광 극좌표 플롯을 만들기 위해 &#39;polarplot&#39;명령을 사용하십시오. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

미세 유체 장치는 초파리 유충을 수용 할 수있는 선형 아가로 오스 채널 (그림 1)을 만들기 위해 지어졌다. 초파리 애벌레 이러한 선형 아가로 오스 채널에 배치되면 자신의 행동 레퍼토리는 크롤링 사이클에 애벌레 구조의 역학에 대한 자세한 관찰을 허용하는 크롤링 제한됩니다. 유충 (그림 3) 리듬 발전의 시리즈를 수행 할 때 성공적인 녹화가 발생합니다. 이것이 발생하지 않는다면, 상기 채널에 기포 등의 장애물에 대해 확인하고, 유충의 상태를 확인한다. 성공적인 기록의 또 다른 중요한 요소는 유충 관심 구조를 시각화하기 위해 최적으로 배향되어 있다는 점이다. 유충의 방향이 올바르게되어 있지 않은 경우 유충이 채널에서 크롤링하는 경우 또는, 단순히 커버 슬립을 제거하고 유충을 다시 마운트합니다. 우리의 경험에 의하면, ~ 유충의 20 %는 초기에 수율이 우수한 행동 녹음을 장착 without 조정. 과거에는 측정이 그런 행동을 크롤링하는 동안 입 후크, 창자, 복부 세그먼트로 애벌레 구조의 위치의 촬영 하였다. 크롤링 스트라이드 사이클에 이들 구조의 운동을 가시화하기 위해, 극좌표 플롯을 생성 하였다. 본 논문에서는 신경 코드의 형광 강도를 측정하고, 극좌표 그래프는 크롤링 보폭주기 (그림 4)을 통해 형광의 역학을 시각화하는 데 사용됩니다. 극좌표 그래프의 데이터를 나타내는 몇 가지 장점이있다 : 그것은 변수 크롤링 속도 없어, 많은 동물 많은 진보의 데이터를 요약 할 수 있으며, 전체적인 경향 및 데이터 (11)의 변동 양자의 시각화를 허용한다. 특히, 이는 관심있는 형광 표지 된 구조의 역학을 측정 할 수있다. 원칙적으로, 이러한 분석은 탐색주기 동안 발생하는 동적 인 변화를 임의의 유형의 추적에 적용 가능하다. </P&gt; 이 문서에 설명 된 방법에 대한 응용 프로그램의 다양한 있습니다. 과거에는 선형 아가 채널은 전체 유기체 세그먼트 개별 근육 레벨 1 애벌레 행동을 기록하는 데 사용되어왔다. 이러한 데이터는 애벌레가 앞으로 모두에게 &quot;내장-pistoning&quot;메커니즘을 사용하여 크롤링 역 것으로 나타났다, 그들은 신경 근육 메커니즘은 앞으로 모두를 구동 1을 결정하는 크롤링 역있었습니다. 앞으로 연구팀은 서로 다른 유전 적 배경에 크롤링 공부 채널을 사용할 수 있습니다. 또한, 크롤 동안 칼슘 이미징을 사용 유생 뉴런의 활성을 분석하기 위해 채널을 사용하는 것이 가능해야한다. 이 신경 세포는 크롤링주기의 특정 움직임과 단계에서 발생하는 이해로 이어질 것이다. 마지막으로, 채널이 논문에서 제시 한 선형 디자인을 따라야합니다 이유가 없다; 서로 다른 크기와 채널을 사용하는 것은 의심의 여지 var에 대답 도움이되지 않습니다전체 초파리 애벌레 운동 및 모터 제어에 대한 질문에 iety.

이 방법의 전반적인 목표는 세부에서 초파리 애벌레 크롤링을 연구하는 것입니다. 운동 실험 개발 및 모터 제어 이론 2 테스트에서 중요한 역할을 해왔다. 전통적으로 운동은 수생 동물 (예를 들어, 거머리, 칠성 장어, 올챙이) 3에서 연구되어왔다. 이러한 동물의 운동의 반복적 인 특성은 운동 구동 생물 물리학 이벤트 분석 및 운동에 수반 신경 소성 패턴 모니터링, rhythmogenesis 연구 허용했다. 용이 한 유전 특성이 잘 개발, 제 1 및 제 2 령기에서 광학적으로 투명 인 몸 전체의 진행을 투과형 전자 현미경 재구성 : 운동의 연구 초파리 유충의 사용은 다른 모델 시스템에 비해 이점의 독특한 조합을 제공한다 신경계 4-6. 그러나, 초파리 애벌레로 코평면 오픈 표면에 운동은, 일시 정지를 포함하는 다소 복잡한 회전 및 사행 7을 크롤링합니다. 이 공보는 유충이 직선 리듬 크롤링 동작을 유지하도록 실시합니다 초파리 유충의 전위의 동작을 안내하는 리니어 아가 채널을 사용하는 방법을 제시한다. 대신 평면 오픈 표면에 행동, 아가로 오스 채널에서 초파리 유충의 행동을 연구, 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 연구자들은 특히 애벌레 행동 레퍼토리의 일부인 많은 운동에서 동작을 크롤링 선택할 수 있습니다. 둘째, 유충의 신체 크기에 비해, 채널의 폭을 조정함으로써, 기어 속도를 조정할 수있다. 셋째, 채널 유충 유충로드 및 상기 채널 내에서 배향되는 방식에 따라 지느러미, 복부 또는 측면으로부터 볼 수 있도록 허용한다. 관심의 구조를 크롤링하는 동안 지속적으로 표시하는 애벌레 방향이 다재 다능 한 수 있습니다. 네번째,채널 현미경 목적의 다양한 사용하기위한 의무이다. 예를 들어, 선형 채널 / 또는 스피닝 디스크 공 초점 현미경 (1)의 고해상도 영상 및 밝은 필드 stereoscopes에서 저해상도 영상에 사용될 수있다. 다섯째, 이러한 방법은 임의의 유전 적 배경 optogenetic / thermogenetic 신경 조작과 함께 사용될 수있다. 제 (제 1 및 제 2 령충에서) 애벌레의 몸과 아가로 오스 채널 모두 광학적으로 투명하기 때문에 유전자 인코딩 된 형광 프로브에 의해 표시 애벌레 구조의 형광 강도의 동적 움직임, 또는 변화를 연구 할 때 마지막으로, 채널을 사용할 수있다. 기재된 방법은 제 1 및 제 2 령 유충 초파리 동작의 상세한 학적 연구에 적합하다. 이 출판물은 채널의 사용을 설명하기위한 순방향 유생 크롤링 동안 CNS의 형광 강도의 동적 변화를 분석하여 전구체 NEU 할RONAL 칼슘 이미징.

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

초파리 애벌레 크롤링는 감각 운동 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델로 부상하고있다. , 일시 중지 전환 및 사행 : 그러나, 평면 오픈 표면에 애벌레 크롤링 동작을 포함하여 복잡하다. 운동의 레퍼토리에서 이러한 복잡성은 단일 크롤링 보폭주기 동안 발생하는 이벤트의 상세한 분석을 방해한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 선형 아가로 오스 채널은 직선, 유지, 리듬 크롤링에 애벌레 행동에 제약을가 하였다. 아가 채널 초파리 애벌레 본체 모두 광학적으로 투명하기 때문에 원리 적으로, 유전자 코드에 의해 표지 된 형광 프로브 유생 구조의 움직임을 그대로 자유롭게 움직이는 유충으로 모니터링 할 수있다. 과거에는, 유충은 선형 채널에 배치하고, 전체 유기체 세그먼트 레벨 크롤링 근육 1을 분석 하였다. 앞으로 채널에서 크롤 유충 신경을 모니터링 칼슘 이미징에 사용될 수최종 활동. 더욱이, 이러한 방법은 어떤 유전자형의 유충 및 연구원 설계된 채널로 사용될 수있다. 따라서 아래 제시된 프로토콜은 모터 제어를 이해하는 모델로서 초파리 유충을 사용하여 연구에 널리 적용 할 수있다.

이 문서를 이용하여 아가로 오스 채널 초파리 애벌레 동작을 안내하고, 탐색 사이클 동안 유생 구조 역학을 측정하는 방법을 설명한다. 선형 채널에서 애벌레는 리듬 크롤링 (그림 3)의 지속적인 관찰을 수행합니다. 애벌레와 채널 모두 광학적으로 투명하기 때문에, 채널이 유충이 관심있는 임의의 구조로 표현 된 형광 프로브를 발현에 사용될 수있다. 우리는 (elav-GAL4 / +, UAS - MYR - GFP / +) 모든 뉴런에 GFP를 표현 애벌레를 기록 크롤링 사이클에 신경 코드에서 형광 강도의 동적 변화를 모니터링. 우리는 CNS는 애벌레 머리와 꼬리 (그림 4A-B)로 앞으로 거의 같은 시간을 이동하는 것을 보여줍니다. 근육 수축의 물결이 본체 축 방향으로 통과 할 때, CNS가 이동하고 초점 평면으로부터 (도 4) 변화 신경 코드의 형광을하게한다. 찬 정량화하기<html> 여러 동물에서 여러 진보를위한 신경 코드 형광 강도 GES 우리는 극좌표 플롯 (도 4C) 상에 데이터를 표시. 극좌표 플롯의 데이터를 플로팅하면 보폭 사이클에 신경 코드 형광의 역학이 재현 패턴을 따르는 것을 알 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig1.jpg" /> 그림 1 : 선형 채널의 디자인은 초파리 애벌레 크롤링 동작을 안내하기 (A) 선형 아가로 오스 채널을 만들기 위해 사용되는 미세 유체 장치의 설계가 표시됩니다.. 이 장치의 채널 폭은 50 μm의 단위로 100 ~ 300 μm의 다릅니다. 깊이가 150㎛이다. (B) 초파리 유충은 아가 채널로 로딩된다. 지느러미보기는 오른쪽 전방 (헤드)로 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm의.4892 / 54892fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig2.jpg" /> 그림 2 :. 채널에 애벌레를로드하는 방식을 나타낸 다이어그램 자세한 내용은 프로토콜 부 (3)를 참조하십시오 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig3.jpg" /> 그림 3 :. 아가로 오스 채널에서에 배치 할 때 찬란 표지 초파리 유충이, 리듬, 선형 크롤링을 지속 무를은 (elav&gt; GFP)이 표시됩니다 모든 뉴런에 GFP를 표현하는 애벌레의 개략을 떠났습니다. 상자가 신경 코드의 형광 강도 (구별 영역을 보여주고 그연장 된 형태)를 측정 할 수있다. 오른쪽 일초 간격으로 채널을 통해 크롤 링 애벌레의 예입니다. 지느러미보기는 전방까지 함께 표시됩니다. 화살표는 걸음의 시작을 나타냅니다. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54892/54892fig4.jpg" /> 그림 4 : 크롤링주기 동안 신경 코드에서 형광 변화의 역 동성이 플롯 좌표 극에 발표된다 (A) 하나의 보폭의 다이어그램.. 백분율이 완료 보폭주기의 퍼센트를 참조하십시오. 꼬리 머리와 같은 CNS 내부 장기의 협약 전진함으로써 스트라이드 (스트라이드 또는 사이클 0 %)의 시작을 표시한다. 중추 신경계 (흰색)이 상하뿐만 아니라 앞뒤로 이동합니다. 측면은 경쟁w는 오른쪽 앞쪽으로 도시되어있다. (B)는 kymograph 머리, 꼬리 및 CNS의 이동을 나타낸다. 스트라이드 사이클 동안 신경 코드의 형광 강도가 동적 있습니다. (C)를 극좌표 플롯은 보폭 사이클에 신경 코드의 표준화 된 형광 강도의 역동적 인 변화를 보여줍니다. 각 점은 단일 시점 (N = 3 유충, 세 걸음마다)에서 하나의 유충의 정규화 된 형광 강도를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54892/54892fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

초파리 유충 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 이 책은 반복 크롤링 동작 중에 애벌레 구조의 역 동성을 정량화하는 선형 크롤링 및 방법의 지속적인 관찰을 유도하는 선형 아가로 오스 채널의 사용을 설명합니다.

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K 조회수.  University of Chicago.  초파리 유충 행동의 신경 제어를 연구하는 강력한 모델 시스템입니다. 이 책은 반복 크롤링 동작 중에 애벌레 구조의 역 동성을 정량화하는 선형 크롤링 및 방법의 지속적인 관찰을 유도하는 선형 아가로 오스 채널의 사용을 설명합니다. 

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

연구

생물학

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

생체공학

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

분석의 방법 Drosophila 행동

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

신경과학

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

행동분석학

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

대한 꼴 경로 길이 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 애벌레

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

자유롭게 걷는 파리 추적: 초파리의 이동을 평가하는 방법

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기

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Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용

분석의 방법 Drosophila 행동

의 애벌레 먹이 회로의 기능적 분석 초파리

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

초파리에서 운동 활동을 분석하는 간단한 기술

대한 꼴 경로 길이 프로토콜

초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적

초파리 애벌레 광택시 분석을 위한 빛 스팟 기반 분석

자유롭게 걷는 파리 추적: 초파리의 이동을 평가하는 방법