여기에 설명 된 호흡기 병원체 분석에 작품은 코넬 동물 건강 진단 센터 내부 개발 기금에 의해 지원되었다. 나노 PCR 워크 플로우 및 관련 품질 보증 시스템의 개발은 부분적으로 (FOA PA-13-244) 투자와 보조금 제 1U18FD005144-에서 식품의 약국 (FDA)의 수의학 연구소 조사 및 대응 네트워크 (FDA 수의사 LIRN)와 공동으로 수행 하였다 01. 발행 수수료 VWR과 콴타 바이오 사이언스가 후원했다. 우리는 쓰고 프로토콜을 검토 그들의 도움 가브리엘 Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina 카모, XiuLin 장, Jinzhi 유, Weihua 왕, 그리고 카트리나 워커 감사합니다. 우리는 저자 인터뷰 촬영을 위해 마이크 캐롤 감사합니다. 우리는 마침내 자신의 도움이 의견 에디터 세 익명의 피어 리뷰 감사합니다.

<ol>
	<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).</li><li>Bustin, S. 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마샤 슬레이터와 엘렌 Ortenberg이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 써모 피셔 사이언 티픽 Inc.의 직원입니다.

이 절차 여섯 개월 (주 2 ~ 3 회)의 과정을 통해 우리의 실험실에서 호흡기 병원체의 일상적인 테스트를 위해 사용되어왔다. 또한 별도로 정의 접시 분변 시료 및 박테리아 균주의 장내 병원균 프로파일과 동일한 방법을 사용하여 성공이 있었다. 플레이트가 생성되면, 경험이 풍부한 직원은 하나의 표준 근무 시간 내에 2-7 단계를 완료 할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 프리 앰프 플레이트의 적절한 시일 (증발을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다) 플레이트 사이 프리 앰프를 샘플들의 전송 및 증폭 판의 최종 덮고있다. 이 크게이 공정에 필요한 시간 및 서류의 양을 환산 결과 분석 (샘플 및 컨트롤 곡선을 확인)을위한 가이드로서 매크로 스프레드 시트의 사용은 중요 하였다. 제공되는 매크로 스프레드 시트는 예입니다; 서로 다른 구성으로 플레이트에 대한 수정 또는 재 작성 될 필요가있을 것이다. 이것은 쉽게 체육 될 수 있습니다기본 스프레드 시트 지식을 가진 사람이 rformed. 인해 증폭 판 (33 NL)에로드 시료의 미량으로 미리 증폭이 요구된다. 이 프로토콜 (미도시)의 최적화에서는 종래 증폭 마스터 믹스, 랜덤 프라이머의 첨가, 횟수, 소둔 시간, 희석 포함한 프리 앰프 파라미터의 개수를 비교 하였다. 각각의 목표는 자신의 최적의 조건을 가지고 있었고, 여기에 기술 된 우리의 패널에 대한 검색 전체의 최고 한도를 산출하는 사람들을 나타냅니다. 이 패널은 병원성 목표와 일상적인 의학적 진단 테스트에서 발생하는 샘플 종류의 넓은 범위를 커버하지만, 프리 앰프 절차에 대한 수정은 다른 패널 필요할 수 있습니다. 제조자 최적화 증폭 조건은 95 ° C에서 앤 변성이어서 95 ° C 효소 활성에서 10 분으로 표준 프로브 기반 실시간 PCR 프로토콜에 기초60 ° C에서 일링은 / 확장. 프라이머 및 프로브는 또한 미리 인쇄 제조업체 최적화 조건을 이용하여 적정하므로 필요하지 않은 판에있다. (상관없이 타겟의 종류) 모든 샘플에 대해 역전사 사전 증폭 단계를 결합함으로써 워크 플로우의 효율성을 유지하기 위해 필요했다. 모든 샘플은 전사 역 갖는 것은 또한 감도를 극대화하기위한 유용합니다. 또한 최소화 억제제에 최적화 된 프리 앰프를위한 마스터 믹스의 사용은 동일한 플레이트 상에 상이한 종류의 시료 조합에 다양성을 허용한다. 질병 통제 (CDC) 나노 리터 규모의 반응 여기 슈 등. (7)에 의해 기술 및 적응 인플루엔자 매트릭스 분석 센터는 범용 인플루엔자 인간과 반려 동물에서 테스트 샘플에 적합한 분석이다. 이것은 마이크로 리터 규모 REA을 사용하여 모든 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자의 범용 검출 설계된ctions. 그것은 CDC 인간 인플루엔자 바이러스 패널과 CDC 돼지 독감 패널의 일환으로 전 세계적으로 사용되어왔다. 여기에 적응 EHV-1 분석 8 낙태 및 신경 학적 질환 (Pusterla와 Hussey는 10 검토)를 일으킬 수 있습니다 말의 중요한 호흡기 병원체를 검출한다. 종 독립적 내부 제어와 높은 처리량 플랫폼 테스트를 적응의 의미는 그들이 OneHealth 감시 방법에 통합 될 수 있다는 것이다. 높은 처리량 테스트 플랫폼에서 이러한 분석을 모두 갖는 것은 임상 시설, 대피소 및 성능 이벤트에 대한 비상 대책을 촉진 할 것이다. 상기 결과는 분석 성능이 상당히 변화를 보였다 마이코 cynos 제외 가진 플레이트상의 모든 표적을 대표했다. 이는 이상적인 58-60 및되어야 프라이머 차선의 용융 온도 (T의 m)에 것 같았다# 176; C (이상적인 프로브 (Tm)가 68-70 °에 C)입니다. 이 플랫폼의 한계는 신속 시퀀스를 변경하는 능력을 제한 개별 프로브를 주문하는 것보다 판을 설계하고 제조하는 것이 더 오래 걸리는 점이다. 일반적으로 실시간 PCR의 다른 제한은 신규 한 또는 예기치 않은 병원체를 검출 할 수 없다는 것이다. 이것은 여러 종류의 서열과 일치 분석을 설계함으로써 어느 정도 극복 될 수 있지만, 편향 총 유전체 기반의 방법은 새로운 에이전트 발견 더 적합하다. 11,12 나노 실시간 PCR을위한 새로운 패러다임을 허용 증후군 기반의 높은 처리량 분자 진단 시약 및 노동 비용을 절감하는 데 유용 종 기반의 테스트보다는. 이 방법에 의하여 대형 패널 테스트는 던 및 Gurfield 13 Moutailler 외. (14)에 의해 기재된 것과 같은 OneHealth 감시 활동을 용이하게 할 수있다. 초기 면봉 샘플 수집,일반적으로 임상 발병 3 일 이내에, 호흡기 병원체의 존재를 확인하는 가장 좋은 기회를 제공합니다. 감염증 출현은 종종 예측 불가능하고, 시약의 변형 없이도 다른 종에 대해 수행 할 수있는 테스트가 준비 이상적이다. 이 기술의 미래 애플리케이션 pathotyping, 항생제 내성 프로파일 및 상기 신드롬 - 기반의 임상 진단 패널에있을 가능성이 높다. 나노 실시간 PCR 여러 샘플 병원체 유형의 신속한 고 처리량 스크리닝에 가장 유용하고 새로운 긴급 병원체를 식별하기위한 바이어스 또는 부분적으로 바이어스 시퀀싱 기반 접근법에 의해 보완 될 것이다.

하나의 질병에 대한 테스트중인 샘플의 많은 사용하지 않는 인간과 동물에 대한 임상 적 진단에 여러 에이전트의 신속하고 포괄적 인 검출을위한 수요, 병원균 검출을위한 단일 생물 분자 진단 방법은 부담이다. 수의학 맥락에서 높은 처리량 진단 방법으로 인해 종의 다양한 병원체를 덮는 추가의 필요에 특히 중요하다. 세균의 수를 포함하는 테스트 요구의 예는 OneHealth 식중독 질환의 관리 및 신흥 병원체 감시 접근 바이러스 (DNA 또는 RNA가 기준), 기생충, 진균. 테스트 효율을 향상시키기 위해 함께 여러 분석 (다중화)에 대한 시험을 조합하는 과제는 감도의 가능한 손실 최적화 분석법 검증 큰 부담이다. 나노 리터 규모 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 바꾼다 인많은 별도의 반응이 동일한 샘플 (1)에서 동시에 실행할 수있는 다중의 연습 네이티브. OpenArray 플랫폼은이 원리 (2)의 응용 프로그램입니다; 이는 실시간 PCR과 마이크로 어레이 기술을 결합한다. 공간 다중화의 개념에 기초하여, 모든 샘플은 관통 구멍에 분리 대상의 다수를 위해 테스트된다. 이 플랫폼은 초기에 시아닌 기반의 이중 가닥 DNA 결합 화학 2와 함께 사용과 어두운 담금질 프로브 (3)를 사용하여 프로브 기반 화학에 대해 사용할 수 있습니다했다. 이 플랫폼은 주로 인간과 동물 사 (5)에 유전 적 프로파일을 위해 사용되어왔다. 이는 최근 Grigorenko 동부 등에 의해 혈액 유래 DNA 및 RNA 병원체를 검출하도록 하였다. (6) 두 단계 역전사 / 프리 앰프 (프리 앰프) 절차를 사용. 우리는 호흡기 병원체 초에서 두 종류의 검출 여기 원스텝 프리 앰프 기반 절차를 설명retions 및 표준 근무 전적으로 수행 될 수있는 다른 종류의 시료 다양한. 한 단계의 프리 앰프가 완료되면, 샘플이 나노 PCR 플랫폼과 함께 제공되는 자동화 된 액체 처리 시스템에서 허용하는 형식입니다 384 웰 플레이트로 전송됩니다. 이 시스템은 한 번에 최대 4 판 (192 샘플 및 제어)의 표면에 걸쳐 마스터 믹스 및 샘플을 그린다. 이로드 프로세스에 따라, 우리는 샘플을 증폭 한 인쇄 된 페이지에 맞는 테이블에 각 샘플 / 대상 조합에 대한 3 기술 복제의 평균을 요약하는 매크로 스프레드 시트를 사용하여 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 이 플랫폼을 사용하여 시료에서 추출한 DNA 및 / 또는 RNA를 분석하는 균일 한 방법이 설립되었다. 샘플의 다양한 추출 역전사 및 오류의 가능성을 최소화하는 96 웰 형식으로는 예비 증폭 하였다. 테스트 호흡 샘플은 비강 면봉, 깊은 인두 면봉을 포함,트랜스 기관 세척, 기관지 세척 및 폐 조직. 또한 말초 혈액 또는 배설물에 존재할 수있는 테스트 에이전트의 일부 있기 때문에, 우리는 절차에 샘플의 그 유형을 통합. 이 간소화 된 워크 플로우는 개별 테스트 대신에 패널 기반의 병원체 및 독소 유전자 검출을 통해 효율적인 테스트를 가능하게함으로써 여러 판에서 실험을 실행에 비해 시간과 자원을 절약 할 수 있습니다. 여기에 입증 호흡 패널 (18) 분석은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 구멍을 통해 세중 인쇄했다. 검출 된 말 병원균 말 아데노 바이러스 1 및 2, 말 동맥염 바이러스, 말 비염 바이러스 A 및 B, 말 헤르페스 바이러스 (EHV) 유형 1 (4), 스트렙토 동등 포함. 송곳니 병원체는 개 호흡기 코로나 바이러스 (betacoronavirus), 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노 바이러스, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 보르 데 텔라 브론 키셉 및 마이코 플라즈마 cynos 포함되어 있습니다. 에이범용 인플루엔자는 분석과 내부 통제 (MS2의 RNA 파지)도 포함되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:227px;">Zap-OGlobin II lytic reagent</td>
			<td style="width:239px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">7546138</td>
			<td style="width:167px;">Optional reagent for preparing blood samples.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:227px;">Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">AM1840</td>
			<td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix )</td>
			<td style="width:239px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">95134-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gene-specific primer pool</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom order</td>
			<td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">Random primer mix</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1330S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:227px;">Standard 96-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:227px;">Amplification master mix (OpenArray master mix)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4462164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Clear adhesive seal</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">430611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Foil seal</td>
			<td style="width:239px;">Excel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">384-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4406947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4470813</td>
			<td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:30px;width:227px;">Accessories kit</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4469576</td>
			<td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">AccuFill tips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4471090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457243</td>
			<td>This is purchased with the amplification machine.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:227px;">Primer design software (Primer Express)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4363991</td>
			<td>See manufacturer&#39;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:227px;">Image analysis program (ImageJ)</td>
			<td style="width:239px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spreadsheet program (Excel)</td>
			<td style="width:239px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PCR plate spinner</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89184-608</td>
			<td>This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">TE buffer</td>
			<td style="width:239px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8890-100ML</td>
			<td>10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DMEM</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tissue disruptor (TissueLyser II)</td>
			<td style="width:239px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Conventional thermal cycler (Veriti)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

나노 리터 규모의 실시간 PCR 분석은 여러 서로 반응을 조합의 전형적인 결점없이 단판에 병렬로 실행할 수 있도록하기 위해 공간 다중화를 사용한다. 우리가 고안 빠르게 급성 호흡기 질환 개와 말 일반적인 질병 인자의 존재를 식별하기 위해 본 원리에 기초 패널을 평가 하였다. 이 원고는 마이크로 리터 규모의 반응과 다른 절차에 초점을 맞추고, 샘플 준비, 증폭, 및 목표 병원체 서열 분석을위한 나노 진단 PCR 워크 플로우를 설명합니다. 제시된 호흡 패널에서 18 분석법은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 세중 년에 설립되었다. 범용 추출 사전 증폭 플로 여러 매트릭스 및 DNA 및 RNA 기반 병원균을 수용하도록 높은 처리량 샘플 제제에 대해 최적화되었다. 대표적인 데이터는 하나의 RNA 대상 (인플루엔자 A 행렬)와 하나의 DNA 대상 (말 헤르페스 바이러스에 대해 제시1). 신속하고 정확하게 병원균의 포괄적 증후군 기반 그룹을 테스트 할 수있는 능력은 효율성과 진단 테스트의 능률을 향상 급성 호흡기 질환의 진단과 관리를위한 유용한 도구입니다.

결과는 양성 대조군 및 일상적인 진단 시험에 제출 된 임상 샘플의 조합으로 대표 RNA 분석 (인플루엔자 매트릭스) 및 DNA 분석 (EHV-1)에 대한도 1 및도 2에 나타내었다. 이 일반적인 반응에 걸쳐 방출 된 형광 신호는 사이클 당 원료 형광 값을 나타내는도 1에 도시된다. 모든 상대 사이클 역치 (CT)의 값을 자동 증폭 시스템 소프트웨어에 의해 생성되었다. 배경 형광이 코네티컷 값을 계산하기 전에 형광 측정으로 통합보다는 적재 품질 평가를위한 별도의 측정을 사용한다. 각 대상에 대한 탐지의 분석 한계 (LOD)를 계산 컨트롤 풀에있는 코네티컷의 95 % 검출 레벨의 값을 더한 2 표준 편차의 전체 평균에 기반모든 대상. 복제의 적어도 95 %는 대표적인 분석법 양성인 최고 희석액 50 복제본이었다; 5 사본의 검출은 복제의 50 %에 성공했다. 어느 분석은 아래의 사본에서 검출되었다. RNA의 및 DNA 분석을위한 LOD를은 21.92과 20.05의 코네티컷의 값으로 계산 하였다. 이러한 값은 용의자 대 포지티브 (잠재적되지 반복)을보고 값에 대한 컷오프로 간주 하였다. 타겟의 분석 성능의 다른 측면은 세 가지 일 (도 2)에서 실행 풀링 양성 대조군의 희석액을 사용하여 평가 하였다. 대표 RNA 및 DNA 분석의 평균 효율은 101.1 %와 106.6 %였다; 모든 대상에 대한 전체 평균 효율은 101.3 %였다. 분석법도 좋은 선형성 (&gt; 0.98 R 2)를 가지고 있었다. 복제 내에서 변화는 관통 구멍 일반적으로 모두 임상 샘플 0.2의 표준 편차 내에하던D 제어합니다. 타겟 중간에 교차 반응은 관찰되지 않았다. 보조 파일의 최종 결과 워크 시트 (10) 임상 진단 샘플과 4 컨트롤의 대표 양적 결과를 보여줍니다. 임상 샘플은 샘플의 종류의 서브 세트는 통상적으로 비강 / 인두 면봉, 폐 조직, 분변 시료를 포함한 시험된다. 이 세트의 한 (말) 분변 샘플은 샘플 억제제의 존재를 나타내는 실패 MS2 내부 통제를 보여줍니다. 이것은 일반적으로 용출 샘플 및 / 또는 재 추출의 희석에 의해 관리됩니다. 여기의 경우와 같이, 음의 증폭 제어를 모든 타겟 제외해야하며, 음의 추출 제어는 내부 제어를 포함한다. 임상 설정에서, 샘플 betacoronavirus, 보르 데 텔라 브론 키셉, 개 디스템퍼 바이러스 A, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 인플루엔자에 대한 코네티컷 값을 생성에이. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 도 1 증폭 플롯. 형광 표시는 RNA 분석 (A) 및 DNA 분석 (B)에 대한 증폭 사이클에 대해 도시된다. 삼각형이 코네티컷 값을 나타내는 표시됩니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 그림 2. 표준 곡선. 세 가지 다른 일 테스트에서 RNA 및 DNA 분석에서 표준 곡선은 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 증폭의 선형성과 범위를 설명하기 위해 그려진다. 사이클 임계 값 (CT) 값 RNA (A) 또는 DNA의 카피 수의 로그 (10) (에 대해 플롯 <strong&gt; B) 표준입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 증폭 플레이트와 타겟 위치 표 1. 회로도.이 플랫폼 나노 실시간 PCR 시험에 사용되는 판은 현미경 슬라이드 크기 및 관통 구멍 3,072 개의 관통 구멍 (64)의 48 개의 서브 어레이로 배열되고 개별 반응합니다. 한 부분 배열은 세중의 18 목표로, 여기에 표시됩니다. 각 샘플은 액체 핸들러에 의해 하나의 부분 배열에 추가됩니다. 플레이트 표면 장력을 통해 관통 구멍의 시약을 보유하는 친수성 및 소수성 화합물로 코팅된다. 스테인레스 칩 &quot;은 포토 리소그래피 패터닝되고 3072 마이크로 머신, 320 μm의 diamete의 직선 어레이를 형성하기 위해 습식 에칭. 다음과 같이 연구 대상 33 NL 각각 &quot;2 약어의 구멍은 : BCOR, 송곳니 호흡기 코로나 (betacoronavirus) BORD, 보르 데 텔라 브론 키셉 CAV, 개 아데노 바이러스를, CPIV, 개 파라 인플루엔자 바이러스, CPNV, 개 pneumovirus, DISTA / B, 송곳니 디스템퍼 바이러스 A와 B, EADV1 / 2, 말 아데노 바이러스 2, EAV, 말 동맥염 바이러스, EHV1 / 4, 말 헤르페스 바이러스 유형 1/4, ERVA / B, 말 비염 바이러스 A / B, IVM, 인플루엔자 매트릭스; MCYNOS, 마이코 플라즈마 cynos, MS2, 내부 통제 (MS2의 RNA 파지) SEQU, 연쇄상 구균 동등. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 표 2 플레이트 전사지도. 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에서 프리 앰프에 전송하는 고정 8- 채널 피펫을 사용하는 컬러 코딩 된 전사 플레이트 맵이 도시되어있다. 대안으로, 조정 가능한 피펫이 사용될 수있다. 동일한 절차가 시간에 관계없이 매번 수행<html> 유동 많은 샘플 플레이트에 있습니다. <img alt="추가 파일" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 추가 파일. 요약 테이블에 서식 결과 두 매크로가 포함 된 매크로 사용 스프레드 시트 파일 (프로토콜에 설명 된대로) 제공됩니다. 매크로에 의해 생성되는 전형적인 결과 테이블 (최종 결과 아래) 파일에 포함된다. 두 매크로는 샘플 이름을 첫 번째 열의 (48 샘플까지)과 긍정적 인 결과에 그들을위한 각 대상에 대한 세 가지 코네티컷 값의 평균을 작성합니다; 증폭하지 않았다 대상이 테이블에 빈 표시 있습니다. 이것은 쉽게 종이 한 장에 인쇄하고 효율적 원시 데이터를 확인하기위한 기준으로 사용될 수있다. 최종 결과 탭에서 10 임상 샘플 및 4 컨트롤에 대한 대표적인 결과가 표시됩니다. 분석 이름에 대한 요약은 표 1의 전설에 나열되어 있습니다.www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K 조회수.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center.  나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

연구

면역학 및 감염병학

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

카테고리의 감지 세균성 병원균에 대한 &#39;발광 생물&#39;리포터 파지

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

일반 CNS의 실시간 PCR에 의한과 Neuroinflammation 동안 Microglia에 MicroRNAs의 탐지

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

의 유전자형<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt;에 의해 리보솜 스페이서 PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

포르말린 고정 조직에서 리사바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 시험

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...