This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.

주 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 비 - 변성 PAGE 프로토콜 (12)에 기초한다. 이 연구에서, MXA 단백질 올리고머 상태 내인성 MXA 표현 MXA 과발현 베로 세포 또는 IFN-α 자극 A549 세포를 사용하여 평가 하였다. 후술되는 프로토콜 MXA 이외에 어떤 단백질 올리고머 상태를 분석하는데 사용될 수있다. 그러나, 더 최적화가 필요할 수 있습니다. 비 변성 페이지에 대한 세포 용 해물 1. 준비 주 : 하나 또는 베로 A549 세포에서 인간 MXA 단백질 올리고머 상태를 분석하기 위해, 1.0 × 106 세포를 수확 하였다. 세포 유형 또는 분석하는 단백질 풍부에 따라, 세포 수를 조정해야한다. 이는 곧 감광 요오도 아세트 아미드를 첨가 한, 노광에서 용해 완충액을 보호하는 것이 중요하다. <ol><li> 잘 당 종자 0.3 × 10 6 A549 또는 베로 세포에서6 잘 요리한다. 웰 당 2 ml의 성장 배지에서 세포를 유지하고 (표 1 참조). 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2). </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS) 1 ㎖로 세척하여 세포를 수확하고, 0.5 ml의 0.25 % 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 실온에서 약 5 분 동안 1X 용액을 첨가하여 분리. </li><li> 즉시 세포가 접시에서 분리로, 0.5 ml의 성장 매체를 추가하고 조심스럽게 피펫 팅 아래로 섞는다. </li><li> 잘 한 2 ML 튜브에 각각의 세포를 전송하고 테이블 톱 원심 분리기 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분)를 사용하여 펠렛. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 상층 액을 제거합니다. </li><li> 심하게 상하 세포 현탁액을 피펫 팅에 의해 1 ml의 빙냉 PBS로 세포를 세척 하였다. </li><li> 테이블 위에 원심 분리기에서 펠렛 세포 (5,000 XG, 4 ° C, 5 분). </li><li> 조심스럽게 위스콘신 피펫 팅하여 상층 액을 제거세포 펠렛을 분리 사전 통 보없이. </li><li> 로 pipetting 아래 얼음에 넣어 200 ㎕의 빙냉 용해 완충액 (표 1 참조)에 재현 탁 된 세포. </li><li> 즉시 주석 호일을 사용하여 얼음에 30 분 동안 품어 튜브를 덮어 빛 해물를 보호합니다. 참고 : 무료 티올 그룹의 보호를 되돌릴 수 있기 때문에 얼음에 30 분 동안 배양 한 후에는 더 이상 빛에 노출에서 해물을 보호하기 위해 필수적이다. </li><li> 미리 냉장 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 원심 분리 단계에서 20 분 동안 4 ℃에서 냉각 실의 투석 완충액 (표 1)에서 투석 열 평형. 10,000 잘라 분자량 열을 사용합니다. <ol><li> 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼 가득 비커에 넣어. 부드러운 교반을 보장하기 위해, 자석 교반기를 사용합니다. 멤브레인을 만지지 마십시오. 참고 : Dialys열은 구입 또는 FIALA 및 동료 (19)에 의해 기술 된 프로토콜에 따라 1.5 ml의 튜브로부터 제조 될 수있다. </li></ol></li><li> 투석 버퍼와 플로트 부표에서 열을 제거합니다. 멤브레인을 건드리지 않고 피펫 팅에 의해 제조 된 투석 열로 삭제 해물을 전송합니다. 플로트 부표에 열을 연결하고 투석 버퍼로 가득 비커에 다시 넣어. </li><li> 신중 자기 교반기를 사용하여 교반하면서 4 ℃에서 적어도 4 시간 (바람직 밤새) 미국 빙냉 투석 완충액 (표 1)을 함유하는 비이커에 해물을 투석. 200 μl의 용 해물 적어도 100 ㎖ 투석 버퍼를 사용합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 투석 샘플을 전송합니다. 테이블 탑 원심 분리기 (13,000 XG, 4 ° C, 20 분)에서 원심 분리하여 침전물을 제거합니다. 단지 바로 투석 후 프로토콜 (섹션 2) 계속 올리고머 단백질의 분해를 방지합니다. 냉동하지 마십시오준비된 해물. </li></ol> 2. 전기 영동 참고 : 일부 수정 (22) 전술 한 바와 같이 전기 영동을 실시 하였다. 후술 프로토콜, 프리 캐스트 구배 겔 (4 % -15 % 구배)을 사용 하였다. 대안 적으로, 겔은 실험실에서 제조 될 수있다. 이는 SDS는 올리고머 단백질 복합체의 해리를 방지하는 등의 임의의 변성제를 배제하는 것은 매우 중요하다. 전기 영동시 인간 MXA 단백질의 상이한 올리고머 상태에 대해 최적화되었다. 그러나, 올리고머 복합체의 크기뿐만 아니라 복잡한 분석을 달성 할 것으로 예상되는 분리의 범위에 따라, 다른 단백질에 대해 변할 수있다. 따라서, 전기의 최적 시간은 경험적으로 결정되어야한다. 올리고머의 최적 해상도를 분석하기 위해서는 전류가 25mA를 초과 할 수 없습니다. <ol><li> 겔 챔버 내의 비 - 변성 PAGE 겔을 조립한다. t 채우기미리 냉각 주행 완충액 (표 1)와 그 내부 및 외부 챔버. </li><li> 4 ℃에서 추운 방에서 15 분 동안 젤 당 25mA에서 미리 냉장 실행 버퍼 젤을 미리 실행합니다. </li><li> 4X 샘플 버퍼 5 μl를 (표 1)를 상기 제조 된 용 해물 15 μL를 혼합한다. 샘플을 끓여하지 마십시오. </li><li> 15 샘플의 μL 겔에 선택의 천연 단백질 표준을 넣습니다. 4 ℃에서 추운 방에서 4 시간 동안 25mA에서 젤을 실행합니다. 주 : 반 정량 분석을 위해, 단백질 정량화 프로토콜 (예를 Bradford 단백질 분석 23) 레인 당 총 단백질의 동일한 양의 부하를 보장하기 위해 수행 될 수있다. </li></ol> 3. 서양 얼룩 참고 : 아래 설명은 젖은 웨스턴 블롯 시스템의 프로토콜입니다. 상관 블 롯팅 막을 사용할 수있다. 버피 블 롯팅으로 평형화 전에 100 % 메탄올, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인 활성화FER. 반 건조 웨스턴 블랏 기술은 대안 적으로 사용될 수 있지만, 큰 올리고머 성 복합체에 대해 최적화되어야한다. <ol><li> 젤을 분해 조심스럽게 SDS 버퍼 (표 1)로 전송합니다. </li><li> 부드럽게 진탕하면서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> 이 스폰지 4 셀룰로오스 필터 종이 시트 당 겔 블롯 막을 제조. 버퍼 (표 1) 모래 바닥에서 그들을 만끽 해보세요. </li><li> 한 스폰지,이 셀룰로스 여과지 시트, 막, 겔,이 셀룰로오스 필터 종이 시트 일 스폰지 (상하로)를 다음과 같이 샌드위치를 ​​조립한다. </li><li> 블로 팅 탱크에 샌드위치를 ​​넣습니다. 젤은 마이너스 극에 직면하면서 막 플러스 극에 직면 해 있는지 확인합니다. </li><li> 사전 냉장 블로 팅 버퍼로 블로 팅 탱크를 채우십시오. </li><li> 최고의 단백질 전송 결과를 4 ℃에서 하룻밤 90mA에서시킨다. </li><li> 샌드위치를 ​​분해 Ponc의 막을 배양함으로써 단백질 표준을 시각화실온에서 5 분 동안 오 S 용액. </li><li> 명확 단백질 표준의 밴드를 볼 수있을 때까지 조심스럽게 탈 이온수 폰소 s를 세정 막 Destain. </li><li> 펜을 사용하여 단백질 표준의 밴드를 표시한다. 참고 : 잔류 폰소 s는 면역 염색을 방해 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 상기 멤브레인은 탈 이온수로 1 분 이후의 세정에 0.1 M NaOH로 인큐베이션하여 상기 탈색 될 수있다. </li><li> 버퍼 블로킹 멤브레인을 차단하고 실온에서 적어도 1 시간 또는 밤새 39 ° C에 대해 (표 1 참조). </li><li> 분석하고자하는 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 염색으로 관심 단백질 (들)을 가시화. 주 : 완충액 (표 1)은 블록 1000 : 인간 MXA 단백질이 인간 MX1 특정 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 시각화 하였다 (1) 희석 하였다. 항체 용액을 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 대안 적으로, 단일 클론NTI-MXA 항체 (클론 143) (24) (데이터는 도시하지 않음)이 사용될 수있다. </li></ol>

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H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection.">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에서 우리는 웨스턴 블롯 분석 한 다음 비 변성 PAGE에 의해 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 빠른 결정을 할 수있는 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 중요한 이점은 주어진 단백질의 올리고머 상태 전에 단백질 정제없이 전체 세포 용 해물로부터 결정될 수 있다는 것이다. 이 올리고머 또는 보조 요인과 관련하여 그 기능을 발휘 단백질 중요 할 수있다. 또한, 단백질은 천연 상태로되어 있고, 상기 겔로부터 추출하는 경우, 효소 활성 또는 다른 단백질의 기능을 결정 올리고머 상태로 상관 될 수있다. 이 프로토콜의 중요한 측면은 샘플 준비하는 동안 세제의 선택입니다. 이것은 세포막과 관련된 단백질 특히 중요하다. MXA 주로 평활 소포체 (25)의 막과 연관되는 것으로 보인다 </suP&gt;. 세포 용해를 들어, 비이 온성 세제는 NP40 MXA의 석출을 방지하는 최적이었다. 이전 19 바와 같이 버퍼 교환 및 투석에 의해 용 해물의 저분자 불순물을 제거한 후, 0.1 % (3)의 존재 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 술포 네이트 (CHAPS) 겔 중에 MXA의 침전을 방지하기 위해 필요했다 전기. E. 표현 MXA 정제 된 재조합 단백질과 결정된 또한, CHAPS는 MXA의 효소 활성을 방해하지 대장균 12. 이 세정제는 단백질의 변성 또는 분해시 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하지 않는 매우 중요하다. 이러한 NP40, Octoxinol 9 같은 비 변성 세제, 디기 토닌과 CHAPS는 가용화에 적합하다. 세제 및 농도의 선택은 경험적으로 결정되어야한다. 세제는 세제 있어야 특정 분석에 대한 실험 예 하류에 영향을 미칠 수제거 쉽게 투석에 의해 CHAPS 달성,하지만 Octoxinol 9 (26)된다. 전술 한 방법은, 비 - 변성 조건하에 세포 용 해물로부터 유래 된 단백질을 분석하기 때문에, 종래에는 단백질 정제는 필요하지 않다. 재조합 단백질의 정제는 종종 응집 침전에서 단백질을 방지하기 위해 높은 염 및 다른 첨가제의 첨가에 의해 완충 최적화를 요구하기 때문에 이점이있다. 그러나 이러한 첨가제 및 높은 소금 농도는 반드시 자연 상태와 유사하지 않을 수 있습니다 단백질의 올리고머에 영향을 미칠 수 있습니다. 특히 인간 MXA 단백질의 경우에는, 염 농도 및 뉴클레오티드의 존재는 더 높은 올리고머 상태 (27)의 형성에 중요한 역할을한다. 셀룰러 안정화 요소가 여전히 존재하기 때문에 세포 용 해물에서의 단백질이 더욱 쉽게 안정된다. 그러므로 PR을 분석 할 수있다더 많은 세포 생리 학적 조건에서 otein 단지 (예를 들어 생리 소금 농도, pH를). 다른 단백질은 구조적으로 관련 MXB 또는 dynamin 8 예를 들어, 올리고머를 형성하기 위해이 프로토콜은 또한 적용되어야한다. 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 용해 (도 1) 중 세포질 단백질의 인공 디설파이드 브릿지의 형성을 방지하기 위해 유리 티올 기의 보호이다. 초기 실험은 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT) 또는 β-mercaptethanol 첨가 샘플 제조 동안 인공 이황화 결합의 형성을 방지하기에 충분하지 않은 것으로 나타났다. 두 환원제 디설파이드 브릿지를 형성하는 가역적 티올기를 보호한다. 이 가역적 보호가 영구적으로 모든 티올 그룹을 보호하기에 충분하지 않을 수 있습니다. MXA 단백질의 경우, 이는 단백질의 비가역적인 응집을 이끈다. 그러나, 요오도 아세트 아미드를 첨가 irrevers 그DTT로 처리 해물로부터 MXA에 비해 ibly 시스테인 크게 감소 더욱이 MXA 단백질의 응집, MXA 포유류 발현 세포로부터 제조 해물의 요오도 아세트 아미드 치료 면역 MXA의는 GTPase 활성에 영향이 없었다의 자유 티올기를 보호 (데이터 미도 ). 올리고머의 protomers 수의 정확한 결정을 위해 다른 중요한 고려 사항은 폴리 아크릴 아마이드 농도 범위의 선택뿐만 아니라, 단백질의 분자량을 참조한다. 폴리 아크릴 아미드의 농도 범위는 제 올리고머의 예상 분자 질량에서의 주파수 대역의 최대 분리를 허용하도록 설정되어야한다. 비 변성 PAGE는 SDS가 포함되어 있지 않습니다. , SDS 전하, 분자량 및 단백질의 형상을 결여하면 그 전기 영동 이동성을 결정한다. 따라서, 단백질 분자량 마커의 선택은 매우 중요하다. 이상적으로는, 분자량 참조 AR 것알려진 올리고머 상태와 관심의 단백질의 ecombinant 정제 형태. 이것이 항상 가능하지 않기 때문에, 비 변성 또는 천연 단백질 마커를 사용한다. MXA는 UAP56 또는 Thogotovirus의 바이러스 nucleoproteins 같은 다른 세포 단백질과 연결하는 것으로되어 있기 때문에, 라크로스 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 12,28-30, 우리는 또한-별도의 공동 것이라고 핵 단백질을 UAP56 여부를 특정 항체를 사용하거나 인플루엔자 면역 염색에 의해 테스트 비 변성 PA 젤에 MXA와. 그러나 우리는 MXA의 헤테로 올리고머의 형성에 대한 증거를 찾을 수 없습니다. 이것은 아마도 MXA-UAP56 및 MXA - 핵 단백질 상호 작용이 낮은 친 화성 (12, 24)의 사실이다. 또한, UAP56 또는 바이러스 nucleoproteins와 관련 MXA 단백질의 비율이 방법에 의해 감지하기가 매우 낮은 때문에 어려울 수 있습니다. 또한, 고려 단백질의 pKa가 분석되도록하는 것이 중요하다. 설명 비 denat에서uring 페이지 프로토콜은, 단백질은 pH가 8.3에서 전기 영동에 의해 분리된다. 대부분의 단백질은 음이 pH에서 청구됩니다. 그러나 기본 단백질은 pH가 8.3에서 순 전하를 나타내고, 따라서 반대 방향으로 실행됩니다. 염기성 단백질의 분석은 단백질의 전체 음전하를 위해 주행 완충액의 pH를 조정하기 위해 그 결과, 이것은 중요하다. 종합하면, 우리는 사전 정제없이 여기 포유 동물 세포에서 발현 된 단백질의 올리고머 상태의 신속한 평가를위한 프로토콜을 제시한다.

단백질의 구조는 많은 급 세포 과정에서 중요한 역할을한다. 신호 전달 경로, 유전자 발현, 효소의 활성화 / 비활성화는 모두 단백질 복합체 1-4의 적절한 조립에 의존한다. 또한, 단일 - 또는 헤테로 올리고머라고도이 프로세스는 공유 비가역 또는 가역 정전 소수성 단백질 - 단백질 상호 작용에 기인한다. 올리고머는 게놈 크기를 증가시키지 않고 상이한 세포 과정을 다양 화하지만, 단백질 변성, 열화 (5)을 향해 더 내성 안정한 착물을 구축에도 전략을 제공 아닙니다. 올리고머에 결함이 단백질의 기능에 영향을 미치는 질병의 개발로 이어질 수있다. 예를 들어, 효소 페닐알라닌 수산화이 량체 복합체를 형성한다. 단백질 단지 내 일부 돌연변이는 사량 형성을 약화시키고 질병 페닐 케톤뇨증 (6)으로 이어질 수 있습니다. 7을 유도 된 인터페론 (IFN)입니다. 그것은 dynamin 같은 대형 GTP 아제의 슈퍼 패밀리에 속한다 체외 8 큰 올리고머 구조를 형성 할 수있는 능력을 갖는다. 올리고머는 급속한 저하 9,10에서 MXA을 보호하기 위해 제안되었다. 많은 연구 그룹에 의해 집중적 노력에도 불구하고, 액션의 분자 메커니즘은 크게 어려운 유지 및 바이러스 기능 MXA의 올리고머 화 상태의 역할은 논쟁 9,11,12 중이다. 이와 관련하여, 가오와 동료 MXA 큰 링형 올리고머 구조 (11)의 형태 nucleoproteins 바이러스와의 상호 작용에 의해 항 바이러스 활성을 발휘하는 모델을 제안 하였다. 그러나,보다 최근에는 MXA 이량 체는 항 바이러스 활성을 나타내는 인플루엔자 바이러스 (12)의 핵 단백질과 상호 작용하는 것을 보여 주었다. 비MXA의 결정 구조에 ased 가오 동료는 시험 관내에서의 올리고머 및 바이러스 11,13 기능에 중요한 인터페이스 영역의 몇 아미노산 잔기를 확인 하였다. 따라서, 항 바이러스 활성을 나타낸다 MXA의 올리고머있는 상태 규명하기 위해, 우리는 급속 내인성 MXA는 IFNα 자극 후 발현뿐만 아니라 인간 세포에서 발현 MXA 인터페이스 돌연변이 oligmeric 상태를 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설정하기 위해 노력했다. 일반적으로 이러한 분할 녹색 형광 단백질과 같은 단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용되는 많은 방법이 있지만 (분할-GFP) 상보성 분석 (14), 표면 플라스 몬 공명 (15) 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) (16)들은 제공하지 올리고머 단백질 복합체의 정확한 화학 양론의 정보를 제공합니다. 이 특정 측면의 조사, 기술 등멀티 앵글 광 산란 (MALS) 17 및 분석 초 원심 (18)는 매우 유용합니다. 일반적으로 이러한 방법을 사용하여 분석 한 단백질은 정제 된 단백질이다. 올리고머 화 공정은 또한 다른 세포 인자에 의존 할 수있다. 이러한 요인을 알 수있는 경우, 분석은 더욱 곤란하다. 또한, 일부 단백질은 E.에서 표현하기 어려운 대장균 및 정화. 따라서,이 방법은 세포 환경에서 단백질 올리고머를 분석 할 수있는 최적의 선택되지 않습니다. 또한, 이러한 기술은 용이하게 사용할 수있는 고가의 장비를 필요로한다. 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE), 크기 배제 크로마토 그래피 또는 종래의 도데 실 황산나트륨 (SDS) -page 뒤에 화학적 가교 세포 용 해물 2,19,20에서 올리고머 형성의 특성을위한 유용한 도구이다. 이러한 방법은 전문 장비가 필요하지 않습니다 쉽게 체육 될 수 있습니다표준 실험실에서 rformed. 우리는 처음에 가변되지 않은 특정 집계와 MXA의 침전되었다 다양한 화학 가교 프로토콜을 평가 하였다. 따라서, 우리는 다음 비 변성 PAGE 프로토콜을 테스트했다. 비 - 변성 PAGE는 SDS의 사용을 배제 같이, 단백질의 이동은 그 나라의 전하에 의존한다. 블루 기본 페이지는 SDS 유사한 전반적인 음전하와 단백질을로드 쿠마 빛나는 푸른 G250을 사용하지만 단백질 (21) 변성하지 않습니다. 불행하게도, 높은 염 종종 용해 버퍼에 포함되는 가의 양이온 (예를 들어 Mg를 2+)의 존재 브릴리언트 블루 침전물을 쿠마. 사용 된 버퍼에 따라, 올리고머 단백질 복합체에 영향을 미칠 수있는 단계를 더 최적화없이 샘플을 분석하기 어려울 수있다. 여기에서 우리는의 올리고머를 결정하기 이전에 발행 된 방법 (22)에 기초한 간단한 프로토콜을 제시비 - 변성 PAGE를 사용하여 세포 용 해물로부터 유도 된 인간 MXA 단백질.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:244px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">69570</td>
			<td style="width:268px;">Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) 
			Can be self-made according to Fiala et al. 2011</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:244px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">456-1083</td>
			<td style="width:268px;">Pre-run in running buffer to adjust buffer system</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td>use 1 tablet per 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">PBS, pH 7.4&#160; bottle a 500ml Gibco</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P7170</td>
			<td style="width:268px;">toxic! wear gloves and protect eyes!</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:244px;">NativeMark Unstained Protein Standard&#160; 50ul</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">P/N 57030</td>
			<td>load 5 ul/well</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">A549 cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL185</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL81</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">anti-Mx1 antibody</td>
			<td style="width:140px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:131px;">H00004599_D01P</td>
			<td>Use at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:244px;">ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">NA934V</td>
			<td>Use at a 1:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:244px;">0.5% Trypsin-EDTA (1x)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:131px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Iodoacetamide&#160;&#160; 5g</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">I-6125</td>
			<td>stock&#160; 100mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Bromphenolblue</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Pen&#160; Strep 100 x&#160;&#160;&#160;&#160; 100ml&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">15140 - 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Glutamax 100xStock, 100ml&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">350500-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PVDV blotting&#160; membrane</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">10600022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium fluoride (NaF)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">NP-40</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">492015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tween 20</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">6555204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CHAPS 10% solution</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">N907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0007132391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">b-Glycerophospate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Milk powder</td>
			<td style="width:140px;">Migros/Switzerland</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Methanol</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:131px;">1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-subunit protein complexes of human mxa using non-denaturing polyacrylamide gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

비 - 변성 PAGE를 사용하여, 우리는 인간 야생형 MXA, 다이머 인터페이스 돌연변이의 MXA (R640A)와 MXA (L617D)뿐만 아니라, 세포 용 해물 (12)로부터의 단량체 인터페이스 돌연변이 MXA (M527D)의 올리고머 상태를 분석했다. 세포를 1 % octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) 및 요오도 아세트 아미드는 단백질의 가용화 및 유리 티올 기의 보호를 보장하기를 함유하는 완충액에 용해시켰다 (도 1 참조). 앞서 설명한 바와 같이, 소금, 작은 대사 산물은 투석 (19)에 의해 제거 하였다. 단백질 분리는 비 변성 PAGE에 의해 행했다. 효율적인 웨스턴 블로 팅을 용이하게하기 위해, 겔 블롯 전에 SDS 완충액 하였다. MXA 단백질은 MXA 향한 토끼 폴리 클로 날 항체를 이용한 면역 염색으로 가시화 하였다. 워크 플로는 그림 2에 설명되어 있습니다. IFN-α에서 내인성 MXA 인간 단백질의 올리고머 상태를 비교할<html> ; 자극 된 A549 세포, 우리는 재조합 야생형 모노머와 다이머 MXA 변종 (내인성 MXA 결여) 베로 세포를 형질. 흠 천연 단백질 마커 (도 3a)에 비해 이들 재조합 야생형 모노머와 다이머 MXA 각각 안정 사량, 단량체 및 이량 체를 형성 변이체. 따라서 IFN-α 유래의 내생 인간 MXA 단백질 올리고머 상태 A549 세포를 자극.도 3b는 IFN-α 자극 A549 세포의 용 해물에서 MXA의 크기 량체에 해당하는 것을 알 평가할 이들 재조합 단백질을 사용 하였다. 종합하면, 우리는 세포 용 해물로부터 인간 MXA 단백질 올리고머 상태를 결정하는 방법을 설명한다. 우리의 비 - 변성 PAGE 접근법은 다른 올리고머 단백질 복합체의 올리고머 상태를 평가하기 위해 사용될 수있다. 83 / 54683fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 요오도 아세트 아미드의 구조와 반응 방식은 요오도 아세트 아미드는 비가 역적 티오 에테르 결합을 형성하여 무료 cysteins의 티올 그룹을 보호합니다. 시스테인에서 황 원자와 요오드의 친 핵성 치환에서이 안정 수정 결과. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54683/54683fig2.jpg" /> 그림 2. 비 - 변성 PAGE의 흐름 다이어그램 세포 용 해물의 비 - 변성 PAGE 방식의 체계적인 표현. 세포 용해 동안 세제는 단백질의 가용화 및 티올 그룹은 단백질 응집을 방지 요오도 아세트 아미드에 의해 보호된다. 투석은 비 - 변성 PAGE 방해 할 수있는 작은 대사 염을 제거 <s&gt; 19입니다. 복잡한 분리는 비 변성 조건 하에서 수행된다. 올리고머 복합체의 검출은 면역 염색 이어 웨스턴 블롯에 의해 달성된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54683/54683fig3.jpg" /> 도 3 : 비 - 변성 PAGE 및 웨스턴 블랏을 이용하여 인간 단백질 MXA 올리고머 상태의 결정 (A)는 재조합 MXA ectopically 베로 세포에서 발현 변이체.. 야생형 MXA (테트라) 인터페이스 돌연변이의 MXA의 복합체 (R640A)는, MXA (L617D) (이량 체)와 MXA (M527D)는 자신의 올리고머 상태를 확인하고, 자신의 예상 분자량에 이동한다. (B) A549 세포 (MXA)의 발현을 유도 IFN-α 1 ㎖ 당 1,000 IU로 자극 하였다. 내생 MXA 쉬OWS 테트라 머 양식에 해당하는 밴드. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54683/54683fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 버퍼 이름 </td><td colspan="2"> 함유량 </td><td colspan="2"> 댓글 </td></tr><tr><td> 용해 완충액 </td><td colspan="2"> 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5) 150 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 MgCl 2, 100 μM의 요오도 아세트 아미드, 50 mM의 불화 나트륨, 1 ㎜ 나 3 VO 4, 1 % NP-40, 50 MM의 β-글리세로, 1 태블릿 50 EDTA ml의 용해 버퍼 무료, 프로테아제 억제제 칵테일 당 </td><td colspan="2"> iodacetamide, 불화 나트륨, 나 3 VO 4, octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40), β-글리세 및 단백질 분해 효소 inhibi 추가세포 용해 전에 토르 칵테일 바로 Iodacetamide는 빛에 민감한 때 용액에서 불안정하다. 빛에 노출되지 않도록하고, 사용하기 전에 권리를 녹인다. </td></tr><tr><td> 투석 버퍼 </td><td colspan="2"> 20 mM 트리스 - 염산 (pH를 6.8) 10 % 글리세롤, 0.1 % CHAPS, 0.5 mM의 DTT </td><td colspan="2"> CHAPS 다른 비 - 변성 계면 활성제에 의해 수 raplaced </td></tr><tr><td> 실행 버퍼 </td><td colspan="2"> 25 mM 트리스 - 염산 (PH 8.3), 192 mM의 글리신, 0.1 % CHAPS, 0.5 mM의 DTT </td><td colspan="2"> pH가 8.3에서 대부분의 단백질은 부정적으로 청구됩니다. 그러나, 염기성 단백질, 산성 pH는 사용되어야한다. 그렇지 않으면, 단백질은 반대 방향으로 실행되고 손실됩니다. CHAPS 다른 비 - 변성 계면 활성제로 대체 될 수있다 </td></tr><tr><td> 샘플 버퍼 </td><td colspan="2"> 310 mM 트리스 - 염산 (pH6.8), 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 50 % 글리세롤 </tD&gt; <td colspan="2"></td></tr><tr><td> SDS 버퍼 </td><td colspan="2"> 25 mM 트리스 - 염산 (PH 8.3), 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> 블로 팅 버퍼 </td><td colspan="2"> 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 20 % 메탄올 </td><td colspan="2"> 매우 큰 단지를 들어, 메탄올 ommitted 할 수있다 </td></tr><tr><td> 버퍼를 차단 </td><td colspan="2"> 50 mM 트리스 -HCl (pH 7.4) 150 mM의 NaCl을 0.05 % 트윈 20 5 % 분유 </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> 성장 배지 </td><td colspan="2"> 둘 베코의 변형 매체 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 2 mM의 글루타민 10 % 태아 송아지 혈청 </td><td colspan="2"></td></tr></tbody></table> 표 1 : 비 변성 PAGE에 필요한 버퍼 조리법.

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.1K 조회수.  University of Zurich. This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

연구

생화학

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of RNA-protein interactions. These interactions have been traditionally analyzed with polyacrylamide gels generated between two glass plates and samples electrophoresed vertically. However, polyacrylamide gels cast in trays and electrophoresed horizontally offers several advantages. For example, horizontal gels used to analyze complexes between fluorescent RNA substrates and specific proteins can be imaged multiple times as electrophoresis progresses. This provides the unique opportunity to monitor RNA-protein complexes at several points during the experiment. In addition, horizontal gel electrophoresis makes it possible to analyze many samples in parallel. This can greatly facilitate time course experiments as well as analyzing multiple reactions simultaneously to compare different components and conditions. Here we provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis for analyzing RNA-Protein interactions.

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool for analyzing RNA-protein interactions. Traditionally most experiments have used vertical gels. However, horizontal gels provide several advantages, such as the opportunity to monitor complexes during electrophoresis. We provide a detailed protocol for generating and using horizontal native gel electrophoresis.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis can be characterized using an in vitro DNA synthesis assay followed by polyacrylamide gel electrophoresis. The goal of this assay is to quantify synthesis of both natural DNA and modified DNA (M-DNA). These approaches are particularly useful for resolving oligonucleotides with single nucleotide resolution, enabling observation of individual steps during enzymatic oligonucleotide synthesis. These methods have been applied to the evaluation of an array of biochemical and biophysical properties such as the measurement of steady-state rate constants of individual steps of DNA synthesis, the error rate of DNA synthesis, and DNA binding affinity. By using modified components including, but not limited to, modified nucleoside triphosphates (NTP), M-DNA, and/or mutant DNA polymerases, the relative utility of substrate-DNA polymerase pairs can be effectively evaluated. Here, we detail the assay itself, including the changes that must be made to accommodate nontraditional primer DNA labeling strategies such as near-infrared fluorescently labeled DNA. Additionally, we have detailed crucial technical steps for acrylamide gel pouring and running, which can often be technically challenging.

This protocol describes the characterization of DNA polymerase synthesis of modified DNA through observation of changes to near-infrared fluorescently labeled DNA using gel electrophoresis and gel imaging. Acrylamide gels are used for high resolution imaging of the separation of short nucleic acids, which migrate at different rates depending on size.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. The ability to readily detect the formation of these fibers under various experimental conditions is essential for understanding their potential function. Many methods have been used to detect the fibers, but not without some drawbacks. For example, electron microscopy (EM), or staining with Congo Red or Thioflavin T often requires purification of the fibers. On the other hand, semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis (SDD-AGE) allows detection of the SDS-resistant amyloid-like fibers in the cell extracts without purification. In addition, it allows the comparison of the size difference of the fibers. More importantly, it can be used to identify specific proteins within the fibers by Western blotting. It is less time consuming and more easily accessible to a wider number of labs. SDD-AGE results often show variable degree of heterogeneity. It raises the question whether part of the heterogeneity results from the dissociation of the protein complex during the electrophoresis in the presence of SDS. For this reason, we have employed a second dimension of SDD-AGE to determine if the size heterogeneity seen in SDD-AGE is truly a result of fiber heterogeneity in vivo and not a result of either degradation or dissociation of some of the proteins during electrophoresis. This method allows fast, qualitative confirmation that the amyloid or amyloid-like fibers are not partially dissociating during the SDD-AGE process.

Here we use two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the presence of amyloid-like fibers of heterogeneous size and exclude the possibility that the size heterogeneity is due to dissociation of the amyloid fibers during the gel running process.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...