We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

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형태 형성은 배아 모양과 함께 성장 및 분화와 성숙 다세포 유기​​체로 수정란에서 개체 발생을 구동하는 과정입니다. 동물 개발하는 동안 형태 발생 과정은 그대로 살아있는 표본 1-3의 이미지로 최고의 분석 할 수 있습니다. 이러한 전 배아 촬상 이용시 시그널링 분자의 기울기, 세포 외 기질, 혈관, 신경 분포뿐만 아니라 주변 조직의 기계적 특성을 포함한 현상을 조절하는 모든 부품을 유지하기 때문이다. 형태 형성이 발생하는 비늘, 다리, 빠른 세포 내 사건은 시간 또는 며칠에 걸쳐 전체 조직의 발달의 맥락에서 미소 시간 스케일에 캡처되어야한다. 이러한 모든 요구 사항을 충족하기 위해 직교 평면 조명 현미경 (5)의 현대적인 구현 (4)는 개발되었다. 원래, 그것은 선택적 평면 조명 현미경 (SPI 지명되었다M) 4; 이제 모든 것을 포함하는 용어 가벼운 시트 형광 현미경 (LSFM)이 일반적으로 사용된다. 레이저 스캐닝 또는 회전하는 디스크 공 초점 현미경 6,7보다 광독성을 유도하면서 LSFM 높은 시간 해상도로 촬영을 할 수 있습니다. 요즘이 이미 기본적인 광 시트 조명의 원리의 많은 구현하고 그 이미지에 이전 연구자 8-11 액세스 시험편 및 프로세스의 많은 다양한 사용되었다. 우리는 먼저 기존의 공 초점 현미경 접근 방식을 통해 LSFM의 몇 가지 주요 장점을 강조하고 싶습니다 : 라이브 영상 현미경 실험에서 의미있는 결과를 얻기 위해서는, 관찰 만 최소 시료에 영향을 미치는 것이 중요하다. 그러나, 제브라 피쉬를 포함한 많은 생물은 광독성의 EF없이 높은 시간 해상도의 공 초점 현미경 이미지 그들에게이 도전하고, 레이저 광선에 매우 민감하다정체 또는 지연 개발 6,7 등 fects. LSFM 현재 샘플 7의 최소 분열 효과 형광 영상 법이다. 얇은 레이저 광 시트는 특정 시점에서 촬상 된 시험편의 일부만을 조명하므로, 광 시트 현미경은 매우 효율적으로 광자를 사용하고있다. 따라서, 낮은 조명 노출은 건강 시편의 이상 경과 관찰, 예를 들어 12 ~ 17 수 있습니다. 또한 LSFM의 최소 침습 덕분에, 획득 된 영상의 개수가 더이상 아니라 처리되고 저장 될 수있는 데이터의 양에 의해 시료가 견딜 수있는 빛의 양에 의해 결정되지 않는다. 근처 생리 학적 조건에서 시편을 유지하는 동일한 선에 따라서, LSFM 라이브 배아에 적합 다른 샘플 설치 전략이 함께 제공됩니다. LSFM 기술에서, 배아는 일반적으로 낮은 비율 아가로 오스의 얇은 칼럼에 포함된다. mountin동시에 여러 도면에서 (LSFM보기라고에서) 아가로 g 실린더는 회전 자유롭게 허용하므로 시료 완벽한 각도에서 관찰 될 수있다. 멀티 뷰 영상 및 후속 안식 융합 큰, 산란 표본에 특히 유용 높은 등방성 해상도로 캡처 할 수 있습니다. 다른 가능한 LSFM 설치 전략의 요약 E. 레이노의 실험실에 의해 작성된 샘플 준비의 장에서, 공식 현미경 운영 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 그것은 여기에 설명 된 것보다 목표는 이미지를 다른 샘플에 특히 경우, 권장 읽기입니다. LSFM의 화상 취득은 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 반대로, 넓은 시야, 카메라 계이다. 이것은 더 높은 신호 - 취득 이미지 잡음비 (SNR)를 초래하고 (초당 프레임 수십에서 수백)을 매우 빠르게 할 수있다. LSFM의 높은 민감도는 더 약하게 형광 SAMP의 영상을 가능하게레, 가까운 미래에 내인성 레벨 18에서 표현 된 전사 인자와 같은 내인성 단백질 / Cas9를 CRISPR를 사용하여 태그. 높은 SNR은 성공적인 하류 이미지 분석에 중요하다. 높은 속도가 빠른만큼 여러보기에서 전체 배아를뿐만 아니라 빠른 세포 내 프로세스를 캡처하는 데 필요한뿐만 아니라 이미지입니다. 관찰 된 현상은 별도의 뷰에서 오는 이러한 여러 Z 스택 획득 동안 변경하지 않는 경우 여러 뷰의 원활한 융합 만 달성 될 수있다. LSFM의 이점은 일반적으로 화질을 희생 오지 않는다. LSFM의 측면 해상도는 공 초점 현미경의 해상도보다 약간 더 나쁘다. LSFM에 사용되는 검출 목적이 하부 개구 표준 촛점 설정 물 또는 실리콘 침지 목표 1.2~1.3 비교 (보통 1.0 이하)을 가지고 있기 때문이다. 또한, 때문에 LSFM의 넓은 필드 검출 (에 absen핀홀 CE)은 공 초점 현미경에 비해 포커스 아웃 광있다. 포커스 아웃 광량은 광 시트의 두께에 의해 결정된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단점은 LSFM에서 높은 SNR에 의해 보상된다. 실제로, 이것은 예컨대 디스크 촛점 취득 15 회전에 비해 유사한 이미지 품질을 초래한다. 따라서,이 세포 혈통이 15,19 추적을 위해, 세포막이나 핵, 예를 들어, 같은 기능의 신뢰성 추출 할 수 있습니다. LSFM의 축 해상도 광 판 두께에 의해, 검출 목적에 부가하여, 결정된다. 어떤 경우 LSFM 캔의 축 방향 해상도는 공 초점 현미경의 해상도를 넘어. 광 시트는 일반적으로 저배율 대물 이미지화 큰 시험편 발생하는 검출 목적의 축 해상도보다 얇은 경우에는 우선, 해상도의 향상이 온다. LSFM은 ACH 수있는 방법 두 번째 방법,더 축 해상도 ieve, 다른 관점에서 높은 XY 해상도 정보가 하나의 이미지 스택에 결합되는 안식 융합이다. 생성 된 병합 스택은 횡 방향 (20, 21)의 해상도 값에 접근 등방성 해상도를 갖는다. 이 문서에서 설명하는 서로 상에 여러 뷰를 등록하기위한 전략은 샘플 (20, 21)의 주위에 아가로 오스에 포함 된 신탁 마커로 형광 폴리스티렌 비즈를 사용하여 기반으로합니다. LSFM 상용화로 인해,이 기술은 과학 (22)의 넓은 지역에 사용할 수있다. 따라서,이 프로토콜을 작성하기위한 동기 부여는 LSFM에서 실무 경험이 부족한 발달 생물 학자들에이 기술이 액세스 할 수 있도록 이들 과학자들은 샘플이 기술을 사용하기 시작 얻는 것입니다. 우리의 프로토콜은 개념적으로 간단한 현미경 t를 구성하는 상업 빛 시트 현미경을 사용모자가 작동하기 쉽습니다. 우리는 또한 특정 질문에 23-25 ​​답변을 적합 할 수 있습니다 홈 내장 LSFM의 설정과 제브라 피쉬 이미징에 대한 최근의 다른 프로토콜을 언급하고 싶습니다. LSFM 또 다른 항목 옵션은 넓은 지역 사회에 빛 시트 현미경을 가지고 오픈 액세스 원리를 사용하는 오픈 플랫폼 (26, 27)이다. 하드웨어와 소프트웨어 측면 모두의 문서는 http://openspim.org 및 https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 LSFM과 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 경골 제브라 피쉬를 사용합니다. 제브라 피쉬 눈의 형태 형성은 LSFM의 혜택을 많이 강조 예입니다. LSFM 이미 28 메다카 및 지브라 피쉬 29,30 안구 발달을 조사하기 위해 과거에 사용되었다. 시력 발달의 초기 단계는 종래의 현미경 정확하게 태아의 방향을 복잡부피가 큰 노른자로 배아가 눈 목표를 향하도록 측면에 거짓말을 할 수 없습니다. 그러나 LSFM는 아가 로스 칼럼에 장착하여, 샘플 재현성 위치 될 수있다. 또한, 광학 컵 무대에 광학 소포에서 전환하는 동안, 눈은 큰 Z 스택과보기의 큰 필드를 캡처 필요 성장과 함께 주요 형태 형성 재 배열을 겪는다. 또한 이러한 문제에 대한 LSFM은 기존의 공 초점 이미징 우수하다. 광섬유 컵 형성 과정은 따라서 이해할 한 시야에서 촬상 의해서만 시각화하기 어려운 입체이다. 이 등방성 해상도를 가진 멀티 뷰 영상이 유용합니다. 광학 컵 형성 한 후, 망막 레이저 노출에 더욱 민감하게된다. 따라서 LSFM와 연관된 낮은 광독성 장기 이미징 큰 장점이다. 여기에서 우리는 이전 제브라 피쉬는 배아 1 ~ 3 일의 촬영을 위해 최적화 된 프로토콜을 제시눈 개발에 초점을 맞춘 차 애벌레. 우리의 방법은 높은 공간 및 시간 해상도로 12 ~ 14 시간까지 취재 시간 경과 동영상 촬영을 할 수 있습니다. 이 기술은 변함없이 자주 테라 바이트 범위에서, 큰 데이터 세트를 생성으로 중요한 것은, 우리는 또한, LSFM에 필수적인 단계이다 데이터 처리를위한 파이프 라인을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Lightsheet Z.1 microscope</td>
			<td style="width:184px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting point agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low melting point agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4018 or A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td>
			<td>Millipore (Estapor)</td>
			<td>80380495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#956;l (1mm inner diameter, marked black) capilllaries</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701904</td>
			<td>sold as spare part for transferpettor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Teflon tip plungers for 20 &#956;l capillaries</td>
			<td>Brand</td>
			<td>701932</td>
			<td>sold as spare part for transferpettor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm</td>
			<td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O-rings for chamber windows 17&#215;1.5 mm</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, style 55</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0209-55-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Luer-Lock syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>397400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Links</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 1 Multiview reconstruction application</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 2 BigDataViewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/bigdataviewer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 3 BigDataViewer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/BigDataViewer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 5 BigDataViewer-issues</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Link 6 BigDataServer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/BigDataServer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM 비늘에 걸쳐 개발 프로세스를 이미징을위한 이상적인 방법입니다. 몇몇 애플리케이션은 세포 구조뿐만 아니라, 세포 및 조직 전체의 짧은 두 장기 영상을 도시 여기 컴파일된다. 이러한 예는 LSFM은 망막 신경에 광학 컵 형성에서 눈 개발의 여러 단계에서 유용한 도구가 있음을 보여줍니다. 영화 1은 처음에 그대로 배아의 축소보기를 보여주는, 일반 LSFM 방법의 예시로 제공 시야에서 아가로 오스 실린더를 삽입하고 나중에 형광 채널에서 망막의 상세도를 나타내는. <img alt="영화 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> 영화 1 :. 제브라 피쉬 망막의 LSFM LSFM 접근 방식을 설명하기 위해,이 영화는 배아이 (가) 내부에 그대로 영상화 된 시야에서 처음으로 보여줍니다형광로 전환하기 전에 실린더를 garose. 나중에는보기의 큰 필드가 전체 망막의 관찰을 가능하게 것을 알 수있다. 다음으로, 영화는 좋은 세포 내 해상도를 강조하기 위해 망막의 확대 작은 영역을 보여줍니다. Ath5 : 갭 37 GFP 형질 전환 지브라 피쉬 배아 촬상을 위해 사용되었다. 이 유전자는 망막 (주로 신경절 세포 감광체 전구체)에서 다른 뉴런 라벨. 영화의 형광 부분은 5 분 간격으로 40 배 / 1.0 W 목표를 사용하여 이중 양면 조명으로 촬영 단일보기로 체포됐다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투사가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 동영상이 매우 빠른 세포 내 이벤트를 높은 해상도로 캡처 할 수있는 방법을 보여줍니다; 미세 소관의 성장에서이 때그들의 플러스는 망막 신경 전구 세포에 끝납니다. 영화에 포함 된 정보는 미세 소관 플러스 엔드 성장의 추적 및 정량이 가능합니다. <img alt="영화 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> 영화 2 :. 단일 셀의 미세 소관 역학이 영화는 플러스 팁 마커 단백질 EB3-GFP (38)에 의해 표시된 미세 소관의 플러스 팁을 성장 캡처. 단백질은 단일 망막 전구 세포에서 발현된다. 미세 소관이 기저에 혀끝에서 방향으로 주로 성장하고있다 (위에서 아래로). EB3 혜성의 평균 속도는 0.28 ± 0.05 μm의 / 초로 측정 하였다. 높은 미세 소관 핵 활성을 갖는 세포의 근단 측의 밝은 점은 중심체이다. 야생 형 배아는 HSP70로 주입 : EB3-GFP 플라스미드 DNA. 영화는 약 28 hrpost의 fertiliz에서 열 충격 (37 ° C에서 15 분) 후 4 시간을 인수 한ATION 63X / 1.0 W 객관적이고 1 초 시간 간격을 사용하여 단면 조명으로 촬영 단일보기로 (HPF). 단일 셀은 망막의 대부분을 덮는 시야에서 자른 하였다. 두 조각의 돌기가 표시되는 최대 강도. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3은 어떻게 세포 내 구조물은 많은 시간에 걸쳐 올 수 있습니다. 여기에, 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)를 전좌 내 중심체가 캡처됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> 그림 3 :. 망막 신경절 세포의 전위 동안 중심체 현지화는 시간 경과 실험이 몽타주는 망막 신경절 세포 (RGC) 성숙에 걸쳐 중심체의 위치를 보여줍니다.신경 전구 세포의 중심체는 혀끝의 과정 (1시)의 매우 팁에서 지역화됩니다. 세포 분열 동안, 두 중심체는 유사 분열 스핀들 (2시 25분)에 대한 극 역할을합니다. 이 부서는 RGC와 시각 세포 전구체가되는 둘째 딸 세포로 분화 한 딸 셀에 발생합니다. 꼭대기 처리가 근단 측에 부착 한 채로 분할 후, RGC의 세포체는 망막의 기부 측으로으로 전위. RGC는 기저 측에 도달하면, 그 정점 처리는 분리와 중심체는 (6시 15분)로 이동한다. 서서히 혀끝의 과정 (6시 50분 7:20 8:10)과 함께 후퇴하는 동안 중심체가 올 수 있습니다. 중심체가 여전히 치근단 지역화 된 상태에서 마지막 프레임에서 (8:55) 신경절 세포는, 그 기저 측면에서 축삭을 성장하고있다. 모자이크 발현 한 세포 단계에서 야생형 수정란에 플라스미드 DNA 주입에 의해 달성 하였다. 세포는 Ath5 시각화되어 GFP-caax (녹색) CONST망막 신경절 세포와 다른 신경 세포 레이블 ruct. 중심체 (화살촉)는 Centrin-tdTomato 29 식 (마젠타)로 표시되어 있습니다. 망막의 정점면은 아래쪽의 화상의 상부 및 기부 쪽이다. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 시간 게시물 수정 (HPF)에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 4에 표시하고, 이러한 영화 1과 전체 조직을 촬상 데이터로부터 추출 할 수있는 방법을 단일 셀 동작. RGC의 전좌 쉽게 추적 및 정점과 기저 처리 될 수있다ES는 다음에. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> 도 4.도 3에 기술 된 바와 같이 하나의 망막 신경절 세포의 전좌 망막의 기저 측으로 혀끝에서 RGC 전위 터미널 분열 후에 발생하는 RGC는 Ath5의 식으로 분류된다. 갭-GFP 37 유전자. 30 μm의 두께 볼륨의 최대 강도 투영 도시된다. 이미지는 전체 망막을 다루는 영화에서 잘립니다했다. 영화는 약 34 HPF에서 시작한다. A에서 Z 스택은 40X / 1.0 W의 목적으로 매 5 분을 인수했다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바 5 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 5는 조직 SC를 캡처 안식 LSFM의 능력을 입증광 소포는 눈 컵으로 변환하는 동안 광학 컵 형태 형성의 예에 휴대 해상도와 에일 형태 형성 과정. 화질이 크게 최종 화상 해상도 등방성 한 Z 스택에 (이 경우) (5) 다른 관점에서의 정보를 결합한다 다안 촬상에 의해 개선 될 수있다. 이 도면은 멀티 뷰 컨벌루션 후 가중 평균 융합 및 이미지 콘트라스트의 추가 이득 및 해상도 후의 화상 품질의 향상을 나타낸다. 그림은 데이터 세트를 통해 서로 다른 방향에서 두 개의 광학 조각을 보여줍니다. 또한, deconvolved 데이터 세트에서 몽타주는 시간이 지남에 따라 광 컵 형태 형성을 보여줍니다. 모든 시점이어서 영화 3에 나타낸다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> 그림 5 : 단일보기와 multiv의 두 가지 방법 사이의 화질 비교서평 융합. (A) 측면도 및 (B) 등의보기에서 표시 단일 뷰의 데이터를 하나의 광 조각. 스트라이프 유물과 샘플 내부의 깊은 신호의 저하는 분명하다. 또한, 데이터 융합 (CF)에서 보이는 이미지의 일부는 특정 뷰에서 포착되지 않았다. (C) 같은 광학 슬라이스, 다안 융합 데이터 측면도 및 (D) 등의보기에서 표시 해주기있다. 스트라이프 유물을 억제하고 샘플에 깊은 구조를 더 잘 해결되어 있습니다. (E) 같은 광학 슬라이스 이제 안식는 측면도 및 (F) 등의보기에서 표시된 데이터를 deconvolved있다. 개별 세포막과 핵 잘 구별 할 수 있도록 증가 대비 및 해상도를합니다. 해상도는 샘플 내부에 특히 깊은 저하되지 않습니다. 데이터 집합은 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명에 인수되었다. AB의 z 스택1.5 μm의 스텝 크기 100 ㎛의은 20X / 1.0 W 목적으로 10 시간 동안 10 분 간격으로 각 뷰에서 취득한 아웃. 안식 융합 디콘 볼 루션에 대한 입력 이미지는 아래의 화상 처리 속도를 2 × 샘플링 하였다. 안식 디컨 볼 루션의 15 반복 실행 하였다. (G) 몽타주는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 일찍 눈 개발하는 동안 형태 발생 이벤트를 강조하는 deconvolved 데이터로부터 지느러미보기의 자른 영역을 보여줍니다. 초기 비슷한 원주 상피있는 광섬유 소포의 두 층은 별개의 세포 집단으로 분화. 표피에 가까운 말단 층은 망막 neuroepithelium (RN) 및 신경 튜브에 가까운 근위부 층은 망막 색소 상피 (RP)하게된다. 감소 임시 신장 및 invaginate의 셀은 광 컵 (5시에서 1시 40분까지)을 형성하는 단계; 동시에 RP 세포 평평. 표면 외배엽은 WH, 렌즈 (1:40)을 형성하도록 유도무형 문화 유산 invaginates 이상 (5시). 영화는 17 HPF에서 시작한다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 모든 세포막은 β - 굴지으로 표시되어 있습니다 : RAS-GFP의 유전자와 모든 핵은 HSP70에 의해 표시되어 있습니다 : H2B-RFP 형질 전환 유전자. 스케일 바는 30 μm의를 나타냅니다. FB의 전뇌, LE 렌즈, 영업 이익 후각 placode, RN 망막 neuroepithelium, RP 망막 색소 상피. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="영화 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> 영화 3 : 광학 컵 형태 형성은 단일보기와 안식 융합의 두 가지 방법으로 표시된 시간 경과 영화는 광학 컵 무대에 광학 소포에서 광학 컵 형태 형성의 전체 프로세스를 보여줍니다.. 그것은 측면도 (위)와 지느러미보기에서 하나의 광학 슬라이스 (아래)에서 단일 광학 슬라이스를 보여줍니다. 현상 광섬유 소포 세포를 최종적으로 내부 및 외부 망막 neuroepithelium 망막 색소 상피 반구형 광섬유 컵을 형성하기 위해 복잡한 재 배열을 겪는다. 렌즈는 표면 외배엽 형성된다. 그것은 neuroepithelium와 함께 invaginates 및 광학 컵에 앉아있다. 모든 세포막은 β - 굴지의 식으로 표시됩니다 RAS-GFP (녹색) 유전자와 핵는 HSP70으로 표시됩니다 H2B-RFP (마젠타). 영화는 약 17 HPF에서 시작한다. 데이터 집합은 20X / 1.0 W의 목적으로 매 10 분을 취득한 약 20도 떨어져 5보기에서 이중 양면 조명으로 약 100 μm의 스택 AZ 인수되었다. 시간은 HH에 표시됩니다 : mm입니다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K 조회수.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

비디오: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...