We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

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形態形成は、胚を整形し、一緒に成長および分化と成熟した多細胞生物への受精卵から個体発生を駆動する方法です。動物発生中の形態形成のプロセスは、無傷の生きた検体1-3の撮像によって最良に分析することができます。このような全胚イメージングが駆動し、シグナル伝達分子の傾き、細胞外マトリックス、血管系、神経支配だけでなく、周囲の組織の機械的性質などの開発を規制するすべてのコンポーネントを保存するためです。形態形成が発生するスケールを、埋めるために、高速な細胞内イベントは、時間または数日間にわたる全組織の発達との関連で分の時間スケール上に捕捉されなければなりません。これらのすべての要件を満たすために、直交する平面照明顕微鏡5の現代の実装4を開発しました。もともと、それは選択的平面照明顕微鏡（SPI命名されましたM）4。今包括的な用語ライトシート蛍光顕微鏡（LSFM）は、典型的に使用されます。レーザ走査またはスピニングディスク共焦点顕微鏡6,7未満の光毒性を誘導しながらLSFMは、高時間分解能での撮像を可能にします。今日では、そこに基本的な光シート照明原理の多くの実装は既にあり、それは研究者8月11日に以前にアクセスできない標本やプロセスの多種多様な画像に使用されてきました。 まず、従来の共焦点顕微鏡のアプローチよりLSFMのいくつかの重要な利点を強調したいと思います： ライブイメージング顕微鏡実験から意味のある結果を得るためには、観察のみ最小限試料に影響を与えることが重要です。しかし、ゼブラフィッシュを含む多くの生物は光毒性エフことなく、高時間分解能を持つ共焦点顕微鏡で画像彼らにそれが困難に、レーザ光照射に対して非常に敏感ですストールや発達の遅れ6,7のようなfects。 LSFMは現在、試料7上の少なくとも破壊的な効果を持つ蛍光イメージング技術です。薄いレーザー光シートは、特定の時点で撮像された試料の一部のみを照射するので、光シート顕微鏡は非常に効率的に光子を使用しています。その結果、低露光量は、健康な標本の長いタイムラプス観察、 例えば 12-17を可能にします。さらに、LSFMの最小侵襲性のおかげで、取得された画像の数はもはや、むしろ処理して保存することができますどのくらいのデータでサンプルが許容できる光の量によって決定されていません。 近くの生理的条件で試料を維持するという点では同じラインに沿って、LSFMは、ライブ胚に非常に適して代替サンプル実装戦略が付属しています。 LSFM技術では、胚は、典型的には、低い割合アガロースの薄いカラム内に埋め込まれています。 mountinアガロースシリンダへGは、回転の完全な自由を可能にするため、試料は完全な角度（LSFMにビューと呼ばれる）のと同時に、複数のビューから観察することができます。マルチビュー撮影とその後の多眼融合が大きな散乱標本のために特に有益であると高い、等方性の解像度でそれらをキャプチャすることができます。他の可能LSFM実装戦略の概要はE.レイノーのラボによって書かれた試料調製の章では、公式の顕微鏡取扱説明書に記載されています。それは、ここで説明するよりも、ゴールはイメージの異なるサンプルにある場合は特に、推奨読み取りです。 LSFMの画像取得は、レーザ走査型共焦点顕微鏡とは対照的に、広視野、カメラベースです。これは、より高い信号対取得された画像のノイズ比（SNR）になると（数十秒あたりのフレーム数百）非常に高速であることができます。 LSFMの高感度をさらに弱い蛍光SAMPのイメージングを可能にします近い将来の内因性レベル18か、で発現する転写因子、CRISPR / Cas9を使用してタグ付けされた内因性タンパク質のようなレ、。高いSNRはまた、成功した下流の画像解析のために重要です。高速は十分に速く、複数のビューから全胚をするだけでなく、迅速な細胞内プロセスをキャプチャするために必要なだけでなく、画像にされています。観察された現象は、別々のビューからこれらの複数のZスタックの取得中に変化しない場合、複数のビューのシームレスな融合は、達成することができます。 LSFMの利点は、典型的には、画像品質を犠牲にして来ることはありません。 LSFMの横方向の解像度は、共焦点顕微鏡の解像度よりも若干悪くなります。 LSFMに使用される検出の目的は、標準的な共焦点セットアップに水またはシリコン液浸対物レンズの1.2〜1.3と比較してより低い開口数（通常1.0以下）を有するためです。さらに、LSFMで広視野検出のために（absenピンホールのCE）は、共焦点顕微鏡に比べ、より焦点の外れた光があります。ピンボケの光の量を光シート厚さによって決定されます。それにもかかわらず、これらの欠点はLSFMより高いSNRによって補償されます。実際には、これは、例えば、スピニングディスク共焦点取得15と比較して同様の品質の画像が得られます。したがって、これは15,19をトレースする細胞系譜用の細胞膜や核、 例えば 、などの機能の信頼性の抽出を可能にします。 LSFMの軸方向の分解能は光シート厚によって、検出目的に加えて、決定されます。 LSFMの軸方向の解像度は、いくつかのケースでは、共焦点顕微鏡の解像度を上回ることができます。光シートは、典型的には、低倍率の対物レンズと撮像された大規模な標本のために発生し、検出目的の軸方向の解像度よりも薄い場合まず、解像度の向上が付属しています。 LSFMがACHできるか第二の方法、より良好な距離分解能をieve、異なるビューからの高XY解像度情報は、1つの画像スタックに結合されたマルチビュー融合です。得られたマージされたスタックは、横方向20,21に解像度の値に近づく等方性解像度を有します。この資料に記載されてお互いの上に複数のビューを登録するための戦略は、試料20,21の周囲のアガロース中に埋め込 ​​まれた受託者のマーカーとして蛍光ポリスチレンビーズを使用することに基づいています。 LSFMの商業化の結果として、この技術は、科学者22の広いコミュニティに利用可能になりました。したがって、このプロトコルを記述するための動機はLSFMで実務経験を欠く発達生物学者にこの技術がアクセスできるようにすることで、これらの科学者たちは、彼らのサンプルを用いて、この技術の使用を開始します。私たちのプロトコルは、概念的には単純顕微鏡トンを構成している商用光シート顕微鏡を使用しています帽子は、操作が簡単です。我々はさらに、特定の質問23-25 ​​に答えることが適当であるかもしれない自作LSFMのセットアップ、とゼブラフィッシュを撮像するための他の最近のプロトコルに言及したいと思います。 LSFMへの他のエントリのオプションは、より広範なコミュニティにシート光顕微鏡をもたらすためにオープンアクセスの原則を使用するオープンプラットフォーム26,27、です。ハードウェアとソフトウェアの両面のドキュメントはhttp://openspim.orgとhttps://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/で見つけることができます。 このプロトコルでは、我々はLSFMと発達過程を研究するためのモデル系として硬骨魚類のゼブラフィッシュを使用します。ゼブラフィッシュの眼の形態形成はLSFMの多くの利点を強調した例です。 LSFM既にメダカ28およびゼブラフィッシュ29,30に眼の発達を研究するために過去に使用されてきました。眼の開発の初期段階では、従来の顕微鏡検査のために正しく胚を配向する複雑さ、かさばる卵黄として胚が客観的に面した目で側にうそをつくことはできません。しかし、LSFMアガロースカラムに搭載して、サンプルを再現可能に位置決めすることができます。また、光学カップステージへ眼胞からの移行中に、目は大のzスタックおよびビューの大きなフィールドを取り込む必要とする、成長に伴う主要な形態形成の再編成を受けます。また、これらの課題のためにLSFMは、従来の共焦点イメージングに優れています。眼杯の形成プロセスは、したがって、理解し、一つのビューからの撮像のみによって可視化することが困難であり、三次元です。これは、等方性の解像度を持つマルチビュー撮影が有益になります。眼杯形成後、網膜は、レーザー露光にますます敏感になります。したがって、LSFMに関連する低毒性長期イメージングのための大きな利点です。 ここでは、古いゼブラフィッシュの胚1〜3日のイメージングのために最適化されたプロトコルを提示します眼の開発を中心とした目の幼虫。我々の方法は、高い空間分解能と時間分解能で12-14時間までカバーするタイムラプス動画の撮影が可能になります。この技術は、常に多くの場合、テラバイトの範囲で、大きなデータセットを生成するように重要なのは、我々はまた、LSFMに不可欠なステップであるデータ処理用のパイプラインを示しています。

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFMはスケール全体に発達過程を画像化するための理想的な方法です。いくつかのアプリケーションは、細胞内の構造だけでなく、細胞全体の組織の短いと両方の長期的なイメージングを示すここにコンパイルされます。これらの例はまた、LSFMは、網膜の神経発生に眼杯形成から眼の発達の様々な段階で有用なツールであることを示している。 映画の1が最初に無傷の胚のズームアウトビューを示す、一般的なLSFMアプローチの実例として働きます明視野でのアガロースシリンダーを埋め込み、それ以降の蛍光チャネルにおける網膜の詳細図を示します。 <img alt="映画1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> ムービー1：ゼブラフィッシュ網膜のLSFM LSFMのアプローチを説明するためには、この映画は、胚がAの内部にそのまま画像化される明視野で最初示しています蛍光に切り替える前に、シリンダをgarose。後でビューの大きなフィールドが全体の網膜の観察を可能にすることが示されています。次に、映画は良い細胞​​下解像度を強調するために、網膜の拡大小さな領域を示しています。 Ath5：ギャップ-GFP 37トランスジェニックゼブラフィッシュ胚は、イメージングのために使用しました。この導入遺伝子は、網膜（主に神経節細胞と感光体前駆体）内の異なるニューロンを標識します。映画の蛍光部分は、5分間隔で40X / 1.0 Wの対物レンズを用いて、両面照明で記録単一のビューとして捕獲されました。厚さ30μmの体積の最大値投影が示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> ムービー2は、非常に高速な細胞内事象を高解像度で撮像することができるか、を示しています。この場合における微小管の成長そのプラスは、網膜神経前駆細胞で終わります。映画の中で含まれている情報は、微小管プラス端の成長の追跡および定量を可能にします。 <img alt="ムービー2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> ムービー2：単一細胞における微小管ダイナミクスこの映画は、プラスの先端マーカータンパク質EB3-GFP 38によって標識微小管の成長にプラスのヒントをキャプチャします。タンパク質は、単一の網膜前駆細胞で発現されます。微小管は頂端から基底（下へ）の方向に優先的に成長しています。 EB3彗星の平均速度は0.28±0.05ミクロン/秒と測定されました。高微小管の核形成活性を示す細胞の頂端側の明るいスポットは中心体です。 EB3-GFPプラスミドDNA：野生型胚は、HSP70を注射しました。映画は、約28 hrpost fertilizでヒートショック（37℃で15分間）した後、4時間を取得しましたエーション63X / 1.0 W客観的かつ1秒の時間間隔を使用して片面照明で記録単一のビューとして（HPF）。単セルは、網膜の大部分をカバーする視野からトリミングされました。 2つのスライスの最大値投影が示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 図3に示すように、どのように細胞内構造は、多くの時間にわたって追跡することができます。ここでは、網膜神経節細胞（RGC）トランスロケーション内の中心体が捕捉されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> 図3：網膜神経節細胞の転座の間に中心体の局在タイムラプス実験のこのモンタージュは、網膜神経節細胞（RGC）の成熟を ​​通して中心体の位置を示しています。神経前駆細胞では中心体は、頂端処理（1時）の非常に先端にローカライズされています。細胞分裂時には、2の中心体は紡錘体（2時25分）のための極として機能します。この部門は、RGCおよび光受容細胞の前駆体となり、第二の娘細胞に分化1の娘細胞になります。頂端処理が頂端側に取り付けられたまま分裂した後、RGCの細胞体は、網膜の基底側に移動します。 RGCは、基底側に達すると、その頂端処理は切り離し、中心体は（6時15分）で移動します。徐々に頂端処理（午前6時50分、7時20分、8時10分）と一緒に後退しながら、中心体に従うことができます。中心体がまだ頂端局在している間に、最後のフレームでは（8：55）神経節細胞は、その基底側から軸索を成長しています。モザイク発現は、1つの細胞段階での野生型胚へのプラスミドDNAの注射によって達成しました。 GFP-CAAX（緑）のconst：細胞がAth5によって可視化されていますRGCおよび他のニューロンを標識ruct、。中心体（矢頭）はCentrin-tdTomato 29式（マゼンタ）によって標識されています。網膜の頂端側には、下部の画像および基底側の最上部にあります。厚さ30μmの体積の最大値投影を示しています。画像は全体の網膜をカバーする映画のクロップました。映画は約34時間後に受精（HPF）で始まります。 Zスタックは、40X / 1.0 Wの目的で、5分ごとに取得しました。ミリメートル：時間はHHに示されています。スケールバーは10μmで表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図4に、それが表示され、そのような映画1のように全組織を捕捉したデータから抽出することができる方法を、単一細胞の挙動。RGCの移行を容易に追跡し、その頂端および基底処理することができesが続きます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> 図4： 図3で説明したように、単一の網膜神経節細胞の転網膜の基底側への頂端からRGC転端末有糸分裂後に発生するRGCがAth5の発現によって標識されています。ギャップ-GFP 37導入遺伝子。厚さ30μmの体積の最大値投影を示しています。画像は全体の網膜をカバーする映画のクロップました。映画は約34 HPFで始まります。 Zスタックは、40X / 1.0 Wの目的で、5分ごとに取得しました。ミリメートル：時間はHHに示されています。スケールバーは5μmで表す。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図5は、組織の皮下をキャプチャするマルチビューLSFMの能力を実証します光学小胞は、眼杯に変身する時に眼杯の形態形成の例にセルラー解像度、とエール形態形成のプロセス。最終的な画像は、等方性分解能でつのZスタックに（この場合）5つの異なるビューからの情報から合成されたときに画質が大幅に、多視点画像化することによって改善することができます。この図は、マルチビューデコンボリューション後の加重平均融合および画像コントラストのさらなる利得および解像度後の画質の改善を示しています。図は、データセットを介して異なる向きに2つの光のスライスを示しています。また、逆畳み込みデータセットからのモンタージュは、時間をかけて眼杯の形態形成を示しています。全ての時点は、次にムービー3に示されています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> 図5：単一のビューとmultivの2つの方法の間の画質の比較IEW融合。（A）側面図及び（B）背側のビューから示された単一のビューデータの1光学スライス。ストライプのアーティファクトと試料内部のより深い信号の劣化は明らかです。また、融合したデータ（CF）で可視画像の一部は、この特定のビューでキャプチャされませんでした。 （C）同じ光学スライス、今多視点融合したデータは、側面図および（D）から示されるように背ビュー。ストライプアーチファクトが抑制され、サンプル中の深部構造をよりよく解決されることに注意してください。 （E）と同じ光学スライス今マルチビューは、側面図及び（F）背ビューから表示されるデータをデコンボリューションとして。個々の細胞膜と核が十分に区別することができるように増加し、コントラストや解像度に注意してください。解像度は、サンプルの内部、特に深い劣化しません。データセットは、約20度離れて5ビューから両面照明で取得されました。 ABのzスタック1.5μmのステップサイズで100μmのは、20X / 1.0 Wの目的と10時間10分間隔で各ビューで取得した外。マルチビュー融合およびデコンボリューションのための入力画像がダウンし、画像処理を高速化するために2回サンプリングしました。マルチビューデコンボリューションの15回の反復が実行されました。 （G）モンタージュは、眼杯のステージへ眼胞からの早期眼の開発中に形態形成のイベントを強調するための逆畳み込みデータから背ビューのトリミングされた領域を示しています。最初に同様の円柱上皮である光学小胞の二層は、異なる細胞集団に分化します。表皮に近い遠位層は、網膜神経上皮（RN）になると、神経管に近い近位層は、網膜色素上皮（RP）となります。 RNの細長いと陥入した中の細胞は眼杯（5時00分に1：40）を形成します。同時にRP細胞は平ら。表面外胚葉はWH、レンズ（1:40）を形成するように誘導されますichの陥入以降（午前5時00分）。映画は17 HPFで始まります。ミリメートル：時間はHHに示されています。すべての細胞膜は、βアクチンにより標識された：RAS-GFP導入遺伝子とすべての核は、HSP70によって標識されている：H2B-RFP導入遺伝子。スケールバーは30μmで表します。 FBの前脳、LEレンズ、OP嗅板、RN網膜神経上皮、RP網膜色素上皮。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ムービー3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> 映画3：眼杯の形態形成は、単一のビューとマルチビュー融合の二つの方法で示したタイムラプスムービーは眼杯の舞台に眼胞から眼杯の形態形成の完全なプロセスを示しています。これは、側面図（上）と背側のビューから単一の光のスライス（下）から単一の光のスライスを示しています。開発眼胞の細胞は、最終的に内網膜神経上皮と外側の網膜色素上皮と半球状の光学カップを形成するために複雑な再配列を受けます。レンズは、表面外胚葉から形成されます。これは、神経上皮と一緒に陥入し、眼杯に座っています。すべての細胞膜は、βアクチンの発現により標識された：RAS-GFP（緑色）導入遺伝子および核はHSP70で標識されていますH2B-RFP（マゼンタ）。映画は約17 HPFで始まります。データセットは、約20度離れて5ビューから両面照明で取得し、約100μmのaからzスタ​​ックは、20X / 1.0 Wの目標に10分毎に取得しました。ミリメートル：時間はHHに示されています。スケールバーは50μmで表します。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K ビュー.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

ビデオ: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

発生生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

生物学

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

生物工学

<meta charset="utf8"></head><body>ゼブラフィッシュ胚のための洗練されたマルチビューライトシート顕微鏡法

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:高解像度マルチビューライトシート顕微鏡のためのゼブラフィッシュ胚のマウント戦略 — イメージングと画像再構成の技術

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

バーチャルリアリティインタラクションによるゼブラフィッシュ心収縮の解析

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

著者スポットライト:Zebrafishの高分解能4Dライトシートイメージングとバーチャルリアリティによる心機能のシングルセル解析

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

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リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

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初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

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