We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

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	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. 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E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages.">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li><li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. 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The authors have nothing to disclose.

의정서는 다른 세포와 조직에 적합하다 사체와 함께 LAM은 마이크로 어레이 또는으로 분석 RNA-서열은 개발 또는 생리 학적 과정 7-11,13,14을 조절하는 유전자 활동의 특정 패턴에 대한 통찰력을 얻을 수있는 유용한 도구입니다. 그러나, 특정 세포 타입에 대해,이 방법의 적합성 구조적 문제에 비판적으로 의존한다. 셀은 명확하게 볼 수 있고 LAM에 사용되는 건조 섹션에서 명확하게 식별 할 필요가있다. Boechera의 divaricarpa에서 배우체의 형태는 계란 세포 (그림 2, 그림 3)의 쉽게 식별 할 수 있습니다. 결국, 특정 세포 집단의 분리 속도 또한 세포 유형 새로운 슬라이드를 슬라이드 교환 스캔으로 하나의 슬라이드에서 발견 될 수있는 주파수에 따라 시간이 걸리는 단계이다. 250 셀 분파 - 적어도 (200), 세포 유형에 해당 의존을 감안할 때이온이 샘플 당 풀링되어야 특정 연구 디자인에있어서의 적합성은 크게 LAM 단계의 시간 조건에 따라 다르다. 또한, 조직의 형태에 따라서는 6 μm의 부분의 두께를 감소시키는 구조의 측면에서 유리할 수있다. 유사하게, 이상적 ≥ 8 ㎛의 두꺼운 부분은 일반적으로 조직 절편 동일한 양의 다소 높은 품질의 높은 R​​NA 량 및 RNA 초래한다. LAM 가능하여 분리를 만들기 위해 10 μm의 - 또​​한, 관심있는 셀 (8)의 적어도 직경을 가져야한다. 원칙적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 먼 관련된 종으로부터의 상이한 세포 및 조직 유형으로 조정될 수있다. 그러나, RNA의 질도 7,10,13 같은 종의 상이한 세포 유형에 따라 다를 수있다. 이 프로토콜은 작고 중요한 세포 유형에 따라 조정되었습니다. 따라서, 그것은 이제 broade 적용될 수있다추가 조정없이 샘플의 연구 범위. 프로토콜의 약간의 변형은 그럼에도 조사중인 세포 유형 및 종류에 따라 요구 될 수도있다. RNA 형태와 품질의 비교를위한 새로운 종 또는 세포 유형의 방법을 설정할 때 처음 두 대안 고정 제를 사용하는 것이 권장된다 (프로토콜 1.1 참조). 원칙적으로,이 프로토콜에 적용 할 수있는 레이저 미세 절제 9 적합한 다른 기기로 수행 하였다. 그러나, 기기가 샘플링하는 기술뿐만 아니라, 레이저 전력 및 적용 할 수있는 레이저 빔의 최소 폭 둘 다를 주목해야한다. 특히 좁은 레이저 경로의 결과로 작은 세포 및 조직 분야, 레이저의 분리를 위해 더 적합합니다. 우리가 사용하는 장비의 레이저 빔 (~ 1 μm의 넓은) 오히려 괜찮 작은 세포의 해부를 할 수 있습니다. CEL를 수집하는 샘플링 기술정전 부착에 의해 스티커 캡 표면 LS 작은 세포 유형 및 단일 셀 부분의 분리에 특히 유리하다. 이것은 정전기 효과에 의한 시료 손실의 위험을 최소화한다. 얻어진 RNA의 품질 또한 전사 분석을 위해 중요하다 성공적인 RNA-SEQ 라이브러리 제조를위한 가장 중요한 점 중 하나는 RNA의 품질이다. 증폭 키트 여러 제공자가 더 낮은 무결성 RNA 그들의 기술을 최적화하면서, 마이크로 어레이를 하나 또는 RNA-SEQ 의해 사체 분석 후의 데이터의 품질은 일반적으로 입력 RNA의 품질을 증가시킨다. 이 설정 프로토콜을 사용하여, 좋은 재현성 RNA의 여성 생식 조직의 다양한 발달 단계에 대한 품질 및 애기 Boechera의 생식선을 수득 하였다 (예를 들면,도 4). 상기 방법은 적용 할 수 있지만또한 더 멀리 떨어진 종 (예를 들면, 토마토, 미공개)에 대한, 예를 들면, 작은 최적화 또는 변형 종 조직 유형에 따라 요구 될 수 있음을 고려하고, 심지어 실험실 환경으로 할 필요가 고습도 슬라이드 준비와 LAM 동안 RNA의 무결성을 손상시킬 수 있습니다. 프로토콜 동안 중요한 단계는 슬라이드 표본을 함유하는 구획 왁스 줄무늬의 장착된다. 여기에, 특히 물에 대한 접촉은 중요한 단계이다. EtOH로하여 물을 교체하는 분리 (미 출판) 후 RNA의 무결성의 상당한 개선을 초래하지 않지만, 메탄올로 물을 교체한다. 그러나, 메탄올은 화학 후드 아래 큰주의하여 취급해야합니다. 메탄올의 사용에 대한 대안으로서, 시료의 종류에 따라 물에 부착 한 후, 건조 시간은 동일 RNA 양호한 품질 결과 ~ 2 시간 (3.3.3.1 참조)을 저감 할 수있다.어느 세포 유형과 관심의 종 물이나 메탄올에 장착 의해 달성되는 RNA의 품질을 테스트하는 시험을 수행하는 새로운 프로젝트의 시작 부분에 좋습니다. LAM은 전사 분석을위한 강력한 기술이다 결론적으로, 우리는 성공적으로 최적화 LAM과 애기 장대와 Boechera 종의 성적 apomictic 생식 세포 계보의 다른 세포 마이크로 어레이 및 RNA-서열에 의한 세포 유형 특정 사체 분석의 조합을 적용했습니다. 따라서 비교 전사 분석을 가능하게 7,11,13,14 (또한 그림 5 참조). 세포 유형 특이 적 전사 분석을 허용하는 다른 기술과 비교하여 기술 된 방법은 다수의 이점을 맺는다. 중요하게는, 세포 유형 또는 부분에 관심 조직의인지 가능성에 따라서는 두 모델 희귀 세포 유형에 적용 할 수있다이러한 Boechera SPP.에서 성숙한 여성 배우체의 세포와 같은 비 - 모델 종, 또는 심지어 예를 들어 셀룰러 도메인, 셀 (19)의 극성 반을 분리하는데 사용될 수있다. 유사 응용 프로그램은 세포 또는 핵 (FACS / 팬) (10)의 형광 활성화 정렬에 의존하는 다른 방법으로 가능하지 않을 것입니다. 상기 방법의 주요 단점은 시간이 요구된다. 고정 및 삽입 시간에 손 - 확장이 필요하지 않으며, 동시에 꽃 다량 LAM 대해 완료 할 수 있지만 이러한 3 주에 매우 시간이 걸리는 셀 유형 특정 분석 및 통상적으로 3 일로서 LAM은 (레이저 현미경에서 하루 평균 5 시간에) 계획 될 필요가있다. 이런 점에서 제대로 연구를 설계 대상으로 특정 세포 유형의 분리 속도 일부 예비 시험을 수행하는 것이 도움이된다. 이 최적의 프로토콜을 사용하는 경우에도 또한, 시험은 고도로 다시되는 RNA의 품질을 테스트하기칭찬. 요약하면, LAM은 다른 기존의 방법을 사용하여 달성 할 수없는 개개의 세포 유형 또는 셀에도 하위의 해상도에서, 전사 분석을위한 강력한 툴이다. 이러한 점에서, 매우 높은 공간적 해상도, 발달 과정들, 예를 들어, 분석을 허용하는 엄청난 가능성을 맺는다. 이 작업은 애기 장대와 Boechera 7,11,13,14 성적과 apomictic 재생의 모든 주요 단계에서 세포의 전 사체의 분석에 의해 예시 하였다.

조직 수준에서 수행 전사 연구에서 매우 전문화하지만 희귀 세포 유형의 전 사체는 종종 더 풍부 주변 세포에 의해 마스크된다. 이러한 고도로 전문화 된 세포 유형에 대한 예는 식물에서 여성의 생식 계통 (생식 세포)의 세포이다. 여성 생식 계열은 꽃 1, 2의 gynoecium 내부 개발 난자 내 씨의 전구체를 지정합니다. megaspore 모 세포 (MMC)는 여성 생식계의 첫번째 셀이다. 그것은 감​​소 megaspores의 테트라을 형성하는 감수 분열을 거친다. syncytium에, 즉, 일반적으로 이러한 megaspores 중 하나만이 살아과 세포질 분열없이 mitotically 나눕니다. 세 antipodals 두 synergid 세포, 난자, 중앙 셀 : 유사 분열이 전형적으로는 네 종류의 세포로 구성된 성숙 배우체를 형성 cellularization 뒤 따른다. 계란과 중앙 세포는 DOU 동안 두 개의 정자 세포에 의해 수정 된 얻을 여성의 생식있다BLE 시비 현상 시드 1,2 배아 및 배유을 야기한다. 80 씨앗 밀접한 관련 속 Boechera에 꽃 당 개발 - 약 50 동안 성적 모델 시스템 애기 장대에서 만 ~ 50 씨앗은 꽃마다 개발한다. 따라서 암컷 생식선은 휴대 사양과 분화 발달 과정 등을 연구하는 우수한 모델을 만드는 몇 매우 특별한 종류의 세포로 구성된다. 또한, 식물의 재생을 지배하는 유전자 조절 과정에 대한 통찰력은 응용 가치가있을 수 있습니다. 식물, 씨앗 (무수정 생식)을 통해 모두 성적과 무성 생식가 발생할 수 있습니다. 유성 생식은 인구의 유전 적 다양성을 생성하는 동안, 어머니 공장에 유 전적으로 동일 클론 자손의 형성에 리드를 무수정 생식. 따라서, 무수정 생식은 복잡한 산모의 유전자형이 할 수있는, 농업과 종자 생산에 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가지고여러 세대 3,4,5를 통해 변경되지 않은 유지 될 수있다. 무수정 생식 자연스럽게 주요 작물에 발생하지 않기 때문에, 작물의 무수정 생식의 공학은 큰 관심의 3,4,5이다. 그러나, 이러한 장기 목표 무수정 생식의 근본적인 유전 및 분자 기초는 충분히 상세히 6에서 이해되지 않기 때문에 달성하기 어렵다. 레이저를 이용한 미세 절제 (LAM) 및 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용하여 apomictic 재생, 세포 유형 특정 전사 프로파일 링을 지배하는 전사 기준에 대한 통찰력을 확보하는 것은 매우 강력한 방법 7,8를 나타냅니다. LAM 먼저 동물과 생물 의학 연구를 위해 설립되었습니다. 지난 몇 년 동안 LAM은 식물학 6,9,10 적용되었다. 개별적인 세포 및 조직 유형의 프로파일을 허용하는 다른 방법들과 대조적으로, LAM 마커 라인 6,9,10의 생성을 필요로하지 않는다. 따라서, 애플리케이션이 될 수있다이전 분자 지식없이 세포 또는 조직 유형에 거짓말. LAM의 또 다른 장점은 셀이 위치 및 / 또는 구조적 특성에 기초하여 건조 부에서 인식 될 수있는 것이 긴 어떠한 세포 유형에 적용 할 수 있다는 것이다. LAM은 처리 중에 전사 프로파일의 변화를 방지 고정 조직을 사용하는 추가적인 장점을 갖는다. 관심, 예를 들어, 꽃 조직의 조직은, 이전에 파라핀 왁스에 매립 비 가교 고정액에 고정되어있다. 파라핀 왁스에 포함 설립 프로토콜 9,11 다음, 수동으로 수행 할 수 있습니다. 그러나, 왁스의 침투와 탈수를위한 자동 조직 프로세서의 사용은 일반적으로 RNA 품질 및 조직 형태의 보전의 관점에서 높은 재현성을 초래한다. 수지 조직을 포함하는 대안의 전략은 성공적 LAM 8 세포 유형 특정한 분석을 위해 사용되어왔다. 그러나, 자동 게이트의 사용많은 샘플 일단 시간의 실질적인 최소 요구 처리 될 수있는 왁스 매립 ated 조직 프로세서는 시간이 매우 효과적이다. RNA의 질 전형적으로 상당한 손실이 고정 및 매립시 발생하는 동안, 마이크로톰 얇은 부분의 제조 및 특히는 LAM에 사용 frameslides에 장착하면 RNA 품질의 보존을위한 중요한 단계 남아있다. 이는 앞서 언급 한 내용 및 테이프 이송 시스템의 이용이 단계 (12)에서 더 RNA 품질 결과를 설명 하였다. 그러나,이 슬라이드의 제조시 추가의 시간 소모적 인 단계를 추가하고 또한 특별한 장치를 필요로한다. 설명 최적화 된 프로토콜은 재현성 GeneCHIPs 및 차세대 시퀀싱 (NGS)이 7,11,13,14 접근과 전사 프로파일에 충분한 품질의 RNA를 생성합니다. 또한, 사용되는 레이저 미세 절제 현미경 단리 세포 유형의 고순도 ROUT은inely은 7,11,13,14을 생산했다. 속 Boechera는 apomictic 재생의 주요 단계를 공부를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. Boechera에서, 상이한 성적 apomictic 가입 나 다양한 식별되고, 비교에 사용될 수 15, 16, 17은 해석한다. 성적 애기 장대와 apomictic Boechera에서 여성의 배아에서 세포의 세포 유형 별 전 사체의 비교에서, 우리는 이에 7 무수정 생식에 적용되는 규제 프로세스의 새로운 측면을 식별 차별적으로 발현되는 유전자와 경로를 확인했다. 또한,이 연구는 세포 유형 특이 적 전사 대 LAM의 적합성 작은 ​​희귀 세포 유형의 분석을 확인 하였다. 이미 식물 종의 다양한 상이한 세포 유형의 분석이 프로토콜을 사용하지만, 종 - 상기 프로토콜 조직 - 특이 적 변형은 특정한 경우에 요구 될 수있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

샘플 준비 및 LAM은 연속 단계에서 완료 연속적인 단계들의 수는 LAM (도 1)에 의해 선택된 세포 유형에서 전사 분석을 위해 RNA를 준비해야한다. 이 RNA의 인구는 수확 후 변경되지 않도록 꽃과 즉시 고정의 수확을 시작합니다. 조직은 임베디드 구분, 슬라이드에 장착된다. 이 LAM에 의해 세포 하나 또는 여러 개의 모자 (그림 1)의 세포 유형 특정 섹션의 풀링의 분리를 할 수 있습니다. 재료는 이후 동결 또는 직접 RNA 추출법에 의해 처리 될 수있다. 외에 두 모델 비 모델 종 LAM 분석의 장점은 셀 타입 별 적용되어야에서, 상기 방법은 시간 소모적 오히려 남아있다. 때로는 더 많은 시간을 작업 중 적어도 1 주일, TI의 단계에 필요RNA 추출에 ssue 수확 (그림 1). 그것은 LAM 몇 일 동안 수확 자주 절 하나의 생물학적 시료와 RNA 추출에 풀링 고려 될 필요가있다. 100 ~에 대한 부분은 하루에 격리와 Boechera 계란 세포의 경우, 샘플 당 적어도 ~ 200 섹션의 사용을 적극 권장합니다. 관심의 세포 유형의 분리 건조 섹션에서의 가시성에 따라 다름 세포 유형 특이 부분의 분리는 프로토콜의 가장 시간이 많이 걸리는 공정이다. 지금까지,이 단계에는 자동화 인해 샘플의 복잡한 특성 때문에 개발되지 않았다. 건조 섹션 낮은 콘트라스트를 가지며, 단면 평면 인해 난자 w는 서로 다른 각도로 배향되어 있다는 사실에 샘플 사이 다르기 때문에 소프트웨어 툴을 사용하여 관심있는 셀의 식별이 가능하지조직을 ithin (그림 2). 그럼에도 불구하고, 성숙한 여성 synergids와 배우체, 난자, 중앙 셀 (정반대 세포가 수정하기 전에 퇴화)의 독특한 형태는 연구자에 의해 난자 세포 (도 3 그림 2B, C)의 명확한 식별을 할 수 있습니다. 사실, Boechera의 divaricarpa에서, 난자 세포는 종종 준비하는 동안 약간의 수축하므로, 주변 조직으로부터 고순도 (그림 2B, C도 3)에서 계란 세포 집단의 분리를위한 유리한 기능을 분리한다. LAM 후 캡의 육안 검사가 권장된다 LAM 후 캡 표면의 육안 검사는 먼지, 샘플, 예를 들어, 모든 가능한 오염의 식별을 할 수 있습니다. 또한, 상기 SE되도록 도움ctions는 때때로 부분이 절차를 수행하는 동안 분실, 캡에 충실. 일반적으로, 많은 선택 섹션은, 예를 들어, 달걀 세포 LAM 몇 시간 후 1 캡을 알 수있다. 기존의 워크 플로우 재현성 좋은 RNA 품질의 결과 여성에서 배우체 세포 유형 특이 LAM 아이솔레이션에서 총 RNA 량 만 NG 낮은 범위에있다. RNA의 양이 제한은 필요 LAM RNA 후 품질 관리에 대한 근사 각 슬라이드 큰 조직에서 분리 된 대표적인 제어를 사용하는 것을 가능하게한다. 이것은 B.으로부터 세포 유형 특이 RNA의 비교에 의해 설명된다 같은 divaricarpa 달걀 세포 유사 RNA의 품질을 나타내는 동일한 슬라이드에서 분리 된 큰 조직 영역에서 대조군에 비해 (도 4A, B). RIN 번호 &amp; # 높은 R​​NA의 품질이 방법을 사용, 좋은8805; 7 재현성이 얻어진다. 달성 된 RNA의 품질이 아닌 apomictic 중앙 셀 synergid 셀 또는 apomictic 초기 셀에 apomictic 난자 표현 236 유전자의 식별에 이르는, 세포 유형 특이 적 RNA-SEQ 적합했다 나 세포 또는에 애기 장대의 성숙 성 배우체 (그림 5) 7. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig1.jpg" /> 그림 1 :. 의정서의 단계의 계획 단계마다 필요한 최소 시간을 나타내는 고정 꽃 또는 관심의 조직 밤새 이루어집니다. 다음 날, 매립이 시작되는 프로토콜의 날 3에 포함 된 물질의 결과로, 밤을 통해 실행한다. 하루 왁스 블록에 포함 된 샘플부터 3 마이크로톰 절편을 생성 할 수있다. 얇은 파라핀 섹션의 리본 슬라이드에 장착하고, 밤새 건조 남아 있습니다. 에LAM의 수일 즉 하나 생물학적 복제에 충분한 재료를 획득해야한다. RNA 분리 및 품질 관리 후, RNA-서열에 대한 라이브러리 준비가 사체 분석을 준비하기 위해 수행 할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig2.jpg" /> 그림 2 : 계란 세포가 인해 여성 배우체의 특성 형태학 (A) 성숙한 여성 배우체 (폴리 고눔 타입)의 개략도 (B - C)에, 얇은 섹션에서 명확하게 식별 할 수있는 여성 배우체를 품고 난자를 통해 얇은 섹션.. Boechera의 divaricarpa. 계란 세포는 명확하게 볼 수 있습니다. 즉, synergids : S 인해 종종 암 배우체 형태의 모든 유형의 세포 (난자에중앙 셀 : CC)는 하나의 섹션에서 볼 수 있습니다. 스케일 바는 50 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig3.jpg" /> Boechera divaricarpa. (A)의 계란 세포와 B의 성숙 배우체의 C. 제 그림 3. LAM , B와 D 및 이전에 7 μm의에서 divaricarpa, 레이저 장치 (난자 : 전자, synergids : S, 중앙 셀 : CC)과 미세 절제 후. 스케일 바는 50 μm의 =. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig4.jpg" /> &lt;강한&gt; 레이저 해부 계란 세포 및 제어 섹션의 그림 4. RNA 품질. 컨트롤과 동일한 슬라이드에서 수확 (B) 큰 조직 영역에 비해 난자 섹션에서 분석으로 (A) RNA 품질. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig5.jpg" /> 236 apomictic 계란 세포에서 발현 유전자하지만 어느 것도 apomictic 중앙 셀, synergid 셀의 Apomictic 및 성적 성숙 배우체 또는의 세포에 비해 만 Apomictic 계란 셀에 표현 유전자의 그림 5. 확인은 Apomictic 초기 셀. 히트 맵 , B의 또는 apomictic 초기 셀 gunnisoniana도 A의 성숙 성 배우체의 세포 장대 7 계층샘플 및 유전자의 클러스터링은 유클리드 거리와 계층 적 응집성 클러스터링을 기반으로했다. 레드 높은 발현과 검은 색 낮은 발현을 나타낸다. 색상은 행마다 조정됩니다. 아포 :. apomictic <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K 조회수.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

비디오: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

포유 동물 조직의 레이저 캡처 Microdissection

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

연구

생물학

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 셀 형식 관련 Epigenome 프로 파일링

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...