We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

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E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. 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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo è adatto a diversi tipi di tessuto cellulare e LAM combinato con trascrittoma analisi per microarrays o RNA-Seq è un valido strumento per acquisire conoscenze in modelli specifici di attività dei geni che regolano i processi di sviluppo o fisiologici 7-11,13,14. Tuttavia, l&#39;idoneità di questo metodo per un dato tipo di cellula dipende criticamente sui problemi strutturali. La cella deve essere chiaramente visibili e senza ambiguità identificabile in sezioni secco utilizzato per LAM. In Boechera divaricarpa, la morfologia del gametofito permette una facile identificazione della cellula uovo (Figura 2, Figura 3). Alla fine, la velocità di isolamento di una popolazione di cellule specifica dipende anche dalla frequenza alla quale il tipo di cellula può essere trovato su un vetrino, scambiandosi diapositive e scansione nuove diapositive sono passi molto tempo. Dato che dipende dal tipo di cellula, di almeno 200 - 250 sect celluleioni devono essere riuniti per campione, l&#39;adeguatezza del metodo per un certo disegno studio dipende in gran parte dai requisiti di tempo per il passo LAM. Inoltre, a seconda della morfologia del tessuto, potrebbe essere vantaggiosa in termini di struttura per ridurre lo spessore delle sezioni a 6 micron. Allo stesso modo, le sezioni più spesse di una posizione ideale ≥ 8 micron tipicamente producono una maggior quantità di RNA e l&#39;RNA di qualità leggermente superiore dalla stessa quantità di sezioni di tessuto. Inoltre, le cellule di interesse dovrebbero avere almeno un diametro di 8 - 10 micron a rendere l&#39;isolamento da LAM fattibile. In linea di principio, il protocollo descritto qui può essere regolata a diversi tipi di cellule e tessuti di specie imparentati alla lontana. Tuttavia, la qualità dell&#39;RNA può variare anche tra differenti tipi di cellule della stessa specie 7,10,13. Questo protocollo è stato regolato in base a tipi di cellule piccole e critiche. Quindi, può ora essere applicato ad un broadeserie R di campioni senza ulteriori regolazioni. potrebbero tuttavia essere necessarie lievi modifiche del protocollo, a seconda del tipo di cellula e specie in esame. Si consiglia di utilizzare prima entrambi i fissativi alternativi (vedi protocollo 1.1) quando si imposta il metodo per una nuova specie o tipo di cellula per un confronto tra morfologia e qualità dell&#39;RNA. In linea di principio, il protocollo può essere adattato a ed eseguita con strumenti diversi adatti per microdissezione laser 9. Tuttavia, occorre notare che gli strumenti variano sia in potenza del laser e la larghezza minima del fascio laser che può essere applicato, come pure nella tecnologia di campionamento. In particolare per l&#39;isolamento di piccole cellule e aree di tessuto, laser conseguente un percorso laser stretto sono più adatti. Il raggio laser dello strumento che usiamo è piuttosto bene (~ 1 micron ampia) e permette la dissezione di piccole cellule. La tecnologia di campionamento della raccolta del cells su una superficie della calotta adesiva per adesione elettrostatica è particolarmente vantaggioso per le piccole tipi di cellule e l&#39;isolamento delle sezioni di cellule singole. Ciò minimizza il rischio di perdita del campione da effetti elettrostatici. Il Quality RNA ottenuto è importante per l&#39;ulteriore analisi trascrizionali Uno dei punti più critici per il successo di preparazione biblioteca RNA-Seq è la qualità dell&#39;RNA. Mentre diversi fornitori di kit di amplificazione ottimizzati loro tecnologia per l&#39;RNA di integrità anche inferiore, la qualità dei dati ottenuti dopo analisi trascrittoma da uno microarrays o RNA-Seq aumenta tipicamente con la qualità dell&#39;RNA ingresso. Usando questo protocollo stabilito, il bene e altamente riproducibile qualità RNA per le diverse fasi di sviluppo dei tessuti riproduttivi femminili e la linea germinale in Arabidopsis e Boechera è stato ottenuto (ad esempio, figura 4). Mentre il metodo è applicabileanche per le specie più distante connessi (es, pomodoro, non pubblicato), deve essere preso in considerazione che le piccole ottimizzazioni o modifiche possono essere richiesti a seconda della specie, tipo di tessuto, e anche l&#39;ambiente di laboratorio come, per esempio, una elevata umidità potrebbe compromettere l&#39;integrità del RNA durante la preparazione del vetrino e LAM. Un punto critico durante il protocollo è il montaggio delle strisce di cera sezionate contenenti i campioni ai vetrini. Qui, in particolare, il contatto di acqua è un passaggio critico. Durante la sostituzione dell&#39;acqua da EtOH non comporta alcun miglioramento significativo di integrità dell&#39;RNA dopo l&#39;isolamento (non pubblicato), la sostituzione di acqua metanolo fa. Tuttavia, il metanolo deve essere maneggiato solo sotto la cappa chimica e con grande cura. A seconda del tipo di campione, come alternativa all&#39;uso di metanolo, i tempi di essiccazione dopo montaggio con acqua può essere ridotto a ~ 2 h (vedere 3.3.3.1), con conseguente altrettanto buona qualità dell&#39;RNA.Esecuzione di una prova per verificare la qualità dell&#39;RNA ottenuto montando sia su acqua o metanolo per il tipo di cellula e specie di interesse è raccomandato all&#39;inizio di un nuovo progetto. LAM è una tecnologia potente per le analisi trascrizionali In conclusione, abbiamo ottimizzato con successo e applicato la combinazione di LAM e cellule tipo-specifica analisi del trascrittoma da microarray e RNA-Seq alle diverse cellule del sessuale e apomittica lignaggio linea germinale in Arabidopsis thaliana e Boechera spp., Permettendo così analisi trascrizionali comparative (vedi anche figura 5) 7,11,13,14. Il metodo descritto porta una serie di vantaggi rispetto ad altre tecnologie che consentono specifico tipo di analisi trascrizionale delle cellule. È importante sottolineare che, a seconda della riconoscibilità dei tipi di cellule o tessuti di interesse in sezione, può essere applicato a tipi di cellule rare sia modelloe specie non modello, come le cellule del gametofito femminile matura in Boechera spp., o può anche essere utilizzati per isolare domini cellulari, ad esempio, metà polari di cellule 19. Applicazioni simili non sarebbero possibili con altri metodi che si basano su fluorescenti attivato l&#39;ordinamento delle cellule o nuclei (FACS / ventilatori) 10. Un grave inconveniente del metodo è il requisito di tempo. Mentre la fissazione e incorporamento non richiede hands-on estesi di tempo e, contemporaneamente, possono stato fatto per una grande quantità di fiori, LAM in quanto tale, è molto in termini di tempo e, per un&#39;analisi specifica per tipo di cellula, in genere 3 giorni per 3 settimane di LAM (in media 5 ore al giorno al microscopio laser) deve essere pianificato. A questo proposito, è utile fare alcuni test preliminari per la velocità di isolamento del tipo di cellula specifica mirata per progettare correttamente lo studio. Inoltre, anche quando si utilizza questo protocollo ottimizzato, prove per testare la qualità dell&#39;RNA sono altamente riCommended. In sintesi, LAM è un potente strumento per l&#39;analisi trascrizionale alla risoluzione di tipi di cellule singole o anche sottodomini di cellule, che non potrebbe essere raggiunto utilizzando metodi alternativi esistenti. A questo proposito, sopporta enorme potenziale per consentire analisi, ad esempio, dei processi di sviluppo, con una risoluzione temporale e spaziale molto elevata. Questo è stato esemplificato dalle analisi dei trascrittomi di cellule in tutte le fasi chiave della riproduzione sessuale e apomittica in Arabidopsis e Boechera 7,11,13,14.

In studi trascrizionali fatto a livello dei tessuti, i trascrittomi di tipi di cellule altamente specializzate, ma rare sono spesso mascherati da i più abbondanti cellule circostanti. Un esempio di tali tipi di cellule altamente specializzate sono le cellule della linea riproduttivo femminile (germinale) in piante. La linea germinale femminile è specificato all&#39;interno di ovuli in via di sviluppo, i precursori di semi all&#39;interno del gineceo del 1,2 fiore. La cellula madre megaspore (MMC) è la prima cellula della linea germinale femminile. Subisce meiosi per formare una tetrade di macrospora ridotti. Tipicamente, solo uno di questi macrospora sopravvive e divide mitoticamente senza citochinesi, cioè, in un sincizio. Questi mitosi sono seguiti da cellularization per formare il gametofito maturo, che in genere si compone di quattro tipi di cellule: tre antipodals, due celle synergid, l&#39;uovo e la cellula centrale. Le cellule uovo e centrali sono i gameti femminili che vengono fecondati da due spermatozoi durante doufecondazione ble per dare origine a un embrione e endosperma del seme 1,2 sviluppo. Nel sessuale sistema modello Arabidopsis thaliana, solo ~ 50 semi si sviluppano per fiore mentre circa 50 - 80 semi si sviluppano per fiori in genere strettamente correlati Boechera. Così, la linea germinale femminile è costituito da pochi tipi di cellule altamente specializzate, che lo rende un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo, come ad esempio le specifiche e la differenziazione cellulare. Inoltre, approfondimenti sui processi di regolazione genica che regolano la riproduzione delle piante possono essere di valore applicata. Nelle piante, può avvenire sia riproduzione sessuata e asessuata attraverso i semi (apomissia). Mentre riproduzione sessuale genera la diversità genetica in una popolazione, Apomixis conduce alla formazione di progenie clonale che è geneticamente identica alla pianta madre. Pertanto, apomissia ha un grande potenziale per le applicazioni in agricoltura e produzione di sementi, come anche complesse genotipi materni puòessere mantenuta inalterata per diverse generazioni 3,4,5. Perché apomissia non si trova naturalmente in tutte le principali specie coltivate, la progettazione di apomissia nelle colture è di grande interesse 3,4,5. Tuttavia, questo obiettivo a lungo termine è difficile da raggiungere perché la base genetica e molecolare alla base di apomissia non viene compreso in modo sufficientemente dettagliato 6. Per acquisire conoscenze in base trascrizionale che regolano la riproduzione apomittica, specifici per tipo di cellula trascrizionale profilatura mediante microdissezione laser assistita (LAM) e sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio molto potente 7,8. LAM è stata in primo luogo stabilito per l&#39;animale e la ricerca biomedica. Negli ultimi anni LAM è stata anche applicata alla biologia vegetale 6,9,10. A differenza di altri metodi che consentano profilatura dei singoli tipi di cellule e tessuti, LAM non richiede la generazione di linee marcatore 6,9,10. Pertanto, può essere appmentito a qualsiasi tipo di cellula o tessuto senza conoscenza molecolare preventiva. Un altro vantaggio di LAM è che può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula finché la cella può essere riconosciuta in sezioni asciutte base alla posizione e / o caratteristiche strutturali. LAM ha il vantaggio aggiuntivo che vengono utilizzati tessuti fissati, che impedisce variazioni del profilo trascrizionale durante la lavorazione. Il tessuto di interesse, ad esempio, il tessuto floreale, è fissato in un fissativo non reticolazione prima inclusione in paraffina. Incorporare in cera di paraffina può essere effettuata manualmente, seguendo i protocolli stabiliti 9,11. Tuttavia, l&#39;impiego di un processore tessuti automatizzato per la disidratazione e l&#39;infiltrazione con la cera genera risultati riproducibilità in termini di conservazione della qualità dell&#39;RNA e morfologia tissutale. La strategia alternativa di incorporare tessuti in resina è stato anche utilizzato con successo per le analisi specifiche per tipo di cellula da LAM 8. Tuttavia, l&#39;uso di un automprocessatore ated per l&#39;incorporamento in cera è molto tempo efficiente, come molti campioni possono essere trattati contemporaneamente richiedono un minimo di mani-in tempo. Mentre tipicamente alcuna perdita significativa di qualità dell&#39;RNA avviene durante la fissazione e inclusione, la preparazione di sezioni sottili con il microtomo e, in particolare, il montaggio sulle frameslides utilizzati per LAM rimane un punto critico per la conservazione della qualità dell&#39;RNA. Ciò è stato notato in precedenza e l&#39;uso di un sistema di trasferimento nastro è stato descritto per una migliore qualità dell&#39;RNA in questa fase 12. Tuttavia, questo aggiunge un passo tempo supplementare durante la preparazione dei vetrini e richiede anche attrezzature speciali. Il protocollo ottimizzato descritto di seguito produce riproducibile RNA che è di qualità sufficiente per profilatura trascrizionale con GeneChip e Next Generation Sequencing (NGS) si avvicina 7,11,13,14. Inoltre, con il microscopio microdissezione laser utilizzato, un&#39;elevata purezza dei tipi di cellule isolate è rottainely prodotto 7,11,13,14. Il genere Boechera è un sistema modello eccellente per studiare i passaggi chiave della riproduzione apomittica. In Boechera, una varietà di diverse adesioni sessuali e apomittici sono stati identificati e può essere utilizzato per analisi comparative 15,16,17. In un confronto di trascrittomi cellule specifiche per il tipo di cellule della linea germinale femminile da Arabidopsis sessuale e apomittica Boechera, abbiamo identificato geni e vie che sono espressi in modo differenziale, individuando così nuovi aspetti dei processi regolamentari che disciplinano Apomixis 7. Inoltre, questo studio ha verificato l&#39;idoneità di LAM per specifico tipo cellulare trascrizionale analisi di tipi di cellule piccole e rare. Abbiamo già usato questo protocollo per l&#39;analisi dei diversi tipi di cellule in una varietà di specie vegetali, ma specie-e modifiche tessuto-specifici al protocollo può essere richiesto in alcuni casi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Preparazione del campione e LAM sono fatte in fasi consecutive Un certo numero di passi consecutivi sono necessari per preparare RNA per l&#39;analisi trascrizionale di tipi cellulari selezionati da LAM (Figura 1). Questo inizia con la raccolta dei fiori e la fissazione immediata per garantire che la popolazione RNA rimane invariato dopo la raccolta. Il tessuto è inserito, sezionato, e montate su slitte. Questo permette di isolare le cellule LAM e il raggruppamento delle sezioni tipo-specifici cellulari su uno o più tappi (Figura 1). Il materiale può essere congelata dopo o elaborato direttamente per estrazione di RNA. Oltre al vantaggio di LAM sia applicabile per la cella di tipo-specifiche analisi in entrambe le specie modello e non del modello, il metodo rimane piuttosto tempo. Almeno una settimana di lavoro, a volte più, è necessario per i passi da tiraccolta SSUE per l&#39;estrazione di RNA (Figura 1). Esso deve essere preso in considerazione che spesso sezioni raccolte nell&#39;arco di diversi giorni di LAM sono raggruppati in una estrazione del campione e RNA biologico. Per le cellule uovo Boechera, l&#39;uso di almeno ~ 200 sezioni per campione è altamente raccomandato, con un massimo di ~ 100 sezioni isolati al giorno. L&#39;isolamento della cella tipi di interesse dipende dalla loro visibilità nelle sezioni a secco L&#39;isolamento delle sezioni specifiche del tipo di cellula è il passo più in termini di tempo del protocollo. Finora, nessuna automazione di questa fase è stato sviluppato a causa della natura complessa dei campioni. L&#39;identificazione delle cellule di interesse mediante software non è praticabile perché le sezioni asciutte contrasto è basso ed il piano di sezione varia tra i campioni a causa del fatto che ovuli sono orientati ad angoli diversi well&#39;ambito del tessuto (Figura 2). Tuttavia, la morfologia unica del gametofito femminile maturo con i synergids, cellula uovo, e la cellula centrale (cellule degenerano antipodi prima della fecondazione) permette l&#39;identificazione univoca delle cellule uovo dal ricercatore (Figura 2B, C; Figura 3). Infatti, in Boechera divaricarpa, la cellula uovo spesso restringe un po &#39;durante la preparazione e quindi separa dai tessuti circostanti, una caratteristica vantaggiosa per l&#39;isolamento di popolazioni di cellule uovo alla elevata purezza (Figura 2B, C; la figura 3). Ispezione visiva della PAC dopo il LAM è Recensione positiva Controllo visivo della superficie della calotta dopo LAM consente l&#39;individuazione di eventuali contaminazioni del campione, ad esempio, dalla polvere. Inoltre, è utile per verificare che seZIONI attaccano al tappo, come a volte le sezioni si perdono durante la procedura. In genere, molte sezioni selezionate, ad esempio, le cellule uovo, può essere visto su un tappo dopo diverse ore di LAM. Il flusso di lavoro Fondata Risultati e riproducibile in buona qualità RNA Da specifici del tipo di cellule isolamenti Lam Da gametofito femminile, importi totali di RNA sono solo nel range ng basso. Questa quantità limitante di RNA rende necessario utilizzare un controllo rappresentante isolata da grandi tessuti di ogni diapositiva come approssimazione per il controllo qualità RNA dopo LAM. Ciò è dimostrato dal confronto di RNA delle cellule tipo-specifica da B. cellule uovo divaricarpa rispetto ai controlli da aree di tessuto grandi isolati dalle stesse diapositive, indicando simile qualità RNA (Figura 4A, B). Usando questo metodo, un bene da alta qualità RNA con i numeri Rin &amp; #8805; 7 è riproducibile ottenuto. La qualità dell&#39;RNA ottenuto era adatto per cellule tipo-specifici RNA-Seq, portando all&#39;identificazione di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittico ma non nella cella apomittico centrale, cellule synergid o cellula iniziale apomittica, né nelle cellule o gametophyte sessuale maturo di Arabidopsis thaliana (Figura 5) 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig1.jpg" /> Figura 1:. Schema delle fasi del protocollo, che indica il tempo minimo richiesto per ogni passo Fissazione dei fiori o tessuti di interesse è fatto durante la notte. Il giorno successivo, l&#39;incorporamento è avviato, che corre per tutta la notte, con conseguente materiale incorporato al giorno 3 del protocollo. Al giorno 3 sezioni microtomo a partire da campioni incorporati nei blocchi di cera possono essere generati. I nastri di sezioni sottili di paraffina sono montate su vetrini e lasciate asciugare per una notte. Soprae per diversi giorni di LAM sarà necessario per ottenere abbastanza materiale per una replica biologica. Dopo l&#39;isolamento dell&#39;RNA e controllo di qualità, la preparazione libreria per RNA-Seq può essere eseguita per preparare l&#39;analisi del trascrittoma. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig2.jpg" /> Figura 2: Le cellule uovo sono chiaramente identificabili nelle sezioni sottili, a causa della morfologia caratteristica del gametofito femminile (A) Schema del maturo gametofito femminile (tipo Polygonum) (B - C) Le sezioni sottili attraverso ovuli che ospitano gametofito femminile in.. Boechera divaricarpa. cellule uovo sono chiaramente visibili. A causa della morfologia del gametofito femminile spesso non tutti i tipi di cellule (cellule uovo: e, synergids: s, Cellula centrale: cc) sono visibili in una singola sezione. Barre di scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig3.jpg" /> Figura 3. LAM di ovociti di Boechera divaricarpa. A e C. Sezione della gametofito maturo di B. divaricarpa a 7 micron prima e, B e D, dopo microdissezione con il dispositivo laser (cellula uovo: e, synergids: s, cellula centrale: cc). Barre di scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig4.jpg" /> &lt;strong&gt; Figura 4. RNA qualità di ovociti laser-dissezionato e sezioni di controllo. (A) di qualità RNA come analizzato da sezioni di cellule uovo rispetto alle aree di tessuto più grandi (B) raccolte dalle stesse diapositive come controlli. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;identificazione di geni espressi solo nella cella apomittica uovo rispetto alle cellule del apomittica e sessuali gametofiti maturi o la cellula iniziale apomittica. Heatmap di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittica Ma né nella cella centrale apomittica, cellule synergid o apomittica cellula iniziale di B. gunnisoniana né le cellule del gametofito sessuale maturo di A. thaliana 7 gerarchicaraggruppamento di campioni e geni si è basata su distanza euclidea e gerarchica agglomerative clustering. Red denota un&#39;alta espressione e bassa espressione nero. I colori sono scalati per riga. apo:. apomittica <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K Views.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

Video: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling cellule staminali embrionali umane individuale mediante RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Profilatura cellulare Redox usando la microscopia ad alto contenuto

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...