We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

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	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. 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E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. 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The authors have nothing to disclose.

プロトコルは、異なる細胞や組織の種類に適しています トランスクリプトームと組み合わせLAMは、マイクロアレイ分析により、またはRNA-のSeqは、発達または生理学的プロセス7-11,13,14を調節する遺伝子活性の特定のパターンへの洞察を得るための貴重なツールです。しかし、任意の所与の細胞型のため、この方法の適合性は、構造的な問題に決定的に依存しています。セルがはっきりと見えるとLAMのために使用されるドライセクションで明確に識別する必要があります。 Boecheraのdivaricarpaでは、配偶体の形態は、卵細胞（ 図2、図3）を簡単に識別することができます。最後に、特定の細胞集団の単離の速度はまた、細胞型は、新しいスライドをスライドの交換及び走査ような1つのスライド上で見つけることができる周波数に依存し、時間のかかる工程です。 250セルの宗派 - 細胞型、少なくとも200上の依存を考えますイオンは、サンプルごとにプールする必要があり、特定の研究デザインのための方法の適合性は、LAMのステップのための時間要件に大きく依存します。 また、組織の形態に応じて、それは6ミクロンに切片の厚さを減少させるために構造の点で有利であるかもしれません。同様に、理想的には≥8μmの厚い部分は、典型的には、組織切片の同量よりわずかに高い質の高いRNAの量およびRNAをもたらします。実現可能なLAMによって分離を行うためには10μm - また、関心対象の細胞は、8の少なくとも直径を有しているべきです。 原理的には、ここで説明するプロトコルは、遠縁種由来の異なる細胞および組織型に調整することができます。しかし、RNAの質も同じ種7,10,13の異なる細胞型の間で変化することができます。このプロトコルは、小型で、重要な細胞型に基づいて調整されています。したがって、現在broadeに適用することができますさらに調整することなく、サンプルのRレンジ。プロトコルのわずかな変更にもかかわらず、調査中の細胞型および種に応じて、必要な場合があります。形態およびRNAの品質を比較するための新しい種または細胞型のための方法を設定するときは、最初に両方の代替固定剤を使用することをお勧めします（プロトコル1.1を参照）。 原則として、プロトコルは、に適合させることができ、レーザーマイクロダイセクション9に適した別の器具を用いて行います。しかし、機器は、サンプリングの技術に、並びに、レーザパワーと適用することができるレーザビームの最小幅の両方において変化することに留意する必要があります。特に小細胞や組織領域の単離のために、狭いレーザー経路が得られるレーザーが適しています。我々が使用する楽器のレーザービームが（〜1μmの広い）かなり細かく、小細胞の解剖を可能にします。セルを収集するサンプリング技術静電付着による粘着性のキャップ面上のLSは、小細胞型および単一セル部の単離のために特に有利です。これは、静電効果によるサンプル損失のリスクを最小限に抑えることができます。 得られたRNAの品質はまた、転写分析のために重要です 成功したRNA-のSeqライブラリーの調製のための最も重要なポイントの一つは、RNAの品質です。増幅キットのいくつかのプロバイダはさらに低い整合性のRNAのために彼らの技術を最適化しているが、いずれかのマイクロアレイまたはRNA-のSeqによってトランスクリプトーム解析の後に得られたデータの品質は、典型的には、入力RNAの品質と共に増加します。この確立されたプロトコルを使用して、優れた再現性の高いRNAの女性の生殖組織の異なる発生段階のための品質とシロイヌナズナとBoecheraにおける生殖細胞系列が得られた（ 例えば、 図4）。この方法は適用可能であるがまた、より遠縁の種（ 例えば、トマト、未発表）のため、それは例えば、小さな最適化または修飾は、種、組織の種類に応じて必要とされ得ることを考慮し、さらに実験室環境などの必要があり、高湿度スライドの準備とLAM中にRNAの完全性を損​​なう可能性があります。 プロトコルの間の重要なステップは、スライドにサンプルを含む区分ワックスストライプの実装です。ここでは、特に、水との接触は重要なステップです。エタノールによって水を交換しても分離（未発表）した後、RNAの完全性の有意な改善をもたらすものではないが、メタノールによる水の交換はありません。しかし、メタノールは、化学フードの下と、細心の注意を払って取り扱ってください。試料の種類に応じて、メタノールの使用の代替として、水と取り付け後の乾燥時間は、同様に良好なRNAの質をもたらす、（3.3.3.1参照）〜2時間とすることができます。目的の細胞型および種のいずれかのために、水またはメタノールに取り付けることによって達成さRNAの品質をテストするために試用版を実行することは、新しいプロジェクトの開始時に推奨されます。 LAMは、転写分析のための強力な技術であります 結論として、我々が正常に最適化され、LAMとシロイヌナズナのとBoechera属における性的及びアポミクシス生殖系列系統の異なる細胞へのマイクロアレイおよびRNA-のSeqによる細胞型特異的トランスクリプトーム解析の組み合わせを適用している。、このように比較転写分析を可能にします7,11,13,14（また、 図5を参照）。記載された方法は、細胞型特異的転写分析を可能にする他の技術に比べて多くの利点を有します。重要なことには、セクション内の関心の細胞型または組織の認識に応じて、両方のモデルのまれな細胞タイプに適用することができますこのようなBoechera属中の成熟雌性配偶体の細胞などの非モデル種、またはそれも細胞ドメイン、 例えば 、セル19の極性の半体を単離することができます。同様のアプリケーションでは、細胞または核（FACS / FANS）10の蛍光活性化ソーティングに依存する他の方法では不可能であろう。 この方法の主な欠点は、時間要件です。固定および埋め込みはハンズオン時間を延長する必要はありませんと同時に花の大量のために行われてできますが、のようなLAMは非常に時間がかかると、細胞型特異的分析のために、典型的には3日の3週間です（レーザー顕微鏡での一日あたりの平均5時間での）LAMを計画する必要があります。この点において、適切に研究を設計することが目標と特定の細胞型の単離の速度のためにいくつかの予備テストを行うために有用です。この最適化されたプロトコルを用いてもまた、RNAの品質をテストするための試験は非常に再され賞賛しました。 要約すると、LAMは、別の既存の方法を用いて達成することができなかった個々の細胞型、あるいは細胞のサブドメインの解像度で転写分析のための強力なツールです。この点において、非常に高い時間および空間分解能で、発生過程の、例えば 、分析を可能にするために大きな可能性を有します。これは、 シロイヌナズナとBoechera 7,11,13,14における性的及びアポミクシス生殖のすべての重要なステップで細胞のトランスクリプトームの分析によって例示されました。

組織レベルで行わ転写の研究では、専門性の高いまれ細胞型のトランスクリプトームは、多くの場合、より豊かな周囲の細胞によってマスクされています。このような専門性の高い細胞型のための例は、植物中の女性の生殖細胞系列（生殖細胞系列）の細胞です。女性の生殖細胞系列は、花の1,2の雌ずい群内部の種子の前駆体を胚珠を開発内で指定されています。大胞子母細胞（MMC）は、女性の生殖細胞系列の最初のセルです。それを低減大胞子のテトラッドを形成する減数分裂を受けます。合胞体に、 すなわち 、典型的には、これらの大胞子のうちの1つのみが生き残り、細胞質分裂せず、有糸分裂分割します。 3 antipodals、2助細胞、卵、および中心細胞：これらの有糸分裂は、典型的には、4つの細胞タイプで構成されて成熟した配偶体を形成し、細胞化が続いています。卵と中央細胞が堂中に2つの精細胞により受精を受ける女性の配偶子です開発シード1,2の胚と胚乳に生じさせるBLE受精。 80種子密接に関連属Boecheraで花あたりの開発-約50の一方で性的なモデル系のシロイヌナズナでは、唯一〜50個の種子は、花ごとに開発しています。このように、女性の生殖細胞系列は、このような細胞の仕様や分化などの発達過程を研究するための優れたモデル作り、わずか数専門性の高い細胞タイプで構成されています。 また、植物の再生を支配する遺伝子調節プロセスへの洞察は、印加された値とすることができます。植物では、種子（アポミクシス）を通じて両方有性と無性生殖が発生する可能性があります。有性生殖は、集団における遺伝的多様性を生成しながら、アポミクシスはマザー工場に遺伝的に同一であるクローン子孫の形成につながります。複雑な母系遺伝子型はできる限りそのため、アポミクシスは、農業と種子生産のアプリケーションのための大きな可能性を秘めています数世代3,4,5にわたって変化していない維持します。アポミクシスが自然にすべての主要な作物種では発生しませんので、作物におけるアポミクシスの工学は大きな関心の3,4,5です。無配偶生殖の根底にある遺伝的および分子的基礎は十分に詳細6で理解されていないため、この長期的な目標を達成することは困難です。 アポミクシス再生を支配する転写基礎への洞察を得るために、細胞型特異的転写プロファイリングレーザ支援顕微解剖（LAM）と次世代シーケンシング（NGS）を使用して、非常に強力なアプローチ7,8を表します 。 LAMは、最初の動物と生物医学研究のために設立されました。過去数年間にLAMは、植物生物学6,9,10に適用されています。個々の細胞や組織の種類のプロファイリングを可能にする他の方法とは対照的に、LAMは、マーカーライン6,9,10の生成を必要としません。したがって、それはアプリすることができます事前の分子の知識なしには、いかなる細胞または組織型に嘘をつきました。 LAMの別の利点は、それがあれば、セル位置および/または構造的特徴に基づいて、乾燥セクションに認識できるように、任意の細胞型に適用することが可能です。 LAMは、処理中の転写プロファイルの変化を防止する、固定された組織を使用するさらなる利点を有します。 目的の組織、 例えば、花の組織は、前パラフィンワックスに包埋した非架橋固定剤で固定されています。パラフィンワックスに埋め込 ​​みが確立されたプロトコル9,11以下、手動で行うことができます。しかし、ワックスで脱水し、浸潤のための自動化組織プロセッサの使用は、一般に、RNAの品質および組織形態の保全の観点から、より高い再現性をもたらします。樹脂中に組織を埋め込 ​​む別の戦略もうまくLAM 8によって細胞型特異的な分析のために使用されてきました。しかし、AUTOMの使用多くのサンプルは一度ハンズオン時間の最小値を必要に処理できるように、ワックスに埋め込むためated組織プロセッサは、非常に時間が効率的です。 RNAの品質の一般的に有意な損失は固定および埋め込み時に発生しませんが、ミクロトームで薄片の製造および、特には、LAMのために使用frameslidesへの実装は、RNAの質の保全のための重要なステップのまま。これは、前述されたテープ移送システムの使用は、このステップ12で、より良好なRNAの質をもたらすことが記載されています。しかし、これは、スライドの準備中に追加の時間のかかるステップを追加し、また、特別な装置を必要とします。以下に説明する最適化されたプロトコルは、再現性の遺伝子チップと次世代シーケンシング（NGS）は7,11,13,14に近づくと転写プロファイリングのために十分な品質であるRNAを産生します。また、使用されるレーザ顕微解剖顕微鏡を用いて、単離された細胞型の高純度ROUTありますinely 7,11,13,14を生産しました 。 属Boecheraはアポミクシス生殖の重要なステップを研究するための優れたモデルシステムです。 Boecheraにおいて、異なる性的及びアポミクシスアク種々の同定されており、比較のために使用することができる15,16,17分析します 。性的シロイヌナズナ及びアポミクシスBoecheraから女性の生殖細胞系列からの細胞の細胞型特異的トランスクリプトームの比較では、我々はそれによって7をアポミクシス支配する規制プロセスの新たな側面を特定する、示差的に発現している遺伝子および経路を同定しました。さらに、この研究は小さく、まれな細胞タイプの細胞型特異的転写分析のためのLAMの適合性を検証しました。すでに植物種の様々な異なる細胞型の分析のためにこのプロトコルを使用しているが、プロトコルに、種および組織特異的修飾は、特定の場合には必要とされ得ます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1,009,861,000</td>
			<td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease free water</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASP200 S</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048043624</td>
			<td>tissue processor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>black cardboard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be purchased in special paper shops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td>
			<td>Micro Dissect GmbH</td>
			<td></td>
			<td>1,4 &#181;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exsiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z354074-1EA</td>
			<td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 10&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 1000&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60010</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 20&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60020</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips 200&#160; &#181;l&#160;</td>
			<td>Axon Lab AG</td>
			<td>AL60200</td>
			<td>can be replaced by similar tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps precision</td>
			<td>VWE</td>
			<td>232-1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide holder</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0540.01</td>
			<td>F&#228;rbek&#228;sten nach Hellendahl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass staining trough</td>
			<td>Huber &#38; Co.AG</td>
			<td>10.0570.01</td>
			<td>F&#228;rbekasten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica EG 1150 H</td>
			<td>blocking station, similar devises are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating and Drying Table</td>
			<td>Medax</td>
			<td>15501</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket</td>
			<td>VWR ice bucket with lid&#160;</td>
			<td>10146-184</td>
			<td>similar buckets equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light table</td>
			<td>UVP An Analytical Jena Company</td>
			<td>TW-26&#160;</td>
			<td>white light transluminator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blade</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FEAHS35</td>
			<td>S35 microtome blade disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2ml</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X882.2</td>
			<td>for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPure RNA Isolation Kit</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic balancing trays</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic box</td>
			<td>Semadeni AG</td>
			<td>2971</td>
			<td>Plastikdose PS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic lid for heating plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>preparation needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-7159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free microfuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automated Rotary Microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2245</td>
			<td>similar devises are equally suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Loc&#160; Histo Screen Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C-1000_AQ</td>
			<td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &#181;l&#160;</td>
			<td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td>
			<td>50204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4436.2</td>
			<td>min. 99 %, p.a.,ACS, ISO SP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>process embedding cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14039440000</td>
			<td>Leica Jet Cassette I without lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>UF55</td>
			<td>other models and/or suppliers are suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

サンプル調製とLAMは、連続工程で行われています 連続したステップの数は、LAM（ 図1）によって選択された細胞型からの転写分析のためのRNAを調製する必要があります。これは、RNA集団は、収穫後に変わらないことを確実にするために、花の収穫と直接固定することから始まります。組織は、埋め込まれた切片、スライドに取り付けられています。これは、LAMによる細胞および一つまたは複数のキャップ（ 図1）の細胞型特異的セクションのプールの単離を可能にします。材料はその後凍結直接RNA抽出によって処理することができます。別に両方のモデルと非モデル種における分析LAMの利点は、細胞型特異的に適用されるべきで、この方法は時間がかかりむしろ残ります。作業時間のうちの​​少なくとも1週間は、時々より、TIからのステップのために必要とされますRNA抽出にssue収穫（ 図1）。これは、LAMの数日間にわたって採取し、多くの場合、セクションは、1つの生物学的サンプルとRNA抽出にプールされていることを考慮する必要があります。最大100〜までのセクションでは、一日あたりの単離されたとBoechera卵細胞について、サンプル当たり少なくとも〜200のセクションの使用が強く推奨されています。 目的の細胞型の単離は、ドライセクションでの視認性に依存します 細胞型特異的部分の分離は、プロトコルの最も時間のかかるステップです。これまで、このステップのない自動化を伴う試料の複雑な性質のために開発されていません。乾燥セクションは低コントラストを有しており、切断面が胚珠をW異なる角度で配向されているという事実に起因し、サンプル間で変化するためのソフトウェアツールを使用して、関心のある細胞の同定は不可能です組織をithin（ 図2）。それにもかかわらず、成熟した女性の助細胞と配偶体、卵細胞、および中央のセル（正反対の細胞は受精前に縮退）のユニークな形態は、研究者によって卵細胞（;図3、図2B、C）の明確な同定を可能にします。実際、Boecheraのdivaricarpaで、卵細胞は、多くの場合、準備中にビットを縮小するため、周囲の組織、高純度で卵細胞集団を単離するための有利な特徴（ 図 2B、C;図3）から分離します。 LAM後のキャップの目視検査が推奨されます LAM後はキャップ表面の目視検査は、埃によって、 例えば 、サンプルのいずれかの可能性のある汚染の同定を可能にします。また、それ自体ことを確​​実にするために有用ですctionsは、時折のセクションでは、手順の間に迷子に、キャップに固執します。典型的に、多くの選択されたセクションは、 例えば 、卵細胞は、LAMの数時間次々キャップで見ることができます。 設立ワークフローは、再現性良いRNAの品質に結果 女性の配偶体からの細胞型特異的LAMアイソレーションから、全RNA量はごく低いngの範囲です。 RNAのこの制限量はLAM後のRNAの品質管理のための近似値として、各スライドの大きい組織から単離された代表的なコントロールを使用することが必要になります。これは、Bからの細胞型特異的RNAの比較によって実証されますより大きな組織領域からの対照と比較してdivaricarpa卵細胞は、同様のRNAの質（ 図4A、B）を示し、同じスライドから単離しました。 RIN番号＆＃と高いRNAの品質にこの方法を使用して、良いです8805; 7を再現性が得られます。達成されたRNAの質はなくアポミクシス中央セルの助細胞、またはアポミクシス初期細胞にアポミクシス卵細胞中で発現さ236遺伝子の同定につながる、細胞型特異的RNA-のSeqに適した、また細胞または中シロイヌナズナの成熟した性的配偶体（ 図5）7。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig1.jpg" /> 図1：プロトコルのステップのスキーム、ステップごとに必要な最小限の時間を示す関心のある花や組織の固定は、一晩に行われます。翌日、埋め込みは、プロトコルの3日目に埋め込まれた材料が得られ、一晩実行され、開始されます。日にワックスブロックに包埋サンプルから始まる3ミクロトーム切片を生成することができます。薄いパラフィン切片のリボンは、スライド上にマウントし、一晩放置して乾燥させています。にLAMの数日間に電子が一つの生物学的反復のための十分な材料を得るために必要とされるであろう。 RNAの単離および品質管理の後、RNA-のSeq用のライブラリの準備がトランスクリプトーム解析を準備するために行うことができる。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig2.jpg" /> 図2：卵細胞が原因雌性配偶体の特徴的な形態 （A）成熟した雌性配偶体（ タデタイプ）の模式図（B - C） に、薄い部分で明確に識別されているの女性配偶体を保有胚珠を通じて薄片。 Boecheraのdivaricarpa。卵細胞がはっきりと見えます。 E、助細胞：Sにより、多くの場合、雌性配偶体の形態ではないすべての細胞型（卵細胞に、中央のセル：CC）は、単一のセクションに表示されます。スケールバー=50μmでは。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig3.jpg" /> Boechera divaricarpa。A の卵細胞 と Bの成熟した配偶体のC.セクションの図3. LAM 、BおよびDの前に7ミクロンでdivaricarpa、レーザ装置（卵細胞：E、助細胞：S、中央のセル：CC）と顕微解剖後。スケールバー=50μmでは。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig4.jpg" /> &lt;強い&gt;レーザー解剖卵細胞と制御部の図4. RNAの品質。コントロールと同じスライドから収穫（B）より大きな組織領域と比較して、卵細胞のセクションから分析として（A）RNAの品質。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig5.jpg" /> 236アポミクシス卵細胞で発現する遺伝子が、どちらもアポミクシス中央のセルで、の助細胞のアポミクシスと性的成熟した配偶体またはの細胞と比較してのみアポミクシス卵細胞で発現する遺伝子の図5.同定はアポミクシス初期セル。ヒートマップBの、またはアポミクシス初期セルgunnisonianaもAの成熟した性的配偶体の細胞シロイヌナズナ 7階層サンプルおよび遺伝子のクラスタリングは、ユークリッド距離と階層的凝集クラスタリングに基づいていました。赤は高発現と黒の低い発現を示しています。色は、行ごとにスケーリングされます。アポ：アポミクシス<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K ビュー.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

ビデオ: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

生物学

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

宿主植物の揮発性物質のスクリーニングツールとしてElectroantennographicバイオアッセイ

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: 細胞型特異エピゲノムのプロファイリング

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールとしてのレーザ支援顕微解剖（LAM）