이 작품은 NIH 부여 GM68418에 의해 지원되었다.

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

최근 몇 년 동안 많은 연구가 고정 된 세포에 대해 서로 다른 양적 현미경 분석법을 개발 하였다. (42) 진행을 센트로 - 동원체 생물학에 자주 세포 내 공간 - 시간 규제의 변화하는 기능을 반영하고있는 단백질의 센트로 별 또는 동원체 특정 기능에 대한 이해가 필요 세포주기 중에 이러한 단백질. 따라서, 우리가 IIF 염색 구체적으로 다르​​게 취급 샘플에 적용 할 수있는 내인성 및 외인성 CENP-A 단백질의 상대적인 수준을 분석하는 정량적 IIF 분석 방법을 개발했다. 현재 우리는이 연구에서 프로토콜 2를 사용하여 내생 CENP-I, CENP-H, KNL1, Hec1 및 Ska1의 성공적인 IIF 염색을 달성 (. Niikura 등 (24)와 데이터가 표시되지 참조; 재료 / 장비의 목록을 항체의 내용) . 미래에는, 하나의 (상이한 센트로-동원체 단백질의 수준을 정량화하기 endog을 모두 동일한 방법을 적용 할 수있다특정 항체를 선택) enous 및 외래 단백질을 플래그 - 태그, 그러나, 우리의 IIF 방법은 살아있는 세포 또는 전체 세포주기 중 특정 하나의 세포에서이 단백질의 검출을 포함하지 않습니다. 이러한 절차는 고정 분리 된 커버에 처리 될 셀을 필요로하기 때문에, 우리는 매우 상이한 샘플들 사이의 신호를 비교하고 분석의 정확성을 높이기 위해 정규화 목적 기준 신호 (예를 들면, ACA 또는 CENP-B)를 도입했다. ACA는 내인성 및 / 또는 외인성 CENP-A 신호, CENP-B를 포함하기 때문에 CENP-A 신호의 정량 분석​​의 정밀도의 관점에서 ACA보다 정상화 목적 기준 신호 비교에 더 적합 할 것 같은. CENP-B의 아미노 말단 영역 alphoid DNA의 CENP-B 박스 서열의 17 bp의 모티프와 결합하고, CENP-B의 카르복시 말단 영역은 동종이 량체를 형성한다. 43,44 CENP-B 완전 colocalize 않는다 CENP-A 및 / 또는 기타와 CENTRomere-동원체 단백질은, 그러나, 밀접하게 그들과 관련이있다. 45 항 CENP-C 항체와 면역은 일반적으로 그러나 항 CENP-B는 종종 두 자매 동원체를 연결하는 하나의 밝은 막대로 나타납니다. (46) 염색, 두 개의 분리 된 지점을 제공하는 동안 우리 매크로 스케일 현미경 관찰 일부 CENP-B 신호는 분명히 관찰 각도와 사용 정착액의 유형에 따라 부분적으로도, 특히 초기 분열 단계 (후반 중기보다 의향-prometaphase)에서, CENP-A 신호와 중첩 (데이터는 보이지 않음). 센트로-동원체 단백질의 대부분의 지역화에 의존하지만 반대로, CENP-A 신호 정량적 IIF 분석에서, 기준 신호의 단백질 지역화, 고갈 및 / 또는 적정 분석 CENP-A의 기능 장애에 의해 영향을 받아서는 안 중심절에서 CENP-A 현지화. 47, 48 CENP-A-독립적 인 동원체 어셈블리는 CENP의 DNA 결합 영역을 대체하여 설립자궁외 궤적에이 단백질을 모집 다른 염색체 타겟팅 도메인이 -C 및 CENP-T. 또한 49,50은 최근의 작업은 내부 동원체 구성 요소 CENP-C 병렬 CENP-T의 행위에 KMN 네트워크를 모집하는 것으로 나타났다 또한 kinetochores. 51-54, 니시노 등의 알은. 정규 뉴 클레오 단백질을 넘어 &#39;히스톤 코드&#39;를 연장, DNA와 연락처를 생성하는 CENP-TWSX 복잡한 형태 그 고유의 뉴 클레오 같은 구조를 제안했다. (55) 때문에 CENP-의 센트로 현지화 C는 CENP-A의 센트로 지역화에 의존, 47, 48 CENP-TWSX 또는 특히 CENP-T는 다른 단백질 후보 (들) CENP-A의 정량적 IIF 분석에서 기준 신호를 제공하도록 될 수있다. 그러나, 참조 신호에 대한 후보는 신중하게 중심절에서 현지화가 CENP-A의 고갈 및 / 또는 기능 장애에 의해 영향 여부를 확인하는 분석하기 전에 테스트해야합니다. 유사 고려다른 센트로-동원체 단백질의 정량 분석​​법 IIF주의해야한다 : 레퍼런스 신호 단백질 현지화 적정 분석 대상 단백질의 결핍 및 / 또는 기능 장애에 의해 영향을받지 않을 것이다. 이전 연구에서, 우리는 다른 중앙 외측 동원체 단백질의 정량 IIF 분석을위한 기준 신호로서 ACA를 사용했다. 24 ACA는 위치 제어와 같은 단일 CENP-B보다 적절한 옵션뿐만 아니라 레퍼런스 신호, 만약 수 ACA 전술 한 바와 같이 신호 CENP-B와 목적 단백질의 결핍 및 / 또는 목적 단백질의 기능 장애뿐만 colocalization을 영향을받지 않는 것이 나쁘다. 보도 르 등. 센트로 CENP-A 수준은 센트로 CENP-A의 양이 세포 콘텐츠에 정비례 변화 즉 질량 작용에 의해 조절되는 것으로보고 하였다. 56 그들은 또한 CENP-A 발현의 일시적 유도의 신속한 증가를 초래되었습니다 센트로 미어 CENP-A 레벨. 반대로, 우리가 CA-UTR 된 siRNA (UTR의 siRNA 5 &#39;및 3&#39;의 혼합물 표 1)와 pTRM4 발현 벡터에 cotransfection 후 센트로 지역화, 국기 - 태그 CENP-A WT와 큰 세포 인구를 관찰 (데이터하지 ) 표시; 이 인구 만 pTRM4 발현 벡터로 형질 전환 한 후 볼보다도 컸다. 발현 pTRM4 의해 구동 된 외인성 플래그 - 태그 CENP-A 단백질의 수준이, 내인성 CENP-A보다 더 높은 강도 (10 ~ 25 배까지) 약 1.0-1.4 주문 하였다 (데이터는 보이지 않음). 특정 임계 값 이상의 외래 CENP-A (WT)의 발현에 악영향을 적절한 센트로 미어 현지화에 영향을 미칠 수있는 것으로 추측된다. 본 프로토콜에 고정 네이티브 상태에 가능한 인접 상황 셀룰러 구조 및 환경을 유지하는 중요한 단계이다. 세포를 고정하면 하나 INTE 단백질 손실을 방지하기 위해 염색 프로토콜을 진행해야휴식 또는 셀의 나머지. 그러나 고정 가끔 항원 사이트를 파괴하고, 다른 항체 - 항원 조합이 서로 잘 하나 고정액으로 제대로 작동하지만. (21)이 때문에 변화의, 정착액의 선택은 크게 관심의 단백질 (들)에 따라 달라집니다. 고정의 시간 길이는 크게 면역 염색으로 단백질 (들)의 검출에 영향을 미칠 수 있고, 더 짧은 정착은 항원 성을 유지하기 위해 일반적으로 더 좋다. (57)을 따라서, 특히 불확실 다른 센트로-동원체 단백질의 새로운 타겟 염색 절차를 결정할 때 새로운 항체로 작업 할 때 현지화하거나, 하나는 최적의 조건을 찾기 위해 고정 및 버퍼의 여러 가지 방법을 테스트해야합니다. 본 프로토콜에 인기 휘발 두 종류의 선택 하였다 : 알데히드 고정 제 (프로토콜 2) 및 유기 용제 (프로토콜 3, 4). 고정 제의 순도는 매우 중요합니다. 프로토콜 4 년, 4 % 염소 혈청 especia를 사용에서야 비특이적 백그라운드를 감소시키기 위해 세포 표면의 IgG 수용체를 차단한다. (57)을 일반적으로, 혈청을 일차 항체 무관 바람직 이차 항체와 동일한 종으로부터 종이어야의 IgG 수용체를 차단. 57 본 프로토콜의 각 일차 항체의 선택은 성공적인 면역을 달성 가장 중요한 단계이다. 최대 특이 순도 친화력 및 결합력을 가진 항체가 바람직하다. 단일 클론 항체에 대한 좋은 시작 농도는 일반적으로 1-5 μg의 / ㎖이다. 폴리 클로 날 항체의 재고를 준비 전형적인 희석 1:20 내지 1 범위 :. 500 (57) 하나는 경험적 차 항체의 적절한 농도와 각 시료 희석액을 결정해야한다. 샘플은 부드럽게 누 볐어하지만 균일 한 염색 배양 동안 건조하지해야합니다. 차 항체 및 보조의 배양과 광범위한 세척ntibody 다른 종으로부터의 면역 글로불린과 교차 반응을 방지하기 위해 필요할 수있다. 그러나, 최적의 세척 상태가 반올림하고 (즉, 유사 분열 흔들림 오프)를 흔들 때 분리합니다. 성공을위한 58 세포, 특히 유사 분열 세포의 손실을 방지하기 위해 경험적으로 결정해야 2 차 항체에 결합하기 위해 선택해야합니다 높은 친화력 차 항체. 예를 들어, 비특이적 IgG의 Fc 수용체에 대한 이차 항체의 Fc 부분의 결합을 방지하기 위해, FB (AB &#39;) 2 단편이 아닌 전체 항체에 사용될 수있다. (57)를 많은 이차 항체, 배양 시간은 30 분으로 최소화 될 수있다 RT에서 비특이적 인 배경을 줄일 수 있습니다. 프로토콜 (5) 이외에, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 검출 지역화 및 형광 특성 센트로-동원체 단백질의 기능 해석에 유리할 수있다. 재료 / 산업 장비의 목록에 나타낸 바와 같이NT, 알렉사 플 루어 488와 알렉사 플 루어 594 아마 본 프로토콜에서 가장 자주 사용되는 형광 염료입니다. 샘플 개의 및 / 또는 상이한 센트로-동원체 단백질을 검출하기 위해, 하나 하나의 단백질을 검출하기 위해 사용 된 항체는 상기 제 단백질의 검출을 방해하지 않도록한다. 본 프로토콜에서 57 개의 일차 항체를 혼합하여 적용 동시에. 그러나, 하나는 개별적으로 함께 일차 또는 이차 항체를 적용하기 전에, 각 단백질에 대한 면역 상태를 최적화한다 : 두 단백질 두 센트로-동원체 성분의 경우와 가까운 위치에있는 경우, 하나의 차 항체는 구조적으로 결합하는 것을 방지 할 수있다 두 번째 차 항체. 다른 스펙트럼의 채널로 하나의 염료 &quot;누설&quot;에서 신호를 방지 난이도 : 다중 신호 검출의 또 다른 관심사는 스펙트럼 오버랩 문제이다. 이 문제는 대회에 대한 더 어려워진다알 간섭 필터는 염료의 수가 증가함에 따라 해결 설정하거나 샘플 overenhanced 신호를 포함하는 경우 (예를 들어, 본 연구에서 ACA 또는 항 - 플래그 신호)자가 형광의 간섭을 포함. 형광도의 문제 해결은 다른 연구에서 수행되었다. 본 연구에서 57,59,60, 각 채널에서 단일 레이블 컨트롤 형광 필터 세트를 최적화하는 것은 이러한 문제 (아래 참조)을 피하기 위해 대부분의 경우에 충분하다. 본 각 프로토콜에서, 적절한 컨트롤은 필수적이다. 면역 염색이 시작되기 전에 모든 새로운 차 항체를 특징으로한다. 해당되는 경우 항체의 특이성은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되어야한다. 또, 염색은 세포 표면에 비특이적 결합에 의해 야기되지 않는다는 것을 확인 수득되어야하고, 특히 일차 항체의 최적 농도는 작업 희석액을 사용하여 결정되어야(즉, 결합 곡선이 개발되어야한다). 음성 대조군 (즉, 염색 공정에서 차 항체의 부재)를 포함한다. 대조군의 또 다른 방법은 일차 항체에 대해 동일 종의 IgG 통상의 치환이다. 여러 라벨 검출하기위한 하나의 스펙트럼 중첩 아티팩트 (즉, 블리드 - 스루, 크로스, 크로스 토크를 방지하는 이차 항체 (배경 제어)뿐만 아니라 단일 레이블 제어없이 컨트롤을 제조하거나, 전술 한 바와 같이 &quot;누출&quot;을 염색해야 ). 하나는 올바른 신호 &quot;잘못된&quot;필터를 통해 신호를 비교 계산 모든 제거하려면 다음 비율을 사용하여 &quot;누출&quot;및 실제 유통 및 / 또는 형광 라벨의 공동 현지화를 계산하여 &quot;유출&quot;의 비율을 정량화 할 수있다. (60) 배경 제어 신호 이득의 한계를 설정하는 각 채널에 독립적으로 검사하고 ADA으로 상쇄되어야최종 이미징 pted. 각각의 채널에서 자기 형광도의 레벨이 실질적으로 변화하기 때문에 다중 라벨 샘플의 이미지를 얻기 위해 사용되는 모든 채널은 독립적 인 백그라운드 보정을 실시해야한다. 상기 인접 채널들로 &quot;누설&quot;검출하지 않고, 각 채널의 가능한 신호 이득의 양을 결정하기 위해 요구되는 바와 같이 &quot;유출&quot;제어한다. (60)

&quot;중심절은&quot;고전적인 유전학 억제 감수 재조합의 영역으로 정의하고 나중에 유사 분열시 정확한 염색체 분리에 필수적인 역할을한다 유사 분열 염색체의 주요 수축으로 인식되었다. &quot;Kinetochores&quot;은 전자 현미경에 의해 계시 된, 중심절의 표면에 미세 소관 결합 다층 구조로서 기술 하였다; &quot;kinetochores은&quot;나중에 유사 분열 염색체의 동원체에 지역화 거대 분자 복합체로 정의 하였다. 척추 사이 센트로 DNA 서열의 극적인 차이에도 불구하고, 구조 및 동원체 조성물은 고도로 보존된다. 스핀들 미세 소관과 동원체 사이의 역동적 인 상호 작용은 유사 분열시 염색체의 충실한 분리에 필요한 및 센트로 - 동원체 기능 리드의 결함 이수성하여 암이다. 대부분의 진핵 생물의 센트로어떠한 정의 된 DNA 서열이 없지만 171 bp의 α 위성 DNA로 이루어진 반복 alphoid DNA의 큰 배열 (0.3-5 MB)로 구성된다. 효모 신진 제외 센트로 ID가없는 DNA 서열이 아니라 히스톤 H3 변이체 CenH3 포함 특수 뉴 클레오 좀의 존재에 의해 달성된다 (센트로 단백질을 [CENP-A] 인간). 5 CENP-A의 뉴 클레오는에 지역화 171-bp의 α-위성 DNA에 포유류 kinetochores 7 바인드의 내부 플레이트. 활성 중심절이 필요 CENP-A 함유 함께 스핀들 체크 포인트를 통해 유사 분열 스핀들 및 후속주기 진행에 염색체의 부착을 조절하는 구성 적 센트로 관련 네트워크 (CCAN)과 동원체 단백질의 모집을 지시하는 뉴 클레오합니다. 상기 증거 비추어 CENP-A는 센트로 8 후성 마크 것으로 제안되었다; 그러나, 처리되는 CENP-A는 I을 인용NTO 센트로이 DNA 결합을 담당하는 요소가 아직 특징 화되지 않았다. 짧은 센트로 타겟팅 도메인 (CATD)는 CENP-A의 영역을 배 히스톤에 상주하고 CATD와 H3의 해당 영역의 교체가 센트로에 직접 H3에 충분하다. 9 몇몇 연구는 번역 후를위한 기능적 역할을 제안 수정 CENP-A 12-16의 (PTM) 그러나, 중심절에 모집에서 CENP-A의 이러한 PTMS의 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 우리는 이전에 CUL4A-RBX1 - COPS8 E3 리가 활동이 동원체에 CENP-A의 CENP-A K124의 ubiquitylation 및 지역화를 위해 필요하다고보고했다. (17) 동원체 단백질의 발견 및 특성화 염색체 분리에 관한 새로운 통찰력을 주도하고있다. 18 개의 100보다 동원체 성분을 다양한 방법으로 척추 동물 세포에서 확인되었다. (19, 20) 아래형광 현미경에 kinetochores는 조립과 기능 또한 세포 내의 각 센트로 - 동원체 단백질과 단백질 - 단백질 네트워크의 세포 기능의 특성에서 오는 방법의 서. (19) 직접 시각화 및 고급 이미징 방법은 센트로 - 동원체 구성 요소의 놀라운 해상도를 제공 할 수 중심절과 kinetochores의 특정 분자 구성 요소의 직접 관찰. 또한, 특이 적 항체를 이용하여 간접 면역 형광 방법 (IIF) 염색이 관찰에 중요하다. 그러나, 특정 센트로 - 동원체 단백질의 세부 문제를 논의 IIF 프로토콜, 몇 가지에 대한 수많은 보고서에도 불구하고. 1-4 따라서, 개발하고 특히 각 센트로 - 동원체 단백질을 분석하는 IIF 염색 및 정량 IIF 분석의 방법을보고하는 것은 매우 중요합니다. IIF 염색에서, 하나의 관심 단백질의 손실을 방지하기 위해 염색 프로토콜을 진행해야하거나셀의 나머지. 그러나 고정 가끔 항원 사이트를 파괴하고, 다른 항체 - 항원 조합은 하나의 정착과 함께 제대로 작동하지만 아주 잘 다른, 21, 정착액의 선택에 크게 관심의 단백질 (들)에 따라 달라집니다. 따라서, 다른 정착 방법은 센트로 - 동원체 단백질의 IIF 염색에서 중요하다. 간접 면역 형광 (IIF) 염색 및 CENP-A와 국기 태그가 외생 CENP-A 단백질, 인간 세포에서이 단백질의 정량을 포함하여 내인성 센트로 - 동원체 단백질의 현지화를 해결하기 위해 분석의 여기에 최적화 된 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 다른 종 센트로-동원체 단백질의 분석에 적용될 수있다.

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

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Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

내생의 면역 형광 분석 및 외인성 센트로 - 동원체 단백질

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

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Nanyang Technological University

Research

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Biology

15.1K 조회수.  Nationwide Children's Hospital. Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

풀다운 Calmodulin 결합 단백질의

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain slices and neuronal cell cultures. Recently, this technology has been applied to the whole organs. Advances in sensor design have made &#160;possible the measuring of&#160;cell signaling in blood-perfused in vivo kidneys. The present protocols list the steps needed to measure ATP and H2O2 signaling in the rat kidney interstitium. Two separate sensor designs are used for the ex vivo and in vivo protocols. Both types of sensor&#160;are coated with&#160;a thin enzymatic biolayer on top of a permselectivity layer to give fast responding, sensitive and selective biosensors. The permselectivity layer protects the signal from the interferents in biological tissue, and the enzymatic layer utilizes&#160;the sequential catalytic reaction of glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase in the presence of ATP to produce H2O2. The set of sensors used for the ex vivo studies further detected analyte by oxidation of H2O2 on a platinum/iridium (Pt-Ir) wire electrode. The sensors for the&#160;in vivo studies are instead based on the reduction of H2O2 on a mediator coated gold electrode designed for blood-perfused tissue. Final concentration changes&#160;are detected by real-time amperometry followed by calibration to known concentrations of analyte. Additionally, the specificity of the amperometric signal can be confirmed by the addition of enzymes such as catalase and apyrase that break down H2O2 and ATP correspondingly. These sensors also rely heavily on accurate calibrations before and after each experiment. The following two protocols establish the study of real-time detection of ATP and H2O2 in kidney tissues, and can be further modified to extend the described method for use in other biological preparations or whole organs.

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

효소 바이오 센서의 사용은 내인성 ATP 또는 H를 정량화하기<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; 신장에

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

고대 생물 커뮤니티 숨겨 내부를 조사하기 위해 냉동 코어의 바깥 부분에서 외인성 물질의 제거

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...