この作品は、NIHの助成金GM68418によってサポートされていました。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

近年では多くの研究が固定された細胞のための異なる定量的な顕微鏡アッセイを開発した。42セントロメア動原体の生物学の進歩は、多くの場合、細胞内の空間的・時間的規制はの変更機能を反映するのタンパク質のセントロメア特異的または動原体特異的な機能を理解する必要があります細胞周期の間に、これらのタンパク質。そこで、ここではIIF染色、具体的に異なって処理されたサンプルで適用することができる内因性および外因性のCENP-A蛋白質の相対レベルを、分析するための定量的IIFアッセイの方法を開発しました。現在、我々はこの研究でプロトコル2を使用して、内因性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1、およびSka1の成功IIF染色を達成した（新倉ら 24と示されていないデータを参照してください;抗体の情報のための材料/機器のリスト） 。将来的には、1は、（異なるセントロメア動原体タンパク質のレベルを定量化するために、両方のendogを同じ方法を適用することができます特異的な抗体を選択）enousおよびFLAGタグ外因性タンパク質は、しかし、私たちのIIFの方法は、生細胞内または細胞全体のサイクル中に、特定の単一の細胞におけるこれらのタンパク質の検出をカバーしていません。これらの手順は、別個のカバーガラス上に固定し、処理対象の細胞を必要とするため、我々はかなり異なる試料間の信号を比較し、分析の精度を高めるために正規化の目的のための基準信号（ 例えば 、ACAまたはCENP-B）を導入しました。 ACAは、内因性および/または外因性のCENP-A信号を伴うため、正規化の目的のための基準信号としてCENP-Bは、ACAは、CENP-A信号の定量分析の精度の点でするよりも比較のために、より適切であろう。 CENP-Bのアミノ末端領域は、アルフォイドDNA中のCENP-Bボックス配列の17-bpのモチーフに結合し、CENP-Bのカルボキシ末端領域は、ホモ二量体を形成している。43,44 CENP-Bは完全に共局在していませんCENP-Aおよび/または他のCENTRとomere-動原体タンパク質は、しかし、密接にそれらに関連している。45抗CENP-C抗体を用いた免疫蛍光法は、典型的には、2つの別個のスポットを与える一方で、抗CENP-Bでの染色は、多くの場合、両方の姉妹動原体を接続する単一の明るいバーとして表示されます。46しかし、我々のマクロスケールの顕微鏡観察では、いくつかのCENP-B信号は、明らかに観察角度及び使用固定液の種類に応じて、また部分的に、特に以前の有糸分裂期（後期中期より前期・中期）で、CENP-A信号と重なります（データは示さず）。セントロメア-動原体タンパク質のほとんどの局在が依存するが、これとは対照的に、CENP-A信号の定量的IIFアッセイにおいて、基準信号のタンパク質の局在は、枯渇および/または公正な分析のためのCENP-Aの機能不全によって影響されるべきではありませんセントロメアでCENP-ローカライズ。47,48 CENP-A-独立した動原体アセンブリは、CENPのDNA結合領域を置換することによって確立されます異所性の遺伝子座にこれらのタンパク質を募集代替染色体ターゲティングドメインを有する-CおよびCENP-T。また49,50は 、最近の研究では、内側動原体成分CENP-Cと並列にCENP-Tの行為はにKMNネットワークを募集することが示されました動原体。51-54また、西野らは、標準的なヌクレオソームタンパク質を越えて「ヒストンコード」を拡張する、DNAとの接触を生成するために、CENP-TWSX複雑なフォームことをユニークなヌクレオソーム様構造を示唆した。55 CENP-のセントロメア局在ので、 Cは、CENP-Aのセントロメア局在に依存している47,48 CENP-TWSXまたは特にCENP-Tは、CENP-Aの定量IIFアッセイで基準信号を提供するために、別のタンパク質候補（複数可）である可能性があります。しかし、リファレンスシグナルの候補を慎重にセントロメアに局在はCENP-Aの枯渇および/または機能不全によって影響されるかどうかを決定するためのアッセイの前にテストする必要があります。類似の考慮他のセントロメア-動原体タンパク質の定量IIFアッセイのために取られるべきである：基準信号のタンパク質の局在が枯渇および/または公正な分析のための標的タンパク質の機能不全によって影響されるべきではありません。以前の研究では、他の中央外側動原体タンパク質の定量IIFアッセイのための基準信号としてACAを使用する。ACA場合24 ACAは、位置制御としてだけでなく、基準信号の単一CENP-Bよりも適切なオプションかもしれません上記のように信号がCENP-Bを有する標的タンパク質の枯渇および/または標的タンパク質の機能不全が、共局在化に影響されないことは悪いです。 Bodorのら 。動原体CENP-Aレベルは、動原体CENP-Aの量は、細胞内含有量に直接比例して変化する、すなわち質量作用によって調節されていることを報告した。56彼らはまた、CENP-expressionの過渡誘導がでプロンプト増加につながることを示しました動原体CENP-レベル。逆に、我々はCA-UTRのsiRNA（UTRのsiRNAの5 &#39;および3&#39;の混合物; 表1）とpTRM4発現ベクターの同時トランスフェクション後にセントロメア局在、Flagタグ付きCENP-WTを持つ大規模な細胞集団を観察した（データではありません示されています）;この集団は、pTRM4発現ベクターでのトランスフェクション後に見られるものよりも大きかったです。その発現pTRM4によって駆動された外因性Flag標識CENP-Aタンパク質のレベルは、内因性のCENP-Aよりも高い大きさ（10〜25倍）の約1.0〜1.4のオーダーであった（データは示さず）。特定のしきい値以上の外因性のCENP-WTの発現に悪影響をその適切な動原体局在化に影響を与える可能性があると推測されます。 現在のプロトコルでは、固定は、天然の状態にできるだけ近位の状況として細胞構造や環境を維持するための重要なステップです。細胞が固定されると、一方がINTEのタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきです休息やセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし。21このため変動により、固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。固定の時間長を大幅に免疫染色することによりタンパク質の検出に影響を与えることができ、短い固定は、抗原性を保持するために、一般的に良好である。57したがって、他のセントロメア、動原体タンパク質の新しい標的についての染色手順を決定する際に、特に不明の新しい抗体とローカリゼーション、または作業する場合、1が最適条件を見つけるために、固定およびバッファのいくつかの方法をテストする必要があります。現在のプロトコルでは、人気の固定剤の二つのクラスを選択した：アルデヒド固定液（プロトコル2）と有機溶剤（プロトコル3および4）。固定剤の純度も非常に重要です。プロトコル4で、4％ヤギ血清をespecia使用されLLY非特異的バックグラウンドを低減するために、細胞表面上のIgG受容体をブロックするために57の一般的に、血清を一次抗体とは無関係の、好ましくは二次抗体と同じ種から種であるべきであるのIgG受容体を遮断する。57 現在の各プロトコルでは、一次抗体の選択は成功した免疫染色を達成する上で最も重要なステップです。最大の特異性、純度、親和性、および結合活性を有する抗体が望ましいです。モノクローナル抗体のための良い出発濃度は、通常1-5 / mlのです。ポリクローナル抗体の原料調製の典型的な希釈は1時20分から1までの範囲：500 57 One経験的に一次抗体の適切な濃度と各サンプルの希釈剤を決定する必要があります。サンプルは穏やかに揺り動かしたが、均一な染色のためのインキュベーション中に乾燥しないようにする必要があります。一次抗体および二次αのインキュベーションの間に大規模な洗浄ntibodyは、他の種由来の免疫グロブリンとの交差反応を回避するために必要とされ得ます。しかし、最適な洗浄条件は、振とうしたときに丸めると切り離し特に有糸分裂細胞（ すなわち 、有糸分裂シェイクオフ）、細胞の喪失を回避するために、経験的に決定されなければならない。成功のための58、二次抗体は、に結合するように選択されなければなりません高い親和性を有する一次抗体。例えば、IgGのFc受容体への二次抗体のFc部分の非特異的結合を回避するために、FB（ab &#39;）2断片は抗体全体の代わりに使用することができる。多くの二次抗体、インキュベーション時間57は 30分に最小化することができます室温で非特異的バックグラウンドを減少させます。 プロトコル5に加えて、レーザー走査共焦点顕微鏡は、検出及び局在および蛍光特性を有するセントロメア、動原体タンパク質の機能を分析するのに有利であり得ます。材料/ Equipmeの一覧に示すように、NT、アレクサフルオロ488およびAlexaフルーア594は、おそらく現在のプロトコルの中で最も頻繁に使用される蛍光色素です。サンプルで2および/ ​​または複数の異なるセントロメア-動原体タンパク質を検出するために、1は、一つのタンパク質を検出するために使用される抗体は、第二のタンパク質の検出を妨げないようにする必要があります。現在のプロトコルでは57を 、2次抗体を混合して適用されます同時に。しかし、一つは一次または二次抗体を一緒に適用する前に、別々に各タンパク質についての免疫染色条件を最適化すべきである：二つのタンパク質は、2つのセントロメア、動原体成分の場合のように近接している場合、一次抗体は、構造の結合を防止することができます二次抗体。別のスペクトルチャネルに1色素」漏れ」からの信号を防止することが困難：複数の信号検出のもう一つの懸念は、スペクトルの重複の問題です。この問題は、大会のために、より困難になりますアル干渉フィルタは、染料の数が増加するとして、またはサンプルが自家蛍光の干渉を含むoverenhanced信号（ 例えば 、ACAまたは本研究における抗Flag信号）を、含まれている場合、解決するために設定します。自己蛍光のトラブルシューティング他の研究で行われてきた。本研究では57,59,60、各チャネルの単一ラベルコントロールと蛍光フィルターセットを最適化する（下記参照）、これらの問題を回避するために、ほとんどの場合十分です。 現在の各プロトコルで、適切なコントロールが不可欠です。免疫染色を開始する前に、すべての新しい一次抗体を特徴付けする必要があります。該当する場合、抗体の特異性は、ウェスタンブロット分析によって確認されるべきです。また、染色が細胞表面に非特異的結合によって引き起こされていないことの確認が得られるべきであり、特定の一次抗体の最適な作業用濃度は、連続希釈の使用を介して決定されるべきです（ すなわち 、結合曲線が開発されるべきです）。ネガティブコントロール（ すなわち 、染色プロセスからの一次抗体の非存在下）が含まれるべきです。ネガティブコントロールの別のオプションは、一次抗体のための同じ種からの正常IgGの置換です。上記のように複数のラベルの検出のために」、漏れ」、1は、スペクトル重複アーティファクト（ すなわち 、ブリードスルー、クロスオーバー、クロストークを回避するために、二次抗体（バックグラウンドコントロール）と同様に単一ラベルのコントロールなしでコントロールを準備する必要があります、または染料）。一つは「漏出」と実際の分布および/ ​​または蛍光標識の共局在を計算する計算すべて除去するために、これらの比率を使用して、正しい信号が「間違った」フィルタを介して信号を比較することにより、「漏洩」の割合を定量化することができる。60バックグラウンドコントロールは、信号利得の制限を設定するには、各チャンネルに独立して調査し、ADAであることをオフセットする必要があります最終的なイメージングのためにPTED。各チャネルの自己蛍光のレベルが実質的に変化するため、複数のラベルサンプルの画像を取得するために使用されるすべてのチャンネルは、独立したバックグラウンド補正されなければなりません。上記のように制御を「漏洩」は、隣接チャネルへの「漏出」を検出することなく、各チャネルの可能な信号利得の量を決定するために必要とされる。60

「セントロメア」は、古典的遺伝学の抑制減数分裂期組換えの領域として定義され、それ以降の有糸分裂の間に正確な染色体の分離において重要な役割を果たしている有糸分裂染色体の一次狭窄、として認識されました。 「動原体」は、電子顕微鏡によって明らかにされるように、動原体の表面に微小管に結合した多層構造として説明しました。 「動原体」は、後に、有糸分裂の染色体のセントロメアに局在高分子複合体として定義されていました。脊椎動物の中で動原体DNA配列の劇的な相違にもかかわらず、動原体の構造および組成は、高度に保存されています。スピンドル微小管と動原体の間の動的相互作用は、忠実な有糸分裂時の染色体の分離、および異数性およびそれによって癌にセン​​トロメア動原体機能のリードの欠陥のために必要とされます。 ほとんどの真核生物におけるセントロメア何も定義されたDNA配列を持っていませんが、171-bpのαサテライトDNAからなる反復アルフォイドDNAの大規模な配列（0.3-5 MB）で構成されています。出芽酵母を除いて、セントロメアのアイデンティティはないDNA配列ではなく、ヒストンH3バリアントCenH3（ヒトにおけるセントロメアプロテインA [CENP-A]）を含む特別なヌクレオソームの存在によって達成される。5 CENP-Aヌクレオソームがに局在します171-bpのαサテライトDNAに対する哺乳動物動原体7と結合するのインナープレート。アクティブ動原体は、一緒に紡錘体チェックポイントを介して紡錘体とそれに続く周期の進行に染色体の付着を調節する構成的セントロメア関連するネットワーク（CCAN）の動員および動原体タンパク質を、指示するためにCENP-Aを含むヌクレオソームが必要です。 上記の証拠に照らして、CENP-Aはセントロメア8のエピジェネティックなマークであることが提案されています。しかしながら、CENP-Aが組み込まれたプロセスは、私NtoのセントロメアDNAと、この取り込みを担当する要因はまだ十分に特徴付けられていません。ショートセントロメア標的化ドメイン（CATD）は、CENP-Aの領域に折り畳むヒストンに常駐し、CATDとH3の対応する領域の交換が動原体への直接H3に十分なものである。9いくつかの研究は、翻訳後のための機能的役割を示唆しましたCENP-12-16の変更（PTM）。しかし、動原体への動員においてCENP-AのこれらのPTMの分子メカニズムはまだ解明されていません。我々は以前CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼ活性が動原体にCENP-AのCENP-A K124のユビキチン化およびローカライズのために必要とされていることを報告した。17 動原体タンパク質の発見および特徴付けは、染色体分離に関する新たな知見をもたらしている。18 100以上の動原体の構成要素は様々なアプローチによって、脊椎動物細胞で同定されている。19,20の下で動原体が集合し、機能はまた、細胞内の各セントロメア-動原体タンパク質の細胞機能の特性評価およびタンパク質間ネットワークから来ている。19直接可視化し、蛍光顕微鏡での高度な画像処理方法が動原体動原体の構成要素の著しい分解能を提供し、許可する方法のスタンディングセントロメアと動原体の特定の分子成分の直接観察。また、特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法（IIF）染色は、これらの観​​測に不可欠です。しかし、IIFプロトコルに関する多くの報告にもかかわらず、特定のセントロメア-動原体タンパク質の詳細な問題に議論少数。1-4はこのように、開発と特異的に各セントロメア動原体タンパク質を分析するIIF染色および定量IIFアッセイの方法を報告することは非常に重要です。 IIF染色では、一つの目的のタンパク質の損失を回避するために、染色プロトコルを進めるべきですかセルの残りの部分。しかし、固定は時折抗原部位を破壊し、異なる抗体-抗原の組み合わせは、他と非常によく1固定液で十分に機能しない、しかし、21および固定剤の選択は、目的のタンパク質（複数可）に大きく依存します。したがって、異なる固定液法が動原体動原体タンパク質のIIF染色で重要です。 間接免疫蛍光（IIF）染色およびCENP-AおよびFLAGタグ外因性のCENP-A蛋白質、およびヒト細胞におけるこれらのタンパク質の定量を含む内因性のセントロメア-動原体タンパク質の局在化に対処するためのアッセイのここで最適化された方法が開発されています。これらの方法は、他の種におけるセントロメア、動原体タンパク質の分析に適用することができます。

immunofluorescence analysis of endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

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Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

15.1K ビュー.  Nationwide Children's Hospital. Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells. While fluorescent 
proteins such as green fluorescence protein (GFP) have been extensively used as fusion partners to proteins to track the properties of a protein of interest1, recent 
developments with smaller tags enable new functionalities of proteins to be examined in cells such as conformational change and protein-association 2, 3. One small 
tag system involves a tetracysteine motif (CCXXCC) genetically inserted into a target protein, which binds to biarsenical dyes, ReAsH (red fluorescent) and FlAsH 
(green fluorescent), with high specificity even in live cells 2. The TC/biarsenical dye system offers far less steric constraints to the host protein than 
fluorescent proteins which has enabled several new approaches to measure conformational change and protein-protein interactions 4-7. We recently developed 
a novel application of TC tags as sensors of oligomerization in cells expressing mutant huntingtin, which when mutated aggregates in neurons in Huntington 
disease 7. Huntingtin was tagged with two fluorescent dyes, one a fluorescent protein to track protein location, and the second a TC tag which only 
binds biarsenical dyes in monomers. Hence, changes in colocalization between protein and biarsenical dye reactivity enabled submicroscopic oligomer 
content to be spatially mapped within cells. Here, we describe how to label TC-tagged proteins fused to a fluorescent protein (Cherry, GFP or CFP) 
with FlAsH or ReAsH in live mammalian cells and how to quantify the two color fluorescence (Cherry/FlAsH, CFP/FlAsH or GFP/ReAsH combinations).

The biarsenical dyes FlAsH and ReAsH bind specifically to tetracysteine motifs in proteins and can selectively label proteins in live cells. Recently this labeling strategy has been used to develop sensors for different protein conformations or oligomeric states. We describe the labeling approach and methods to quantitatively analyze binding.

ReAsH /フラッシュラベルと細胞におけるテトラセンサータンパク質の画像解析

Fluorescent proteins and dyes are essential tools for the study of protein trafficking, localization and function in cells.  While fluorescent 
proteins ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain slices and neuronal cell cultures. Recently, this technology has been applied to the whole organs. Advances in sensor design have made &#160;possible the measuring of&#160;cell signaling in blood-perfused in vivo kidneys. The present protocols list the steps needed to measure ATP and H2O2 signaling in the rat kidney interstitium. Two separate sensor designs are used for the ex vivo and in vivo protocols. Both types of sensor&#160;are coated with&#160;a thin enzymatic biolayer on top of a permselectivity layer to give fast responding, sensitive and selective biosensors. The permselectivity layer protects the signal from the interferents in biological tissue, and the enzymatic layer utilizes&#160;the sequential catalytic reaction of glycerol kinase and glycerol-3-phosphate oxidase in the presence of ATP to produce H2O2. The set of sensors used for the ex vivo studies further detected analyte by oxidation of H2O2 on a platinum/iridium (Pt-Ir) wire electrode. The sensors for the&#160;in vivo studies are instead based on the reduction of H2O2 on a mediator coated gold electrode designed for blood-perfused tissue. Final concentration changes&#160;are detected by real-time amperometry followed by calibration to known concentrations of analyte. Additionally, the specificity of the amperometric signal can be confirmed by the addition of enzymes such as catalase and apyrase that break down H2O2 and ATP correspondingly. These sensors also rely heavily on accurate calibrations before and after each experiment. The following two protocols establish the study of real-time detection of ATP and H2O2 in kidney tissues, and can be further modified to extend the described method for use in other biological preparations or whole organs.

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

酵素バイオセンサの使用は、内因性ATPまたはHを定量します<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;腎臓で

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. A protocol is presented to collect and decontaminate permafrost cores of soils and ice. The absence of exogenous colonies and DNA suggest that microorganisms detected represent the material, rather than contamination from drilling or processing.

古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...