This work was supported by ERC starting grants (ERC-2011-StG 280255 and ERC-2013-StG 337479) and by the Netherlands Organization for Health Research and Development (Vidi 91713319).

<ol>
	<li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo:+basis+of+biosensor+construction,+live+imaging,+and+image+processing.">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. 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The authors have nothing to disclose.

여기서 우리는 살아있는 세포에서 담즙산 수송 시공간 역학을 모니터링 할 수있는 새로운 유전자 부호화 담즙산 센서의 사용을 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 바이오 센서함으로써 FRET 기반 담즙산 센서 (BAS)을 형성 FXR-LBD 융합되어 하늘색 및 황 형광 단백질로 구성되어있다. 세포 배양 및 FACS 또는 (공 초점) 현미경 기본적인 경험을 가지고 할 때 담즙 산성 센서는 사용이 비교적 간단하고 편리합니다. 그러나 일부 측면은 몇 가지 문제가 촬영이 필요할 수 있습니다. 담즙산 수송 체와 조합 담즙산 센서를 이용하면, 숯 여과 혈청 배지에서 배양 된 세포에 권장된다. 목탄은 추가 혈청에서 흡착 담즙산 농도를 감소시킨다. 이 둔감 센서의 가장 흔한 원인이기 때문에 특히 NTCP 수입 등의 존재하에,이 배양 동안 센서의 포화를 방지하는 것이 중요실험 중. 따라서, 다른 센서는 더 큰 동적 범위 (8)을 생성, 담즙산의 감도를 변경 돌연변이를 포함 (NucleoBAS N354K / I372V)를 만들었습니다. 이들 세포는 저 세포 내 담즙산 농도를 갖는 것으로 가정되기 때문에, 센서가 이미 포화되어 있는지 여부를 정의하기 위해, 황 / 하늘색 비는하지 않음 담즙산 수송 체를 발현하는 대조군 세포의 비율과 비교 될 수있다. 대안 적으로, 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 측정 강도에 독립적 인 방식으로 12 FRET을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 이 기술은이 문서의 범위를 넘어,보다 전문적인 장비를 필요로한다. 둔감 센서에 대한 다른 이유는 자동 - 형광 및 / 또는 발현을 NucleoBAS 잃은 세포의 사용을 포함한다. 참고로, 실험 기간 동안 (예를 들어 의한 초점의 변화에​​) 하늘색과 황수정의 강도의 변동은 있지만, 이미징 동안 FRET 변화의 직접 시각화를 모호 할 수 있습니다센서의 비율 적 성질은 여전히​​ 담즙산 역학의 모니터링을 허용한다. 비율의 증가가 분명 동안 종종 절대 강도 변화는, FXR 리간드의 첨가시 개별 형광체 완만하다. BAS 센서로 형질 세포 FRET 분석을 위해 적절한 레이저 광 필터가 선택되어야한다. FRET 동안 황수정 강도의 증가는 450-520 (하늘색)와 520-580 (황수정)를 통해 모니터링 배출량 바이올렛 다이오드 (405 ㎚) 레이저로 측정 할 수있다. 고려해야 할 중요한 점은 광표백에 대한 센서의 감도이다. 하나 또는 둘의 형광 강도가 서서히 리간드의 첨가없이 시간에 감소 할 때, 종종 광표백을 나타낸다. 레이저 파워가 너무 높은 경우에는 이러한 현상이 주로 발생한다. 이러한 원치 않는 효과를 방지하기 위해, 레이저 전력은 전체 전력의 5 %를 초과하지 않아야하고 세포를 최대한 어두운 유지되어야한다. 제한시간은 바로 세포를 검색합니다. 형광 강도의 변동은, Z 축에 초점 드리프트에 의해 발생 될 수있다. 이에 대응하기 위해 핀홀 크기는 증가 될 수 있으며, 셀 경계에 매우 근접하지 로아를 그리는 것이 바람직하다. 담즙산의 FRET 센서는 형질 전환과 안정적인 표현형이 될 수있는 여러 세포 유형 (U2OS, Huh7, 인 HepG2, H69, MDCK 및 HEK293T 세포)에서 테스트되었습니다. 그러나, 1 차 간세포와 분화 된 세포는 형질과 특성의 관점에서 안정한 유지하기 어렵다. 바이러스 성 전달이 어려운 트랜 세포 (요청 구성)에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 현재 급속하게 분리시 탈분화 갓 절연 일차 전지에 센서의 사용을 허용하기 위해 마우스 선을 생성한다. 설명 촛점 실험을 수행하기 위해, 선택된 세포주 배양 접시에 부착하는 것이 필수적이다이고 SI에서 자란다ngle 세포 층. 그러나, 현탁액, 또는 오히려 쉽게 트립신 접착 세포 수의 세포 성장은 또한 FACS를 이용하여 측정 할 수있다. 마지막으로,이 특정 전송 경로를 분석 할 때, 내인성 담즙산 수송 또는 합성없는 세포주를 선택하도록 의뢰한다. 즉, 특정 형질 (돌연변이) 수송 단백질의 활성을 측정 할 때. 제시된 유전자 인코딩 형광 바이오 센서는 단일 BAS 생균 담즙산 수송 모니터링 유용한 도구이다. BAS는 담즙산 (8)의 세포 내 역학의 이미징을 허용, 담즙산의 큰 다양성에 의해 활성화되는 FXR-LBD가 포함되어 있습니다. 이것은 다른 기술의 이용과 관련하여 큰 이점을 제공한다. 예를 들어, 프로모터 구동 루시페라아제 리포터 분석법에, 루시 페라 제는 세포 내 신호 정보를 지원하지 않는, 세포 내의 리포터의 안정성에 의존하고, 시료의 파괴​​를 필요 <s&gt; 13까지. 담즙산 수송을 측정하는 또 다른 방법은 형광 또는 방사성 표지 된 리간드를 사용하는 것이다. 그러나, 담즙산의 형광 표식은 담즙산 수송 속도론을 변경할 수 있으며, 방사성 표지 담즙산의 유용성이 제한된다. 또한, 담즙산 수송 체, 및 특정 셀룰러​​ 유입 담즙산 유출의 식을 조합 한 센서는 해결 될 수있다. TCDCA 운송 활동에 대한 통찰력을 제공과 같은 예를 들어, 복합 담즙산의 세포 내 수준을 증가했다. 이것은 또한 가능 분자 또는 화합물 억제제 스크린을 사용하여, 또는 다른 FXR 리간드의 효과를 검토하여 예를 들면 특정 경로, 간섭 후의 담즙산 수송에 미치는 영향을 조사하기 BAS를 사용하는 것을 가능하게한다. 마지막으로, 센서의 또 다른 애플리케이션은 세포막 컨베이어 식 FXR 및 활성화의 예 이미징, 정량 분석​​ 또는 단백질의 위치 파악을위한 다른 형광 단백질과 결합되고동일한 셀.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 2 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 3 생활에 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 4를 대상으로한다. 세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히​​ 저조한 이​​해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된 담즙산 또는 형광 담즙산 유사체의 사용을 모니터링한다. 후자는 아마도 자신의 특성에 영향을 미치는 담즙산의 수정을 필요로한다. 루시 페라 기반 기자는 가난한 시간 해상도를 가지고있다. 또한,이 기술은 시료의 손실이 발생할 및 단일 세포 이미징을위한 적용되지 않습니다. 따라서,이 비율 적 검출 5, 6의 장점을 포함하고, 특히 이후 FRET 바이오 센서를 이용하여 전송 활동의 실시간 단일 세포 이미징을 허용 방법을 사용하는 것이 유익 할 것이다. 반면 CF의 변형P / YFP 형태는 가장 자주 FRET 쌍, 적색 편이 담즙산 센서 (7)을 포함한 새로운 센서와 FRET 도구 상자의 확장을 주도 자기 협회 유발 돌연변이를 들고 mOrange 및 mCherry를 사용하여 새로운 전략을 사용했다. 우리는 이전에 farnesoid X 수용체 (FXR) 리간드 결합 도메인과 융합 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정)로 구성된 유전자 인코딩 FRET 담즙산 센서 (BAS)을 생성 (FXR-LBD) 및 펩티드 LXXLL 모티브 (8)를 포함. 담즙산 의존적으로 FXR-LBD이 펩티드 어소. FXR 활성화되면, 황수정과 하늘색 사이의 거리가 구조적 변화로 인해 변경됩니다. 포유 동물 세포주에서, 황 / 세룰 리안 비율 명확히 검출 가능한 증가 FXR 활성화 결과, 정제 된 센서는 반대 방향으로 작동하고 FXR 활성화시 FRET 비율 감소에 이르게한다. 이 센서 (CytoBAS)세포질 담즙산 역학의 모니터링을 할 수 있습니다. 세포 내 표적 모티프의 카복실 말단을 첨가하여, BAS 구조체는 다른 세포 구획에서 담즙산 농도의 측정을 허용하는, 핵 (NucleoBAS) 및 퍼 옥시 솜 (PeroxiBAS)을 타겟으로 할 수있다. 퍼 옥시 솜 타겟팅 모티브의 추가가 담즙산에의 대응 성을 손상하지 않지만, 세포 투과성 FXR - 리간드는이 퍼 옥시 솜 (8) 내부 PeroxiBAS의 변화를 FRET 유도하지 않았다. 이 차이의 특성을 알 수있는 바와 같이, 프로토콜은 다음과 CytoBAS NucleoBAS에 집중된다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서의 사용은 최근 간 담즙산 수송 + / 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (NTCP) 나 유기 용질 수송 알파 / 베타 (OSTαβ)를 8 함유 세포에서 증명되었다. NTCP는 주 간 담즙산 수입하고 OSTαβ는 기저 장 담즙입니다전기 담즙산 농도 구배 (9), (10)에 따라 수입과 수출 모두 작동 할 수 있습니다 산 수송. 최근의 데이터는 NTCP 및 / 또는 OSTαβ 의한 담즙산 수송시 리간드 FXR-LBD 상호 작용의 결과로서 FRET 비율 견고하고 빠른 응답이 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 여기, 우리는 이러한 공 초점 현미경 분석 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)와 같은 FRET을 측정하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명하는 중요한 단계를 강조, 잠재적 인 문제를 해결하고 다른 방법에 대해 설명합니다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서를 이용하여, FXR-LBD와 담즙산 상호 작용은 정량 및 살아있는 세포에 직접 모니터링하고 실시간으로 담즙산 수송 및 역학을 가시화 신속하고 간단한 방법을 제공 할 수있다. CytoBAS NucleoBAS를 인코딩 및 포유류 발현 플라스미드는 시판되고있다. 따라서,이 바이오 센서는, 상기에 기여담즙산 수송 또는 FXR을 활성화하고 담즙산 생물학 및 시그널링에 대한 깊은 통찰력을 제공하는 화합물의 이해.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="867">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CytoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right" style="width:145px;">62860</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoBAS&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Addgene</td>
			<td align="right">62861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Dulbecco&#39;s modified Eagles media (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td>High glucose without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Penicillin-Streptomycin (pen/strep)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">102-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Trypsin-EDTA (10x)</td>
			<td style="width:173px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-25 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0253</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">T-175 cell culture flask</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0238</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">6-well plate</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">734-0229</td>
			<td>Poly-L-lysine and Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">10cm dish</td>
			<td style="width:173px;">VWR international</td>
			<td style="width:145px;">392-0243</td>
			<td>Laminin coated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D9885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Polyethylenimine (PEI)&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Brunschwig</td>
			<td style="width:145px;">23966-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">G418 (geneticin) 50 mg/ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10131-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Hygromycin B, 50 mg / ml</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Cloning cylinder (6x8 mm)</td>
			<td style="width:173px;">Bellco</td>
			<td style="width:145px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">L-15 Leibovitz culture medium</td>
			<td style="width:173px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">21083-027</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:300px;">Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td style="width:145px;">352008</td>
			<td>No cap, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Falcon 2063 tubes (5 ml)</td>
			<td style="width:173px;">Falcon BD</td>
			<td align="right" style="width:145px;">352063</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Nunc Lab-Tek 8 well coverglass</td>
			<td style="width:173px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:145px;">155409</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Charcoal-filtered FBS</td>
			<td style="width:173px;">Life technologies</td>
			<td style="width:145px;">12676011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">GW4064</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G5172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">TCDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T6260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">CDCA</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">C9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Other chemicals</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">n.v.t.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time monitoring of intracellular bile acid dynamics using a genetically encoded fret-based bile acid sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

제시된 FRET-BAS 센서는 두 형광 황수정과 하늘색)과 LXXLL 모티브에 부착 FXR (LBD-FXR)의 도메인을 결합 리간드를 기반으로합니다. 이 센서는 높은 공간 및 시간 해상도 (도 1)와 살아있는 세포에서 담즙산 수송으로 조사 할 수있다. 하늘색 및 황에서 돌연변이는 분자 복합체 (도 1 B)의 형성을 촉진하기 위해 적용 하였다. 담즙산과 다른 FXR FXR 리간드에 결합함으로써, 형태 변화에 의해 황 및 하늘색 사이의 거리를 변경. 포유 동물 세포를 살아있는, 이는 증가 된 FRET 효율성 (황 증가, 감소 하늘색) (도 1 C, D (1))을 초래한다. 공 초점 현미경으로 살아있는 세포 양적 강도 기반의 FRET 실험 동안, 나는T는 평균 황수정 / 하늘색 비율이 GW4064 (5 μm의) (그림 치료 후 현저하게 증가 하였다 taurochenodeoxycholic 산 (TCDCA가), FRET의 모든 변경 사항을 표시하지 않습니다 담즙산 수송 부족한 NucleoBAS을 표현 (30 μM) U2OS 세포를 처리 한 것으로 관찰되었다 1 C). 반면, 공동 발현 NucleoBAS을 NTCP와 OSTαβ이 TCDCA의 추가시 황수정 / 하늘색 비율 명확한 증가 및 GW4064의 추가 (그림 1 D) 후 비율에 더 큰 증가를 보여 주 었는가 세포를 U2OS. 이것은 TCDCA는 세포막을 통과 할 수없는 셀을 입력 특정 수송차 필요함 보여준다. 센서의 셀룰러 지역화 특정 위치 파악 신호들의 존재에 의해 결정된다. NucleoBAS 그림 (핵 지역화 신호에 의해 핵를 대상으로 &lt;강한&gt; 2 B), CytoBAS 어떤 지역화 신호를 포함하기 때문에 세포질 (그림 2)에 남아 있지 않지만. 바이오 센서는 또한 동일한 셀에서 단백질 발현 / 지역화 FXR 및 활성화의 측정을 가능하게 다른 형광 단백질의 이미징과 결합 될 수있다. 예를 들어, 그림 2 C는 U2OS 세포가 NucleoBAS과 NTCP-mKate2와 공동 형질 전환을 보여줍니다. 또한, 센서는 동시에 하나 이상의 매개 변수의 세포 내 이미징을위한 센서와 결합 될 수있다. 예를 들어,이 NucleoBAS TGR5 (EST 클론 IMAGE 번호 5,221,127)과 동시에 동일한 셀 TGR5 FXR 및 활성화를 측정 된 cAMP의 세포질 센서 (T EPAC VV) (11)와 함께 나타내었다. 핵에 FXR의 활성화가 마주 동안 TGR5 결합시, 캠프 수준, 캠프 센서에 의해 감지 된 세포질 증가동시에 ualized.도 2D-F &#160; GW4064 (5 μM) (도 2 D)로 처리 한 후 NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 셀 6 공 촛점 이미지 이루어지는 시계열을 보여 TCDCA (10 μM) (도 2 E) 또는 체노 콜린 산 (CDCA) (10 μM) t = 0으로 그린 색 (cAMP를 상승을 나타내는) 450분의 525 nm의 발광 비율이 감소되는 영역을 나타내고, 핑크 색상에서 (도 2 F)를 비교하여, 발광 비율 (FXR 활성화)의 증가를 나타낸다 실험의 시작에서 비. 또한, 유동 세포 계측법 단일 세포 수준 또는 전체 모집단 같은 고 처리량 스크리닝에 세포의 풀을 선별하는데 사용될 수있다. NucleoBAS 표현 U2OS 세포 excit 있었다보라색 ​​405 nm의 레이저 형광와 ED는 황수정에 대한 하늘색과 20분의 525 범위에 대한 40분의 450 범위에서 수집 하였다. FACS 기반 FRET 실험의 효율성을 개선하기 위해, 적절한 게이트들은 (도 3)를 설정해야한다. P1 게이트는 세포 파편을 제외하고 P2 게이트는 분석에서 duplets을 제거합니다. 다음으로, 분석 (488 레이저 여기) 및 하늘색 (405 레이저에 의해 여기) 마지막으로 게이트 (3)에 의해 양성 세포 시트린 제한되어, 게이트 P4가 높은 황 / 세룰 리안 발광 비율 세포의 비율을 나타낸다 (하늘색의 음원을 이용하여 ) 405 nm의 레이저와. 각 샘플에 대해, 게이트 (3) 내의 떨어 적어도 10,000 세포를 측정 하였다. 이어서, FACS 기반 FRET 유동 세포 계측법은 TCDCA GW4064과 함께 30 분간 배양 한 후 살아있는 세포의 FRET의 증가를 계산 하였다. NucleoBAS를 발현하는 비 처리 U2OS 세포 보였다 &lt;게이트 P4 5 % 세포 (시트린 / Cerulean 높은 세포). 모든 담즙산 수송 체의 부재에서 유사한 비율은 30 μM TCDCA 처리 된 세포 (도 4)에서 관찰되었다. 반면, 세포 NucleoBAS 공동 발현, NTCP와 OSTαβ은 약 38 %의 황수정 / 하늘색 높은 세포의 증가 된 양을 표시했다. GW4064 10 μM을 첨가 한 후, 세포의 거의 90 % 또는 OSTαβ NTCP (도 4 B)의 발현 시트린 / 하늘색 오름차순 무관 하였다. 데이터는 황수정 - 하늘색 비율 (그림 4 E, F)의 인구 히스토그램이나 (그림 4 C, D) (게이트 4, 인구 4 % 세포) 막대 그래프에 표시 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig1.jpg" /> 에프담즙 산성 센서 (BAS)의 igure 1. 디자인. (A) 유전자 인코딩 된 담즙 산 센서의 작용 모드의 구조 표현입니다. 그것은 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정) FXR-LBD를 통해 연결되어 FXR - 보조 인자 펩타이드 (LXXLL 모티브)에 융합으로 구성되어 있습니다. (B) BAS의 도식 도메인 아키텍처. Q204F / V224L의 형광 돌연변이는 하늘색과 황수정 사이의 분자 내 상호 작용의 형성을 촉진. NucleoBAS 구조는 C- 말단 핵 지역화 신​​호 (NLS)을 포함하고 CytoBAS 구조가 세포질 지역화를 보여줍니다 따라서 어떤 대상 시퀀스를 결여하고있는 반면, 따라서 핵에 축적. (C)의 공액 담즙산 수송을 감시하는 도구로서 BAS 주제와 촛점 기반 FRET 실험. 황수정 / 하늘색 비율의 변화는 세포에서 30 μM의 TCDCA 추가 만 특급 후 관찰되지ressing NucleoBAS. 5 μM GW4064 첨가하면 강하게 증가 시트린 / 세룰 리안 비율이 관찰되었다. TCDCA의 (D) 가져 오기 (30 μM) NTCP와 OSTαβ 공동 형질 감염된 세포에서 센서의 상당한 활성화에 결과. 이후 GW4064 (5 μM) 처리 황수정 / 하늘색 비율이 더 증가로 이어집니다. 평균 ± 표준 편차, N = 6 각 셀. 같은 결과는 표현 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig2.jpg" /> 그림 2. 현지화 FRET은-BAS는 살아있는 세포에서 구축합니다. CytoBAS (A) 또는 NucleoBAS (B)로 형질 U2OS 세포의 공 초점 현미경 이미지. (C) U2OS 세포 공동 트란NucleoBAS 및 NTCP-mKate2와 sfected. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (D - F) NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 형질 감염된 세포의 시계열. (D) GW4064는 FXR (증가 450분의 525 nm의 비율),하지만 TGR5이 활성화됩니다. (E)는 TCDCA TGR5가 세포막에 활성화 (450분의 525 nm의 비율이 감소)하지만, 핵 FXR을 활성화 세포에 들어갈 수 없다. (F) CDCA는 핵의 세포막에 TGR5뿐만 아니라 FXR을 활성화 (세포질 감소, 핵에 450분의 525 nm의 비율을 증가). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig3.jpg" /> 그림 3. 게이팅 paramete 유동 세포 계측법RS. (A) SSC-A / FSC-창에서 P 1 게이트는 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다. FSC-H / FSC-창에서 (B)는, P2 게이트는 분석에서 이중 이벤트를 제거하기 위해 그려집니다. (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, NucleoBAS (그리고 CytoBAS) 양성 세포가 선택 황수정 (게이트 P3)에서 (C). (D) 마지막으로, 황수정에 (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, P4 게이트 FACS 실험의 황수정 / 하늘색 높은 세포가 포함되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53659/53659fig4.jpg" /> 그림 4. NucleoBAS를 사용 담즙산 수송 측정 주제 FACS 실험. (A </strong<html> &gt; B)의 양을 보여주는 FACS-플롯 시트린 / 세룰 리안 높은 리빙 NucleoBAS 발현 U2OS 세포 (A) 및 U2OS 세포 공동 발현 NucleoBAS을 OSTαβ와 NTCP (B) 왼쪽 제어 버퍼 (), 30 μM으로 처리 한 후 TCDCA (가운데) 또는 10 μm의 GW4064 (오른쪽). (C, D) NucleoBAS 및 표현 U2OS 세포에서 TCDCA 또는 GW4064 30 분 배양 후 황수정 / 하늘색 높은 세포의 막대 그래프를 보여주는 비율 (D) 또는 (C) OSTαβ 및 NTCP없이 공동 형질. (E, F) TCDCA (노란색)과 30 분 배양 후 OSTαβ 및 NTCP 유무에 관계없이 NucleoBAS을 표현 U2OS 세포, GW4064 (빨간색) 또는 제어 버퍼 (파란색)의 인구 황수정 / 하늘색 비율의 분포를 보여주는 히스토그램. 모든 조건은 세번 측정 하였다. 바 평균값 + 표준 편차 (SD)를 나타냅니다 (N = 3).ttps : //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 파일 1 :. 템플릿 BAS 총장 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_1._template_BAS_general.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 파일 2 :. 템플릿 BAS 자이스 라이카 데이터를 가져 오기 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53659/Supplemental_File_2._template_BAS_Zeiss_Leica_imported_data.xls" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K 조회수.  Academic Medical Center. We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types. 

비디오: Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

연구

생체공학

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound (HIFU) Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An oscillatory motion is generated at the focus of a 93-element and 4.5 MHz center frequency HIFU transducer by applying a 25 Hz amplitude-modulated signal using a function generator. A 64-element and 2.5 MHz imaging transducer with 68kPa peak pressure is confocally placed at the center of the HIFU transducer to acquire the radio-frequency (RF) channel data. In this protocol, real-time monitoring of thermal ablation using HIFU with an acoustic power of 7 W on canine livers in vitro is described. HIFU treatment is applied on the tissue during 2 min and the ablated region is imaged in real-time using diverging or plane wave imaging up to 1,000 frames/second. The matrix of RF channel data is multiplied by a sparse matrix for image reconstruction. The reconstructed field of view is of 90&#176; for diverging wave and 20 mm for plane wave imaging and the data are sampled at 80 MHz. The reconstruction is performed on a Graphical Processing Unit (GPU) in order to image in real-time at a 4.5 display frame rate. 1-D normalized cross-correlation of the reconstructed RF data is used to estimate axial displacements in the focal region. The magnitude of the peak-to-peak displacement at the focal depth decreases during the thermal ablation which denotes stiffening of the tissue due to the formation of a lesion. The displacement signal-to-noise ratio (SNRd) at the focal area for plane wave was 1.4 times higher than for diverging wave showing that plane wave imaging appears to produce better displacement maps quality for HMIFU than diverging wave imaging.

Real-time Monitoring of High Intensity Focused Ultrasound HIFU Ablation of In Vitro Canine Livers Using Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound HMIFU

This article describes real-time monitoring of HIFU ablation in canine liver with high frame rate ultrasound imaging using diverging and plane wave imaging. Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound is used to image the decrease of acoustic radiation force induced displacement in the ablated region.

높은 강도의 실시간 모니터링의 초음파 (HIFU) 절제를 집중<em&gt; 체외</em&gt; 집중 초음파에 대한 조화 운동 이미징을 사용하여 개 간을 (HMIFU)

Harmonic Motion Imaging for Focused Ultrasound (HMIFU) is a technique that can perform and monitor high-intensity focused ultrasound (HIFU) ablation. An ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing termini of oligo- and polysaccharides, as well as its unique chemical characteristics, sialic acid is involved in a multitude of different receptor-ligand interactions. By modifying the expression of sialic acid on the cell surface, sialic acid-dependent interactions will consequently be influenced. This can be helpful to investigate sialic acid-dependent interactions and has the potential to influence certain diseases in a beneficial way. Via metabolic glycoengineering (MGE), the expression of sialic acid on the cell surface can be modulated. Herein, cells, tissues, or even entire animals are treated with C2-modified derivatives of N-acetylmannosamine (ManNAc). These amino sugars act as sialic acid precursor molecules and therefore are metabolized to the corresponding sialic acid species and expressed on glycoconjugates. Applying this method produces intriguing effects on various biological processes. For example, it can drastically reduce&#160;the expression of polysialic acid (polySia) in treated neuronal cells and thus affects neuronal growth and differentiation. Here, we show the chemical synthesis of two of the most common C2-modified N-acylmannosamine derivatives, N-propionylmannosamine (ManNProp) as well as N-butanoylmannosamine (ManNBut), and further show how these non-natural amino sugars can be applied in cell culture experiments. The expression of modified sialic acid species is quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and further analyzed via mass spectrometry. The effects on polysialic acid expression are elucidated via Western blot using a commercially available polysialic acid antibody.

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Sialic acid is a typical monosaccharide-unit found in glycoconjugates. It is involved in a plethora of molecular and cellular interactions. Here we present a method to modify cell surface sialic acid expression using metabolic glycoengineering with N-acetylmannosamine derivatives.

N을 사용 하 여 Sialic Acid의 대사 Glycoengineering-acyl-Mannosamines를 수정

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

실시간 3D 단일 입자 추적에 대 한 프로토콜

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...