우리는 피드백을 박사 에반, 뉴웰 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 또한 멀티 란탄 족 함유 폴리스티렌 구슬의 샘플에 대한 DVS 과학 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 NIH 보조금이 U19 AI057229에서 자금에 감사합니다.

CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 per​​meabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다. 1. 시작 - 최대 질량 Cytometer의 <ol><li> CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 이동하고 버​​튼을 &quot;ON&quot;히터를 클릭합니다. 200 ° C.에 도달하는 스프레이 챔버 맨틀에 대한 충분한 시간을 허용하도록 히터에 원하는 시간 전에 적어도 15 분을 돌려 </li><li> MilliQ 물로 가득 찬 신선한 주사기와 주사기 펌프에 흰색 규격-Ject 3 ML의 주사기를 교체합니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 작은 액체 소개 포트와 큰 가스​​ 도입 포트 모두를 통해 5% citranox 2 ~ 3 배를 끌어 주사기와 튜브를 사용하여 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 Backflush. MilliQ 물 t으로 backflushing 반복잔여 citranox를 제거 O. </li><li> CyTOF의 전면 패널에있는 표시등은 그림 1에서와 같이 불이되어 있는지 확인하십시오. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> 시작하기 전에 그림 1. CyTOF 패널 등. <ol start="5"><li> 아르곤 가스 탱크 밸브를 엽니 다. 이 켜하기 위해 전면에있는 &#39;아르곤&#39;빛의 원인이됩니다. </li><li> 가스 유입을 업 할 수있는 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 연결합니다. 나사가 빠지다 가스 튜브 커넥터를 메이크업과 검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 제거합니다. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 가스 도입 포트 줄기에있는 넓은 &quot;마디&quot;를합니다. 가스 도입 포트에 커넥터를 배치합니다. 가스 포트의 끝 부분 위에 검은 색 O-링을 배치하고, 포트 줄기의 넓은 부분을 통과 O-링을 강제로. 화장 가스 튜브로 하얀 원뿔 플라스틱 지적 좁은 끝으로 상단에 작품과 나사를 배치합니다. </li><li&gt; 액체 소개 관에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 첨부합니다. 조심스럽게 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝에 개통에 작은 튜브를 삽입합니다. micropipettor에 정류장에 느끼는 유사한 두 정거장이 될 것입니다. 당신은 가벼운 저항을 만날 때까지 첫째, 키를 눌러, 작은 튜브의 끝은 유리의 직선 섹션의 끝 부분에 있어야합니다. 둘째, 피팅에 더욱 유리의 직선 부분의 끝을 강제하기 위해 더 열심히 눌러 밀봉 할 나사 피팅 조입니다. 가열 망태에있는 하얀 개방에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝을 삽입합니다. </li><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;시작 플라즈마&quot;를 누르십시오. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요이 이미 삽입되어 있기 때문에, &quot;OK&quot;를 누릅니다. 이 소프트웨어는, 냉각기를 켜 가스의 흐름을 시작하고 플라즈마에 불을 지필 것입니다. 검출기 전압 두는 것입니다. 완료되면 &quot;플라즈마 시동 순서가 성공적으로 완료되었습니다&quot;라는 팝업 창이있을 것이다; 보도 &quot;OK&quot;. 새로운 불빛 (그림 2 전면 패널에에 있어야합니다 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> 그림 2. 플라즈마 점화 및 시동 성공적으로 완료 CyTOF 패널 등 후. <ol start="9"><li> 주사기 펌프 켜기. 오른쪽 상단에서 주사기 펌프를 시작하고 튜브를 통해 액체를 흐르는과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 분사를 시작 녹색 &#39;재생&#39;버튼을 누릅니다. 기본 주사기 설정 물 3 ML위한 것입니다. 이 물 부족하면 샘플 샘플 루프를 통해 흐르는 될 위해서는, 주사기 펌프는 주기적으로 변경해야합니다. 화면의 상단에 액체가 주사기 펌프 밖으로 흘러이 얼마나 나타내는 카운터가 있습니다. 주사기 펌프이 카운터가 주사기의 끝을 도달 &quot;3.000&quot;또는 플런저에 도달 할 때 중단됩니다. 주사기를 충진 할 때, &quot;그만하세요&quot;가 아닌 카운터를 재설정 할 수있는 파란색 &#39;일시 중지&#39;버튼을 누르해야합니다. </li></ol>대량 Cytometer의 전자 &quot;&gt; 2. 매일 보정 <ol><li> 대량 cytometer는 보정 전에 뜨거운 안정적인 플라즈마를 달성하기 위해 약 20 분 필요합니다. 높은 가치의 3 % 이하 신호, 조정 단계의 목적은 &quot;Gd155&quot;을 (La139 + O16 산화) 유지하면서 Tm169 또는 Tb159의 원하는 신호를 극대화하는 것입니다. 데이터 수집 설정 창을 엽니 다 수집 설정 버튼을 클릭합니다. Analytes 탭에서 동위 원소 선택 패널을 열려면 주기적으로 테이블을 클릭합니다. 설명서에 나와있는 DVS 과학 튜닝 솔루션에서 동위 원소를 선택한 다음, &#39;저장&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 창 당 질량을 (ES) 열 버튼을 읽기 당 동위 원소를 클릭합니다. 새 번호를 입력하고 &quot;입력&quot;키를 눌러 &quot;펄스 카운트&quot;, 그리고 rescale y 축을 선택합니다. </li><li> 튜닝 솔루션을 그린 한 ML 규격 - Ject의 주사기를 채우십시오. &quot;로드&quot;를 샘플 포트 선택기를 돌려, 튜닝 솔루션 450 μl를 삽입 한 다음 &#39;삽입&#39;할 수있는 선택기를 켜십시오. 데이터 Acquisit의 질량 보정 탭에서<html> 이온 설정 창은 군중에 의해 흐르는되는 모니터링하기 위해 &#39;실행&#39;을 누르십시오. 오른쪽은 높은 질량 상태에서 창 왼쪽은 낮은 질량입니다. 참고 : 이미 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소 (그림 3)에 의한 TOF 9400-9800 지역에서 신호가있을 것입니다. 튜닝 솔루션 동위 원소가 디스플레이에 줄무늬 (그림 4)로 표시되기 시작 때까지 기다리십시오. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> 세탁 솔루션과 물 헹굼 후 다양한 동위 원소에 대한 배경 수준을 보여주는 그림 3. 질량 보정 탭 창. TOF 9400-9800 주변 지역은 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소에 해당하는, 항상 존재해야합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 4 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 질량 보정 탭 창, DVS 튜닝 솔루션의 다양한 동위 원소에 대한 수직 줄무늬를 보여주는이 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol start="4"><li> 창을 읽기 당 질량 (ES)로 돌아가서 왼쪽 상단 모서리에있는 녹색 &quot;재생&quot;버튼을 누르십시오. 단계 2.1에서 선택한 각 동위 원소는 다른 색 선으로 표시됩니다. 기본 x 축은 초에 &quot;시간&quot;입니다. 사람들이 안정된 때까지 서로 다른 동위 원소의 양을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 현재의 조정. 데이터 수집 설정 윈도우의 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &#39;현재&#39;를 선택합니다. = 0, 마무리 = 10, 단계 값 = 0.5, 정착 시간 = 200을 시작하자,하고 &#39;저장&#39;을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)에 돌아 가기를 클릭합니다. x 축은 이제 &quot;현재&quot;입니다. 참고 곳 동위 원소 피크 (그림 5), 그리고 R의 신호<html> ecord. 악기 설정 창 DAC 채널 설정 탭에서 &#39;현재&#39;아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> 그림 5. 현재 튜닝 프로필. <ol start="6"><li> 화장 가스의 조정. 드롭 다운 메뉴 변경 &#39;메이크업 가스를. &quot; = 0.95, 단계 값 = 0.05, 정착 시간 = 200 = 0.55, 최종을 시작하자. 저장을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)로 돌아 가기. x 축은 이제 &quot;메이크업 가스&quot;유량입니다. 기록 곳 동위 원소 피크의 신호. 끝 부분의 &quot;Gd155&quot;신호 (그림 6)의 급속한 증가를 관찰. DAC 채널 설정 탭으로 돌아 가기로 &quot;메이크업 가스&quot;를 아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol>igure 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 메이크업 가스 조정 프로필. <ol start="7"><li> 의 녹화 비율은 동위 원소 대 산화물을 원하는. 튜닝 솔루션의 두 번째 450 μl 주사를합니다. 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &quot;시간&quot;을 선택, 시간 = 200 정착, = 0, 최종에게 = 10, 단계 값 = 1을 시작해보세요. &quot;저장&quot;을 누르십시오. 창을 읽기에 따라 대용량의 &#39;재생&#39;(ES)를 누르십시오. 라인 (그림 7) 안정화 한 후 Tm169 또는 Tb159 (높은 값)에 대한 왼쪽 상단 상자에 값을 읽어 커서를 사용하고 또한 &quot;Gd155&quot;값 (높은 값의 &lt;3 %). 이 값은 나중에 참조 할 수 있도록 조정 파일에 저장할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> 그림 7. 현재 및 메이크업 가스를 최적화 한 후 튜닝 솔루션 신호 강도의 측정. <ol start="8"><li> 샘 청소ple 루프. DVS 워시 솔루션 500 μl 다음, 샘플 루프를 통해 MilliQ 물 3 ML를 삽입. 질량 보정 탭에서 &quot;실행&quot;을 눌러 청소의 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. 줄무늬의 강도는 (그림 4) 배경 수준 (그림 3)으로까지 MilliQ 물 및 모니터 3 ML에 따라 다음 감소하기 시작 때까지 씻는다. </li></ol> 3. 실행 샘플 <ol><li> 취득 창을 엽니 다. 기본 설정 : 즉석에서 분석 = 수행 = 듀얼, 듀얼 카운트 보정 = 데이터를 분석하는 신호. 노이즈 감소가 선택됩니다. 원하는 경우 다음의이 변경 될 수 있습니다. 파일 이름을 입력합니다. 모든 파일은 E의 :/ / 드라이브에 저장해야합니다. </li><li> 인수 지연을 설정합니다. 샘플 루프와 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 사이의 튜브의 길이에 따라 약 30 초의 전지 이벤트를 등록에 다소 시간이 지연 될 수 있습니다. 따라서, 합 &quot;취득 지연&quot;총과 &quot;감지기 세인트능력 지연은 &quot;최소 30 초이어야합니다. 탐지기 안정성 지연은 적어도 20 초이어야합니다. </li><li> 데이터 수집 시간을 설정합니다. &quot;취득 시간은&quot;당신이 샘플을 실행하려면 시간 (초)입니다. 전체 450 μl 샘플 루프를 작성하면 600 초 완료 할 필요합니다. 그것은 50-100 초는 샘플을 수행 오버 최소화하기 위해 런타임의 마지막에 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 시료의 Resuspension. 기계에 염분의 빌드 업 최소화하기 위해, 그것은 MilliQ 물에서 최종 resuspension 다음, 세포 염색의 끝에서 MilliQ 물에서 적어도 두 개의 세차가 완료하는 것이 좋습니다. MilliQ 물의 볼륨 펠릿은 당신이 시작 셀 및 전체 염색 절차 후 세포 회복의 수에 따라 달라집니다 셀을 resuspend하는 데 사용됩니다. 좋은 시작 장소는 10 6 (시작) 셀 / ML입니다. resuspension 후, 응집체를 제거 할 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 시작 샘플 실행합니다. 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력합니다.<html> , &quot;로드&quot;샘플을 삽입, 취득 창에서 다음 누르 &quot;실행&quot;을 &quot;주입&quot;로 전환하려면 샘플 루프 밸브를 전환합니다. </li><li> 셀 이벤트를 등록. 셀은 각 수직 동위 원소 / 마커 채널 (그림 8)에서 마르크의 수평 모음으로 스냅 샷 창에 표시됩니다. 대량 cytometer 1,000 세포 / 초를 등록 할 수 있지만, 셀 이벤트 사이의 더 나은 해상도는 일반적으로 300-500 셀 / 초에서 얻어진다. 이 ~ 1 셀 / 화면 재생의 평균에 해당합니다. 셀 이벤트 카운터가 뜨기 시작하기 전에 30 초까지 걸릴 수 있습니다. 이것은 &quot;에 On-The-Fly&quot;데이터 처리로 인해, 더 셀 이벤트 정보가 손실되지 않습니다. </li></ol><img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> 8 그림. 샘플 동안 수집 창에 별도의 세 가지 세포 사건과 관련된 요소에 해당하는 장소의 수평 행을 보여 실행할 수 있습니다.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="7"><li> 세포 사건의 품질. 각 동위 원소 채널뿐만 아니라 셀 이벤트 요금 좋겠어 어떤 배경을 확인할 수 있습니다. 대량 cytometer는 배경 위에 신호의 특정 증가로 &quot;셀 이벤트&quot;, 이렇게 무료로 금속 또는 언 바운드 항체는 &quot;셀 이벤트&quot;수를 변경할 수에서 배경 신호를 인식합니다. 또한, 너무 높은 농도에서 세포를 실행하는 것은 쌍으로 된 것 이벤트의 증가 된 수의 원인이 될 수 있습니다. 배경은 추가 세차 이상 세포 희석가 감소 할 수 있습니다. Doublets이 증가 런타임의 비용에서 큰 세포 희석하여 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 샘플 데이터 수집을 완료. 수집 시간에 도달하면 데이터 수집이 완료된다. 있는 팝업 창이하기 전에 약간의가있을 것 &quot;OK&quot;버튼이 나타납니다, 다시이 &#39;에 On-The-Fly &quot;데이터 처리 때문입니다. 샘플 획득도 premat 중지 할 수 있습니다urely &quot;중지&quot;버튼을 눌러. 이 경우 이미 등록 모든 셀 이벤트는 출력 파일에 포함하여 처리됩니다. </li><li> 각 샘플 사이의 MilliQ 물을 적어도 500 μl의 주입은 또한 샘플 carryover를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 4. 사용 후 기계 청소 <ol><li> 솔루션을 씻으십시오. 최종 샘플을 실행하고 물 플러시 샘플 루프, 샘플 루프로 세척 솔루션의 450 μl를 삽입 한 후. 단계 2.8에서와 같이 데이터 수집 설정 창 (그림 9)의 질량 보정 탭에서 무료로 금속의 릴리스를 모니터링 할 수 있습니다. 무료 금속 신호가 감소하기 시작하면, MilliQ 물 3 ML로 플러시하고 배경 수준이 달성 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> DVS 워시 솔루션과 사후 운영 청소하는 동안 그림 9. 질량 보정 탭 창,. TOF 지역 9800-11000의 수직 줄무늬는 기계 청소하는 항체 - 라벨 동위 원소입니다. TOF 11,500 주변의 수직 줄무늬가 두 적외선 intercalator의 동위 원소에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 5. 컴퓨터를 종료 <ol><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;플라즈마를 중지&quot;를 선택합니다. 절차가 완료되면 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거하라는 팝업 창이있을 것입니다. &quot;OK&quot;를 누릅니다. 카드 케이지 탭에서 히터를 끄십시오. 아르곤 공급 장치의 밸브를 닫습니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 제거. 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거합니다. 나사가 빠지다 샘플 소개 단계 1.6에서 관 그리고 옆 넣습니다. 약간 느슨하게하기 위해 돌려서 메이크업 가스 도입 연결 한 다음, 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 당긴다. 함께 망 피팅으로 남겨두면 리터의 가능성을 줄일 수 있습니다검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 osing. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 단계 1.3에서와 같이 주사기와 튜브를 사용하여 5 %의 citranox과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 두 포트를 Backflush. 스토어, 다음 사용 때까지 5 % citranox에 덮여. </li></ol>

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	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

인간 면역 감시 센터, 대량 세포 계측법을 포함한 assays의 비용을 복구 전적으로 사용자의 비용을 청구 스탠포드 대학에서 서비스 센터에서 저자는 일 모두.

지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다. 대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라벨과 같은 금속에 킬레이트 사이트와 폴리머를 사용하여 DVS 과학에 의해 개척. 1-3 금속의 순도와 ICP-MS의 질량 해상도로 인해 효율적으로 더 &quot;스펙트럼 중복이 없다&quot;고 말했다. 사용 요소의 대부분은 생물학적으로 관련이없는 때문에, 원인 약간의 배경도 있습니다 &quot;autofluoresence가.&quot; 이러한 사실은 하나의 실험에서 30 개 이상의 동시 마커의 사용을 허용합니다. 넓은 마구도 6,7 있습니다전형적인 형광 실험에 비해 ICP-MS에서 신호의 namic 다양합니다. 그러나, 대량 세포 계측법은 제한 사항이 있습니다. 그것은 파괴 기술이다 ​​: 셀 정렬 및 추가 실험을 위해 복구 할 수 없습니다. 대량 cytometer는 금속의 존재에 대한 엄격한 요구 사항이있다 : 금속이 존재하지 않을 경우, 세포가 감지되지 않습니다. 이 모든 셀에 관계없이 여부 모든 항체 프로브의 구속 감지되므로, 올바른 퍼센트의 부모 통계를 보장하는 금속 킬레이트 화 DNA의 intercalators의 사용에 대한 주된 이유입니다. 3,6-7 마지막으로, 현재 셀 전송 효율 기계 ~ 25 %가 형광등 흐름 cytometer에&gt; 90 % 효율에 비해입니다. 따라서, 세포의 큰 시작 번호는 종종 희귀 세포 집단을 위해 필요합니다. 그러나, 이것은 일반적으로 하나의 집단 cytometer 샘플은 종종 여러 형광 샘플을 대체한다는 사실에 의해 균형입니다. 마지막으로, 최대 셀 acquisition 속도는 ~ 1,000 세포 / 초 표준 형광 흐름 cytometers보다 훨씬 느린, 최적의 속도는 자주 반입니다. 따라서, 각 샘플을 실행하는 데 시간이 오래 걸립니다. 여러 논문은 최근 세포 샘플의 다양한 유형의 착색에 게시되었습니다. 3,5-7이 문서의 목적은 실행 샘플 CyTOF TM 질량 cytometer의 적절한 사용에 대한 정보를 제공하는 것입니다. 5 % citranox에 함께 backflushing 및 스토리지에 의한 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 유지 관리함으로써 나막신의 가능성을 감소, 세포 파편과 금속의 빌드 - 업 최소화합니다. 최적의 성능을위한 시스템의 유지 보수는 두 부분으로되어 있습니다. 첫째, 적어도 매일 기계의 적절한 조정 (현재, 메이크업 가스) 적절한 측정을 보장 할 수 있습니다. 각 샘플 사이의 끝 부분에 씻으 솔루션 MilliQ 물과 둘째, 적절한 세척은 조립 유기 및 무기 파편 일반 carryover의 배경을 최소화 도움이 될 것입니다 제거 실행샘플 사이에 있습니다. 마지막으로, 샘플 준비의 품질은 데이터 수집의 품질에 큰 영향을 미치고 있습니다. 버퍼에 마지막으로 MilliQ 물에 여러 세차는 intercalators이나 특이 현상 항체 바인딩로부터 금속 배경을 제거 할 수 있습니다. 세포 샘플의 적절한 희석 샘플 당 총 실행 시간을 최소화하면서 휴대 이벤트 사이의 최적의 해상도를 조절하는 데 도움이됩니다. 적절한 희석 또한 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 덩어리가 발생 가능성을 최소화하는 데 도움이됩니다. 일반적인 문제 해결 1. 이 기계는 지난 신생 동안 단계를 &quot;RFG는 준비&quot;하지 않습니다 악기 설정 윈도우의 카드 케이지 탭에서 RFG에서 &quot;재설정&quot;을 누르십시오. 컴퓨터를 시작하려고합니다. 이 문제가 해결되지 않는 경우, 소프트웨어를 닫습니다 다시 다시 &quot;재설정&quot;을 눌러 시작하려고. 이 여전히 문제가 해결되지 않으면, 기계의 왼쪽 뒷면 모서리에있는 RFG 발전기 차단기의 스위치를 확인하십시오. 걸려 넘어 경우,&quot;ON&quot;, 누르 &quot;재설정&quot;로 위치를 변경하고, 시작하려고합니다. 이 여전히 문제가 해결되지 않는 경우, DVS에 문의하십시오. 2. 실행하는 동안 컴퓨터가 종료 <ol class="lalpha"><li> 아르곤 공급 장치를 확인합니다. 기계에 도달 아르곤 압력은 40 PSI 주위에 아래지면, 소프트웨어가 자동 종료를 실행합니다. </li><li> RFG는 100W 오류를 초과했습니다. 플라즈마에 대한 전력 수요가 1300 밖에 될 때이 문제가 발생 + / - 100W 창 및 소프트웨어 자동 종료를 실행합니다. 이것은 보통 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 고르지 스프레이, 특히 대형 방울로 인해 발생합니다. 이 지나치게 플라즈마를 유지하기 위해 더 많은 에너지를 필요로 플라즈마를 냉각시킨다. 주사기 펌프의 변화 동안 주사기에 주사기 튜브를 연결하는 데 사용되는 과도한 힘 때문에 발생할 수 있습니다. 이 플라즈마를 냉각 방울의 큰 스프레이가 발생합니다. 이 경우 단순히 컴퓨터를 다시 시작합니다. </li></ol> 이것은 또한 시작 큰 방울로 인해 발생할 수 있습니다천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요가 방해을 시작할 때 형성하고 있습니다. 이 오류가 다시 발생은 청소의 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거하면 깨끗한 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요를 삽입하고 다시 시작합니다. 덜 자주, 샘플 루프와 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 사이의 얇은 샘플 튜브가 방해 할 수 있습니다. 이것은 튜브가 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 제거 액체의 anomalously 낮은 유량으로 진단 할 수 있습니다. 이 경우 영향을받는 튜브와 신선한 튜브를 재건 할 부품을 제거하고 새로운 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 설비 및 튜브 키트로 교체. 3. 질량 보정 탭 창을 (도 3, 4, 9) 지켜 볼 수 세포 샘플 수집 (그림 8) 기간 동안 동위 원소의 줄무늬 (또는 셀 행사), 또는 상태 <ol class="lalpha"><li> 주사기 펌프를 확인합니다. 이러한 상황은 종종 주사기 펌프 주사기의 변화에​​서 &quot;재생&quot;을 치 잊고으로 인해 발생합니다. &quot;일시 중지&quot;가 아닌, &quot;정지&quot;가, 주사기 변경하는 동안 충돌하는 경우에도 이러한 문제가 발생할 수 있습니다. &quot;일시 중지&quot;는 주사기 펌프에 볼륨 카운터를 재설정하지 않습니다, 그것은 상관없이 액체 유해, 3.000 ML 투여 량에 중단됩니다. 마지막으로, 주사기는 물이 부족했을 수 있습니다. </li><li> 샘플 밸브를 확인합니다. 반면 &#39;로드 &quot;에 샘플을로드 할 수 있는지 확인하고 그냥 샘플 실행을 시작하기 전에&quot;주사 &quot;로 전환 할 수 있습니다. </li><li> 고갈 또는 너무 샘플을 희석. 귀하의 샘플을 모두 실행할 수 있습니다 (단계 3.3 참조) 취득 시간 계산을 확인합니다. 또는 희석 요소를 잘못 계산했을 수 있습니다, 및 / 또는 샘플을 처리하는 동안 예상보다 더 많은 셀을 잃었다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 가득. 이것은 보통 RFG 오류 (문제 2B 참조) 앞에는되어 있지만, 덩어리가 notiecably 종료가 발생하기 전에 셀 전송 효율을 줄일 수 있습니다. </li></ol> 문제 3C 및 3D는 유럽 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 보정 구슬의 샘플을 실행하여 확인하실 수 있습니다. 그들은 약 1,000,000 / ML (물론 샘플을 그리기 전에 소용돌이!)에서 제공됩니다. 따라서, 450 μL 샘플 루프를 작성하는 것은 AP에게 줄 것proximately 450,000 구슬. CyTOF TM 셀 전송 효율은 기계에 의존하지만, 약 15-30%입니다. 따라서 67,500-135,000 구슬 이벤트는 해당 사출 기대를 할 것입니다. 아래의 숫자는 튜브 또는 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 덩어리와 일치합니다. 셀 / 구슬 전송 효율은 장기적인 추세를 확인하려면, 가끔 테스트 할 일입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> CyTOF TM 대량 cytometer </td><td> DVS 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 솔루션을 씻으십시오 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201071 </td><td> 물에 0.05 % 불화 수소산 산 </td></tr><tr><td> 솔루션을 튜닝 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm으로 라, CS, TB, TM, IR, 추적 질산 </td></tr><tr><td> 유럽​​ 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201073 </td><td> 약 1,000,000 / ML에서 제공 구슬, 자연 풍부한 유럽 연합 (EU) 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 멀티 란탄 족 함유 (라 / 홍보 / TB / TM / 루) - 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 아직 상업적으로에 사용할 수 </td><td> 등록 된 란탄 계열 원소의 자연 풍부한 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 질산 (집중) </td><td> 피셔 과학 </td><td> A467-500 </td><td> Optima 추적 메탈 순수 ICP-MS 학년 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 셀 스트레이너 캡-5mL로 </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 주입하기 전에 세포 샘플을 필터링하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject tuberkulin 주사기-1mL </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010-200V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject의 주사기-3 ML </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010.000V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> MilliQ 물 </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ 순수한 물, 유리 또는 상업적 세제 (바륨 현재의 높은 수준으로 인해)으로 세척 한 플라스틱 병에 저장해서는 안됩니다. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z273236 </td><td> 산성 세제 </td></tr><tr><td> 아르곤 가스 </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999 % 초 고순도 </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. 1 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. 2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 &quot;스펙트럼 중복&quot;은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 6-7 대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다. 대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.

위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의 다른 부분으로 줄일 도움이 될 것입니다. 또한 기계에 갇혀함으로써 샘플에서 샘플로 carryover를 최소화하기 수있는 세포를 제거하는 데 도움이됩니다. 산화 질량 M 16에서 배경을 최소화하면서 대량 cytometer (그림 5-7)의 셋째, 산화물 형성이 완전히 예방할 수 할 수는 없지만, 적절한 튜닝은 원하는 질량 M에 최적화 총 신호를 도움이 될 것입니다. 로 그림 10에서와 같이 부적절한 튜닝 (마젠타)는 상당히의 산화물 형성을 증가M 16에서 제대로 조정 샘플 (진한 파란색)에 비교했다. 이 약간 M에서 원하는 신호를 감소의 효과를 가지고 있으며, 크게 M 16에서 원치 않는 배경 간섭을 증가합니다. 마지막으로, 버퍼의 마지막 MilliQ 물에 샘플의 적절한 세척이 허용 수준으로 금속 / 항체 배경 신호를 감소해야합니다. MilliQ 물 세차 및 resuspension은 런타임의 몇 시간의 과정을 통해 꾸준한 현재 설정을 유지하는 중요한 역할을합니다. MilliQ 물에 샘플의 적절한 희석는 매일 샘플을 기준으로 결정되어야한다. 그러나 ~ 10 6 (시작) 셀 / ML에 diluting 것은 시작하는 좋은 장소입니다. 세트의 첫 번째 샘플을 바탕으로 후속 샘플 크거나 작은 희석을 이용하실 수 있습니다. 속도에 대한 필요성 (그림 8)을 균형을하는 동안 적절한 세척과 적절한 희석는 최소한의 배경과 세포의 가장 큰 해상도를 보장합니다. 그림 10. 원하는 신호, 다양한 란탄 족 금속 사이의 산화물 형성의 차이에 대한 적절한 튜닝의 효과. DVS 과학에서 자연 풍부한 La139, Pr141, Tb159, Tm169 및 Lu175를 포함하는 폴리스티렌 비즈 셀 획득 모드에서 실행되었다. 구슬 별도의 샘플은 지정된 메이크업 가스 유량 (그림 6과 비교)에서 실행되었다. 데이터는 깨진 구슬의 파편 아웃 게이팅을 포함한 Mac 용 FlowJo v9.4.9을 사용하여 분석되었다. 제대로 조정 샘플은 0.74 L / 분이었다. 이 낮은 흐름 속도보다 높은 신호 강도, 그리고 부적절하게 조정 신호보다 &quot;M ​​16&quot;산화 질량의 적은 신호 &quot;M&quot;금속 질량에서 높은 신호를했다. &quot;M&quot;대량 La139과 Tm169에서 A.이 신호. La139 신호 강도가 메이크업 가스의 유동 속도가 이상 Tm169을 영향을합니다. &quot;M 16&quot;산화 대량의 B.는 신호에스 각각 La139 + O16 및 Tm169 + O16 산화물에 해당하는 155, 185,. 실제 &quot;Gd155&quot;또는 &quot;Re185&quot;구슬에있는이 없습니다. &quot;Gd155&quot;채널의 산화 신호는 La139 쉽게 산화되고로 인해, 특히 강하다. 이 산화 한 최고 수준 중 하나가 발생할 것으로 예상 할 수 있습니다 나타냅니다. &quot;M&quot;과 메이크업 가스 유량의 함수로 &quot;M 16&quot;신호 강도의 C. 그래프는. 열려있는 아이콘이 대량 &quot;M 16&quot;를 대표하는 동안 채워진 아이콘, 대량 &quot;M&quot;을 나타냅니다. 라인의 색상은 각각의 질량 &quot;M&quot;에 해당합니다. La139 및 Pr141이 높은 더 많은 질량 &quot;M 16&quot;는 산화 대량 &quot;M&quot;보다 존재 지점에 도달, 메이크업 가스의 유동 속도에 의해 영향을하는 공지 사항이 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4398/4398fig10large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K 조회수.  Stanford University. CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

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Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

연구

환경과학

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the cell cycle is a feature of a number of diseases, including cancer. Study of the cell cycle necessitates the ability to define the number of cells in each portion of cell cycle progression as well as to clearly delineate between each cell cycle phase. The advent of mass cytometry (MCM) provides tremendous potential for high throughput single cell analysis through direct measurements of elemental isotopes, and the development of a method to measure the cell cycle state by MCM further extends the utility of MCM. Here we describe a method that directly measures 5-iodo-2&#8242;-deoxyuridine (IdU), similar to 5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU), in an MCM system. Use of this IdU-based MCM provides several advantages. First, IdU is rapidly incorporated into DNA during its synthesis, allowing reliable measurement of cells in the S-phase with incubations as short as 10-15 minutes. Second, IdU is measured without the need for secondary antibodies or the need for DNA degradation. Third, IdU staining can be easily combined with measurement of cyclin B1, phosphorylated retinoblastoma protein (pRb), and phosphorylated histone H3 (pHH3), which collectively provides clear delineation of the five cell cycle phases. Combination of these cell cycle markers with the high number of parameters possible with MCM allow combination with numerous other metrics.

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&#8242;-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

This protocol adapts cell cycle measurements for use in a mass cytometry platform. With the multi-parameter capabilities of mass cytometry, direct measurement of iodine incorporation allows identification of cells in S-phase while intracellular cycling markers enable characterization of each cell cycle state in a range of experimental conditions.

세포 주기 마커와 함께 피리미딘 유사체, 5-요오도-2′-데옥시우리딘(IdU)을 사용하여 질량 세포분석 플랫폼에서 세포 주기 단계 설정

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

유전학

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge rapidly in tumor cells as a response to damage induced by various cancer treatments. Tumor cell senescence is generally considered undesirable, as senescent cells become resistant to death and block tumor remission while exacerbating tumor malignancy and treatment resistance. Therefore, the identification of senescent tumor cells is of ongoing interest to the cancer research community. Various senescence assays exist, many based on the activity of the well-known senescence marker, senescence-associated beta-galactosidase (SA-&#946;-Gal). 
Typically, the SA-&#946;-Gal assay is performed using a chromogenic substrate (X-Gal) on fixed cells, with the slow and subjective enumeration of "blue" senescent cells by light microscopy. Improved assays using cell-permeant, fluorescent SA-&#946;-Gal substrates, including C12-FDG (green) and DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), have enabled the analysis of living cells and allowed the use of high-throughput fluorescent analysis platforms, including flow cytometers. C12-FDG is a well-documented probe for SA-&#946;-Gal, but its green fluorescent emission overlaps with intrinsic cellular autofluorescence (AF) that arises during senescence due to the accumulation of lipofuscin aggregates. By utilizing the far-red SA-&#946;-Gal probe DDAOG, green cellular autofluorescence can be used as a secondary parameter to confirm senescence, adding reliability to the assay. The remaining fluorescence channels can be used for cell viability staining or optional fluorescent immunolabeling.
Using flow cytometry, we demonstrate the use of DDAOG and lipofuscin autofluorescence as a dual-parameter assay for the identification of senescent tumor cells. Quantitation of the percentage of viable senescent cells is performed. If desired, an optional immunolabeling step may be included to evaluate cell surface antigens of interest. Identified senescent cells can also be flow cytometrically sorted and collected for downstream analysis. Collected senescent cells can be immediately lysed (e.g., for immunoassays or 'omics analysis) or further cultured.

A protocol for fluorescent, flow cytometric quantification of senescent cancer cells induced by chemotherapy drugs in cell culture or in murine tumor models is presented. Optional procedures include co-immunostaining, sample fixation to facilitate large batch or time point analysis, and the enrichment of viable senescent cells by flow cytometric sorting.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

암 연구학

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

발생학

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

Immunophenotype 및 Cytokine 생산 대량 Cytometry 통해 주변 전 혈의 단일 세포 분석

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

면역학 및 감염병학

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

생물학

Profiling of the Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells is regulated by their expression of germline-encoded inhibitory and activating receptors. The engagement of these receptors by their cognate ligands on target cells determines whether the intercellular interaction will result in NK cell killing. This protocol details the design and optimization of two complementary mass cytometry (CyTOF) panels. One panel was designed to phenotype NK cells based on receptor expression. The other panel was designed to interrogate expression of known ligands for NK cell receptors on several immune cell subsets. Together, these two panels allow for the profiling of the human NK cell receptor-ligand repertoire. Furthermore, this protocol also details the process by which we stain samples for CyTOF. This process has been optimized for improved reproducibility and standardization. An advantage of CyTOF is its ability to measure over 40 markers in each panel, with minimal signal overlap, allowing researchers to capture the breadth of the NK cell receptor-ligand repertoire. Palladium barcoding also reduces inter-sample variation, as well as consumption of reagents, making it easier to stain samples with each panel in parallel. Limitations of this protocol include the relatively low throughput of CyTOF and the inability to recover cells after analysis. These panels were designed for the analysis of clinical samples from patients suffering from acute and chronic viral infections, including dengue virus, human immunodeficiency virus (HIV), and influenza. However, they can be utilized in any setting to investigate the human NK cell receptor-ligand repertoire. Importantly, these methods can be applied broadly to the design and execution of future CyTOF panels.

Here we design two complementary mass cytometry (CyTOF) panels and optimize a CyTOF staining protocol with the aim of profiling the natural killer cell receptor and ligand repertoire in the setting of viral infections.

Natural killer (NK) cells are among the first responders to viral infections. The ability of NK cells to rapidly recognize and kill virally infected cells ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

A Barcoding Assay for Phenotypic and Functional Characterization of Immune Cells

Source: Baxter, R. M., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57780">Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video highlights a single-cell proteomic method that employs heavy-metal-conjugated antibodies for distinct cell barcoding. Subsequently, immunostaining and mass cytometry are applied to evaluate immune phenotypic and functional alterations in human whole blood-derived immune cells.

면역 세포의 표현형 및 기능적 특성화를 위한 바코드 분석

1. Barcode of Lysed/Fixed Blood Cells

	Thaw the lysed/fixed cell samples from the -80 &#176;C storage slowly on ice; a maximum of 20 samples can be ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Vaccine-Pulsed Dendritic Cell-Based In Vitro Assay to Induce Lymphocyte Proliferation

Source: Liaqat, F., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/64874">Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> J. Vis. Exp. (195), (2023).
This video demonstrates a monocyte-derived dendritic cell, MoDC-based assay to measure the immunogenicity of commercially available vaccines. MoDC assays investigate dendritic cell responses to antigens, pathogens, or treatments and can provide insights into immune responses, vaccine development, and immunotherapy research.

림프구 증식을 유도하기 위한 백신 펄스 수지상 세포 기반 체외 분석

1. Production of Na&#239;ve MoDCs
NOTE: Whole blood samples were obtained from a single pathogen-free calf by jugular vein puncture with heparinized ...