이 프로젝트는 국립 보건 연구소 (5 P20 RR016461 8 P20 GM103499)에서 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (EPS-0903795). 퍼먼 대학의 연구 및 전문적인 성장과 퍼먼 이점 상에 의해 제공 또한 지원.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 동물 프로토콜은 퍼먼 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: A3242-01 허가 번호)에 의해 승인되었다. 사용 된 버퍼가 버퍼 및 솔루션의 표에서 확인할 수 있습니다 동안이 프로토콜에 사용되는 모든 재료와 장비, 재료 및 장비의 표에서 확인할 수 있습니다. 마우스 비장에서 림프구 1. 단일 세포 현탁액 <ol><li> CO 2 질식을 통해 마우스를 희생. 자궁 전위에 의해 안락사를 확인합니다. 참고 : 같은 성별의 (예를 들어, / 6 C57B)이 6-8주 된 동종 마우스에서 비장을 사용합니다. 일반적으로, 두 비장 처리됩니다. </li><li> 풍부 70 % 에탄올 수용액 및 헤드가 왼쪽 직면하도록 동양으로 동물 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여 위쪽으로 멀리 t에서 동물의 피부를 리프트그는 몸. 가위를 사용하여 동물의 복부 주변의 피부를 통해 작은 홈을 잘랐다. 손가락을 이용하여 뒷다리의 시작 목 복막을 노출시키는 절 결부의 양쪽을 당긴다. 비장은 복막 바로 아래에 표시되어야합니다. </li><li> 집게를 사용하여 복막을 들어 올려 비장을 노출 할 수있는 작은 절개를합니다. 집게와 비장을 제거하고 지방과 결합 조직을 멀리 애타게 가위를 사용합니다. </li><li> 2 % 태아 소 혈청으로 보충 된 10 ml의 PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 비장을 배치 (이하 PBS + 2 % 이상으로 함). 단일 세포 현탁액을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 일반적인 복구 비장 당 60-90000000 사이의 세포이며, 일반적으로, 2 백만 세포 샘플 당이 필요하다. 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행한다. </li><li> 멸균 100mm 조직 배양 접시에 비장을 가만히 따르다. </li><li> T 두 프로스트 현미경 슬라이드를 얻어 개최두 거친 프로스트 표면이 서로를 향해 안쪽으로 마주 보도록 그는 슬라이드. PBS + 2 % 용액에 슬라이드를 습윤 페트리 접시에 붓고. </li><li> 여전히 침수 가장자리에, 슬라이드의 프로스트 표면 사이의 비장을 잡고 서로 (그림 1A)에 대해 앞뒤로 슬라이드를 움직여 부드럽게 비장 갈기. 세포는 배양 접시에 빠질 것입니다. 모든 셀이 출시과 비장의 유물 (그림 1B) 흰색 표시 될 때까지 연마를 계속합니다. </li><li> 피펫으로 세포 현탁액을 그려 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 필터를 통해 천천히 필터링합니다. 빨간 펄프의 작은 조각이 필터 (그림 2A)에 존재할 수 있습니다. <ol><li> 필터가 상승하면, 부드럽게 필요에 따라이 과정을 반복, 유체를 통해 드레인과 50 ML 원뿔 관에 다시 필터를 배치하고 계속 할 수 있도록 약간 들어 올려. 5 개 이상이면 처리 spleENS, 두 개의 배치에 나누어 각각 새로운 필터를 사용하는 것이 필요할 수있다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부를 사용하여 부드럽게 스트레이너 (도 2b)를 통해 나머지 세포를 포함하는 적색 펄프를 누른다. 모든 빨간 펄프 필터 (그림 2C)를 통과 한 것을 확인하기 위해 필터 바닥과 측면을 모두 눌러해야합니다. </li><li> 조직 배양 접시에 10 mL의 PBS + 2 %를 추가하고 남아있는 세포를 복구하기 위해 슬라이드, 주사기 스토퍼, 그리고 요리를 세척 할 때 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 같은 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 이 단계가 필요한만큼 반복합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. PBS + 2 %의 미량이 튜브에 남아있을 것이다. 튜브 캡과 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 펠릿을 가볍게. </li><li> 광고로를 Lyse 적혈구ACK 용해 버퍼의 딩 2 용액 (0.15 M NH 4 CL, 1 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, 4 ° C에서 7.2, 저장소의 pH) 원뿔 튜브에 비장 당 회전 보장하기 위해 튜브를 반전 모든 세포 ACK 버퍼와 접촉. 부드럽게 실온에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이 친다. </li><li> PBS + 2 % ACK 버퍼 중화 튜브를 첨가하여 50 ml의 세포 현탁액의 양을 준비한다. 4 ℃에서 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고 10 시간을 전환. 원심 분리가 완료되면, 펠렛을 백색 (도 3)이어야한다. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. 튜브에 PBS + 2 %의 미량 남기기 튜브를 캡핑하고, 재현 탁을 위해 펠릿을 가볍게. </li><li> T 세포 배지 [10 % FBS, 10 mM의 HEPES (PH 7.0), 2 mM의 루타, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 또한 10 ㎖를 추가 부드럽게하여 펠릿을 재현 탁로 pipetting 아래. 그런 다음 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 새로운 70 μm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 원래 튜브 헹구고 여과 셀의 나머지 부분을 포함하는 튜브에 70 μm의 필터를 통해 통과하는 T 세포의 다른 매체를 사용하여 5 ~ 10 mL로. 두 개 이상의 비장을 처리하면, T 세포 배지의 부피는 회복을 최대화하도록 증가 될 수있다. </li><li> 준비가 염색 할 때까지 얼음에 세포를 유지합니다. 세포 계산과 생존에 액세스 할 수 있어야합니다. <ol><li> 세포를 계산하려면 24 PBS + 2 % ㎖의 3 ㎖ 0.4 % 트리 판 블루로 세포의 3 ㎖을 결합한다. 로드 향상 노이 바 우어의 혈구의 각 챔버에이 10 ㎖. 트리 판 블루 배제에 의해 평가로 생존은 85-95% 사이에 일반적입니다. </li></ol></li></ol> 2. 생존과 표면의 얼룩 <ol><li> 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 1 × 107 세포 / ml의 농도로 T 세포 배지에서 세포를 재현 탁. TRANSFU 바닥 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 200 만 ER 셀 (100 ㎖). </li><li> 4 ° C에서 300 XG에서 10 분 동안 96 웰 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 잘 싱크대에 웰 플레이트에서 액체를 쓸어 넘겨 각각의 상층 액을 분리합니다 (세포 펠렛은 잘 유지됩니다) 깨끗한 종이 타월에있는 플레이트에 뿌리며 마치. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하여이를 세포 씻어 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리 하였다. 별도의 표시가없는 한, 모든 세척이 방법을 수행합니다. 참고 :이 고칠 PI 얼룩 방해로 PBS + 2 %를 사용하지 마십시오. </li><li> 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 각 웰에 새로 제조 된 상업 얼룩 (예를 들어, 고칠 붉은 죽은 세포 얼룩) 100 ㎖를 추가합니다. <ol><li> PBS에서 1:10 희석 한 다음 DMSO의 반응성 염료 원액의 1:10 희석하여 얼룩을 확인합니다. 빛으로부터 보호 30 분 동안 4 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> P를 원심 분리기후반 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안. 이 시점에서, 오프 조직 문화 후드 라이트와 함께 접시에 모든 작업을 수행합니다. </li><li> 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 다음의 Fc 블록 용액 100 ㎖를 추가합니다. 된 Fc 블록 원액 1 희석 된 Fc 블록 솔루션을 확인하십시오 : PBS에서 100. </li><li> 희석 된 항체를 PBS에 대해 표면의 오염 (예를 들어, 항 CD4 또는 CD8 항)를 사용하고, 각 웰에 100 ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 4 ℃에서 30 분 동안 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 표면 얼룩 항체가 최적의 성능을 위해 역가해야합니다. 제조업체의 프로토콜 당 400 희석 : 200 또는 1 : 일반적으로 1을 사용합니다. </li></ol> 히스톤 H3 3. 세포 내 염색 <ol><li> 표면 얼룩의 부화 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 마지막 세척 후, 각 웰에 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 96 웰 플레이트를 배양한다. dilut 4 % 파라 포름 알데히드를 확인PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드를 보내고. 이 신선합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 파마 / 차단 솔루션을 확인 (주 파마 솔루션은 PBS + 인 2 % + 0.02 % 트리톤 X-100, 저장 4 ° C에서) 100 ㎖ 주식 파마 액 당 정상 토끼 혈청 2 ㎖를 결합하여. 60 ㎖ / 샘플에 대한 충분합니다. </li><li> 부드럽게 거품을 만드는 않도록주의하면서, 아래로 피펫 팅에 의해 잘 잘 각 샘플에 40 ml의 파마 / 블록을 추가하고 혼합한다. 어둠 속에서 45 분 동안 실온에서 접시를 품어. 단계 3.6 파마 / 벽돌 남은 저장합니다. </li><li> 단계 3.5에 예약 파마 / 차단 솔루션에 형광 접합 히스톤 H3K4me1 항체를 희석하고 각 웰에이 희석의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다. 4 ℃에서 1 시간 동안 어둠 속에서 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 R-피코 에리 트린의 결합 키트를 사용하여 결합 H3K4me1 항체를 사용합니다. </li><li> 두 번 PBS + 2 %의 세포를 씻으십시오. </li><li> (200)에서 세포를 재현 탁PBS + 2 % μL 및 유동 세포 계측법 분석을위한 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 샘플은 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최적의 결과 두 가지 일 이내에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 단독 스테인드 샘플 보상 유세포 컨트롤로서 사용될 수있다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 T 세포의 염색질 응축의 평가를 허용하는 프로토콜을 개발했다. 그것은 히스톤 H3 항체는 나이브 세포에서 용이하게 그 에피토프에 액세스 할 수없는 간단한 관찰에 의존하지만, T 세포가 활성화되면, 이러한 항체는 동일한 에피토프에 결합 할 수있다. 처리 군 사이의 MFI 히스톤 H3의 염색과 비교하여, 또는 축합 decondensation의 상대적인 정도를 결정할 수있다. 우리는 흉선 세포 발달 동안 및 T 세포 활성화 4 중 상대적 응축 상태를 결정하기 위해 이러한 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 decondensation 과정 (5)을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 염색질 응축 상태를 검출하는 히스톤 H3 항체의 사용에 의존한다. T 세포 활성화 4 동안 히스톤 변형 전역 변화가 없기 때문에, 우리는 염색질을 평가 H3K4me1 항체를 사용할 수있다이 프로토콜의 상태. 우리는 수정되지 않은 히스톤 H3에 대해 제기 항체를 사용했다; 그러나, 생성 된 신호는 매우 약하다 전체였다. 수정되지 않은 히스톤 H3에 대한 항체는 웨스턴 블롯에서 더 잘 작동하는 동안 우리의 경험에 의하면, 수정 히스톤 H3에 대해 제기 항체는 면역에 더 잘 작동하고 세포 계측법 분석 흐름. 이는 우리가 시도되지 않은 것이 있지만, 다른 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하는 것이 가능하다는 것을 주목해야한다. 파마 / 벽돌과 히스톤 H3 항체 단계는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 사용 파마 / 블록 용액의 양은 스톡 파마 액 이루어질 때마다 최적화 될 필요가있다. 이것은 스톡 용액의 상이한 희석 성능을 비교함으로써 수행 될 수있다. 전형적인 실험은 3 시간 (그림 4)에 대해 활성화 된 것과 순진한 T 세포의 염색질 상태를 비교하는 과정이 수반됩니다. 하나는 위에 MFI에 가장 큰 변화를 생산 희석을 선택해야합니다시간 분석. 원액 첫번째 단계 3.5 파마 / 블록을 추가 단계 3.4 이후만큼 ml의 100 PBS + 2 %에서 세포를 재현 탁하고 의해 파마 / 블록 강도 저하 PBS + 2 %로 희석 할 수있다. 유사한 파일럿 실험은 형광 공액 히스톤 H3 항체의 항체의 새로운 배치가 표시 될 때마다 다른 희석액을 테스트하기 위해 사용되어야한다. 이러한 단계 (활성화 3 시간 이내, 예) 초기 T 세포 활성화에 축합 차이의 성공적인 검출에 특히 중요하다. 때때로, 히스톤 H3 항체로 염색하지 않습니다 때문에 투과성이 도착하지 않는 세포가있다. 이 파마 / 블록을 추가 할 때 세포가 잘 재현 탁하지 않은 경우 발생할 수 있습니다 또는 파마 / 벽돌이 지탱할 수없는 경우. 이 세포는 히스톤 H3 염색의 히스토그램을 시각화 할 때 축에 가압 이벤트로 나타납니다. 전체 MFI를 왜곡 할이 사건 이후,이 이벤트는 gatin에 의해 분석에서 생략 할 수있다G 히스톤 H3 양성 세포의 정규 분포. 추가 지원은 문제 해결 설명서 (표 1)에서 찾을 수 있습니다. 고칠 수 죽은 세포 얼룩의 포함은 분석에서 세포 생존 능력의 평가를 할 수 있습니다. 특정한 자극은 세포 사멸을 유도 할 수 있기 때문에, T 세포 활성화를 조작하는 경우에 절대적으로 중요하다. 이러한 경우, 히스톤 H3 항체 결과 오해로 이어지는 생균 다르게 사균에서 히스톤 결합 할 수있다. 이 프로토콜은 염색질 상태의 높은 처리량 분석을 가능하게, 96- 웰 플레이트 형식으로 사용하기 위해 설계된다. 6-8 주령 암컷 마우스에서 비장은 일반적 프로토콜을 사용 60-90000000 간 세포를 수득한다. 염색 프로토콜은 샘플 당 2 백만 세포를 필요로하기 때문에, 용이 한 단일 96- 웰 플레이트에 단일 비장 중으로 여러 처치 군과 시점을 분석 할 수있다. 그것은 P에있다샘플 당 더 적은 세포와 프로토콜을 erform; 그러나, 원심 분리 단계의 수와 각 단계에서 세포의 고유 손실, 훨씬하여 세포의 수를 낮추는 것이 바람직하지 않다. 우리는 성공적으로 샘플 당 1 백만 세포와 프로토콜을 완료했습니다. 우리는 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + 세포 독성 T 세포의 염색질 상태를 검사하기 위해 사용되는 프로토콜. 프로토콜은 표준 표면 얼룩을 포함하기 때문에 가능 이루어진다. 프로토콜 용이 인구 특정 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 다른 림프구 아 집단에서 염색질의 검사를 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜은 쉽게 관련 표면 마커를 인식하는 항체로 오랫동안 다른 세포 유형에 사용할 수 있고 적절한 고정 / 투과성으로 조건 알려져 있습니다 적용 할 수 있습니다.

유동 세포 계측법은 세포 집단의 다수의 물리적 파라미터의 형광 분석을 위해 개발 된 레이저 기반 기술이다. 이 기술이나 세포 내 유체 스트림의 만남에 현탁 세포로서 레이저 흥분 형광 마커를 작동한다. 이 마커는 감지 광전자 증 튜브에 의해 정량화 빛을 방출한다. 유동 세포 계측법은 전통적 세포 집단을 식별하는 데 사용 되었으나, 이는 세포막의 무결성, 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 거래 1-3 포함한 전지 특성의 배열을 연구 할 때 유용한 기술로 입증되었다. 우리는이 기술들은 시험 관내 (4)에서 활성화 될 때 T 세포의 염색질 상태를 검출하는데 사용될 수있는 프로토콜을 개발했다. 우리는 또한 T 세포 (5)의 활성화를 유도 염색질 decondensation의 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. T 세포 activati​​on 및 확산은 적절한 면역 반응에 중요하다. T 세포, 면역 시스템 내 림프구의 특정 서브 세트는 적절한 면역 반응 및 면역 학적 메모리의 개발에 요구된다. 항원 (6에서 검토)의 무부하 T 세포의 세포 표면에있는 T 세포 수용체 (TCR)에 주요 호환성 착체의 컨텍스트에서 제공 될 때 활성화가 개시된다. 이는 세포의 Ca2 + 농도 (7) 및 (8-10에서 검토)의 활성화에 필요한 전사 인자의 핵 전좌의 증가 남중 T 세포 내의 동적 고도로 정렬 된 분자 일련의 이벤트를 트리거한다. 일단, T 세포는 인터루킨 -2 (IL-2), JAK (야누스 키나제) / STAT를 이용하는 강력한 성장 인자에 반응하는 능력을 획득 활성화 (신호 변환기와 전사 액티베이터) 경로가 활성화 T의 클론의 증식을 구동 셀 (11). 간략하게, IL-2 자극STAT 단백질 세포질 잠상 전사 인자의 계열의 인산화 결과. 인산화되면 STAT 단백질은 이량 화, 핵으로 이동시키다 및 세포주기 진행에 관련된 것들을 포함하는 유전자의 발현을 구동한다. T 세포, T 세포의 증식에 필요한 12,13 STAT5 통해 IL-2 신호. 활성화 된 T 세포의 클로 날 팽창을 달성하기 위해, 항원 - 결합 TCR (나이브 T 세포)를 경험하지 아니한 세포는 IL-2의 강력한 효과를 무시하는 메커니즘을 가져야한다. 이것은 염색질 상태의 규제를 통해 달성된다. 나이브 T 세포는 IL-2 자극에 응답 STAT5-DNA 결합을 금지 응축 된 염색질을 갖는다. 활성화되면, 염색질 decondenses 및 STAT5는 클론 증식 4를 허용, 표적 유전자의 프로모터에 액세스 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 염색질 상태의 변화는 히스톤 PROTEI의 후생 유전 학적 변형에 의존하지 않는다NS (검토를 위해, 14 참조) 우리는 T 세포 활성화 4시 히스톤 수정에는 글로벌 변화를 관찰하지 않기 때문에. 이 연구를 수행하는 동안, 우리는 히스톤 단백질에 대해 제기 항체는 순진 세포에 자신의 에피토프를 액세스하는 어려움을 가지고 있다는 것을 발견,하지만 활성화에 따라 그보다 쉽게 자신의 항원 결정기 (4)를 결합 할 수 있습니다. 따라서, 히스톤에 결합하는 항체는 염색질 응축 상태를 판독 역할을한다. 여기서 우리는 방법 T 세포에서 염색질 상태를 평가하기 위해 형광 접합 된 히스톤 H3 항체를 검출하는 유동 세포 계측법을 사용하도록 제안한다. 세포 집단 내의 염색질 응축은 히스톤 H3 염색의 평균 개화 강도 (MFI)로 측정된다. 염색질의 decondensation를 나타내는 T 세포 활성화, 히스톤 H3 염색 증가 MFI, 문맥에서. 히스톤 H3 세포 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 이외에,이 프로토콜은 또한 incorporaTES는 세포의 소집단의 분석을 허용, 염색 및 살아있는 세포에 대한 정착 얼룩 표면.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

적절한 면역 반응 동안 대기 T 세포는 항원 특이 적 T 세포 수용체에 대한 항원 제시에 따라 활성화된다. 이 항원을 인식하는 수용체를 부담 만 T 세포 클론의 증식을 이끈다. 염색질 decondensation는 T 세포 활성화의 특징이며, T 세포는 항원 결합 후에 증식하는 능력을 획득하기 위해 요구된다. 염색질 응축의 변화는 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하여 검출 할 수있다. 이 항체는 활성화 된 T 세포에서뿐만 아니라 그들이 할 수 나이브 T 세포에서의 항원에 결합 할 수 없습니다. 우리는 동시에 고칠 수 죽은 세포 얼룩 T 세포의 특정 표면 마커, 추적 가능성을 얼룩 및 히스톤 H3 단백질의 세포 내 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 염색 된 세포는 유세포 분석되고 염색질 응축 상태는 히스톤 H3 염색의 평균 형광 강도 (MFI)로 측정된다. ChromatT 세포의 활성화 과정에서 decondensation MFI의 증가로 입증된다

C57B / 6 마​​우스에서 림프구 프로토콜에 따라 단일 세포 현탁액으로 처리하고 표준 혈구를 사용하여 계수 하였다. 세포를 2 × T 세포 배지에서 6 / ㎖ 15 ㎖의에 중으로 원추형 튜브에 시딩하고 방치하거나, ​​37 ℃에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체 (클론 4C11)로 자극했다 표준 조직 문화 인큐베이터. 죽은 세포를 염색 한 후 세포는 프로토콜에 따라 FITC-CD8 및 APC-CD4 항체를 사용하여 염색 표면했다. 히스톤 접근성 유동 세포 계측법 (그림 4)을 통해 분석 하였다. 두 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포, 평균 형광 강도 (MFI)를 축합 염색질 상태를 나타내는, 낮다. 세포를 항 CD3과 활성화되면 염색질이 decondensed 것을 나타내는 (p &lt;0.001, 학생 t 검정) 상당히 MFI 증가 항체. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> 젖 현미경 슬라이드를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 비장을 처리하기위한도 1 기법. (A) 비장 두 현미경 슬라이드의 표면에 대하여 가압 젖된다. (B) 슬라이드 비장의 유물이 흰색 때까지 100mm 페트리 접시에 앞뒤로 서로 해제 림프구에 대한 이동합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> 비장 후에 남아 70mm 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 눌러 스토퍼 주사기를 사용하여도 2. (A) 펄프 나 레드<html> 단일 세포 현탁액으로 처리되고 70mm 세포 여과기를 통과 s는. (B) 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 누르 사용된다. (C) 주사기를 사용한 후 거의 셀 스트레이너에 남아있는 빨간 펄프가 없어야합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> 적혈구도 3 ACK 용해. 용해 ACK로 종래 단일 마우스 비장으로부터 생성 단일 세포 현탁액 (A) 원심 분리. (B) 적혈구 ACK 용해 후, 세포 펠렛은 백색이어야한다.= &quot;_ 빈&quot;을 얻을&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> 도 4 프로토콜의 대표적인 결과. (A) 게이팅 방식은 CD4 + T 림프구에 염색질 상태를 분석하기 위해 사용했다. (B 및 C) T 세포를 방치하거나 (삼중)에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체로 활성화 하였다. 세포는 CD4 + 세포 (B) 및 CD8 + 세포 (C) 내의 염색질 응축을 결정하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 H3K4me1 염색의 평균 형광 강도의 표준 편차 ± 수단이다. * P &lt;0.001 (학생의 T- 테스트) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">시간을 클릭하세요</a>감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> 표 1. 문제 해결 설명서 일반적인 문제와 가능한 해결책에 대한 빠른 참조.

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

the-use-of-flow-cytometry-to-assess-the-state-of-chromatin-in-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K 조회수.  Furman University.  유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록 

비디오: The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

자가 면역 대해 줄기 세포 유래의 항원 특이 적 조절 T 세포의 발달

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

유동 세포 분석용 마우스 신장 거주자 CD8+ T 세포의 격리

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...