פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (5 P20 RR016461 ו -8 P20 GM103499), הקרן הלאומית למדע (EPS-0,903,795). תמיכה נוספת מסופקת על ידי המחקר ומקצועי הצמיחה של אוניברסיטת פורמן ופרסים יתרון פורמן.

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי (מספר ההיתר: A3242-01) הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת פורמן. ניתן למצוא את כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה בטבלה של חומרים וציוד, ואילו ניתן למצוא מאגרים משמשים בטבלה של חוצצים ופתרונות. 1. השעיה תא בודדת של ימפוציטים מטחול העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים באמצעות CO 2 מחנק. לאשר המתת חסד על ידי נקע בצוואר הרחם. הערה: השתמש בטחולים משני עכברים 6-8 שבוע ישנים isogenic (למשל, C57B / 6) מאותו המין. בדרך כלל, שני טחולים מעובדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסס את בעלי החיים למכביר עם 70% אתנול ופתרון אוריינט כך שהראש פונה שמאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים את העור של החיה כלפי מעלה והרחק מtהוא הגוף. בעזרת מספריים, לחתוך חריץ קטן דרך העור ליד הבטן של החיה. שימוש באצבעות, למשוך כל צד של החריץ לחשוף את הצפק מהצוואר ועד לתחילת הרגליים האחוריות. הטחול צריך להיות גלוי ישירות מתחת לצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להרים את הצפק ולעשות חתך קטן כדי לחשוף את הטחול. הסר את הטחול עם מלקחיים ולהשתמש במספריים כדי להקניט משם כל שומן ורקמת חיבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטחול לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר PBS בתוספת 2% בסרום שור עוברי (להלן כPBS + 2%). שמור את הצינור על קרח עד מוכן להתחיל ההשעיה התא בודדת. הערה: התאוששות אופיינית היא 60-90 מיליון תאים לטחול, ובדרך כלל, 2 מיליון תאים דרושים לדגימה. לבצע את כל השלבים הבאים במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג הטחולים לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ&quot;מ סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית ולהחזיק tהוא מחליק כך ששני המשטחים החלבית מחוספס פנים פנימה לכיוון אחד לשני. להרטיב את השקופיות בפתרון + 2% PBS שפך לתוך צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הטחול בין המשטחים החלבית של השקופיות, עם הקצוות עדיין שקועים, ולטחון את הטחול בעדינות על ידי העברת השקופיות קדימה ואחורה אחד נגד השני (איור 1 א). התאים ייפלו לתוך צלחת פטרי. המשך שחיקה עד שכל התאים שוחררו והשרידים של הטחול להופיע לבנים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את ההשעיה התא בpipet ולסנן אותה באיטיות דרך מסנן 70 מיקרומטר לתוך צינור סטרילי חדש 50 מיליליטר חרוטי. שים לב שחתיכות קטנות של עיסה אדומה תהיה נוכחת במסנן (איור 2 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המסנן עולה, בעדינות להרים אותו מעט כדי לאפשר לנוזל להתנקז דרך ולמקם את המסנן בחזרה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהמשיך, לחזור על תהליך זה במידת צורך. אם עיבוד יותר מ -5 spleENS, ייתכן שיהיה צורך לחלק לשתי קבוצות ולהשתמש במסנן חדש עבור כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחלק הפקק של מזרק 3 מיליליטר לחץ בעדינות את העיסה האדומה המכילה את התאים שנותרו במסננת (איור 2). הקפד ללחוץ שתי תחתית המסנן וצדדים כדי להבטיח שכל העיסה האדומה עברה דרך המסנן (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 mlof + 2% PBS לצלחת תרבית הרקמה ולהשתמש בזה כדי לשטוף את השקופיות, פקק מזרק, ומנה לשחזר את כל תאים שנותרו. להעביר את זה דרך אותה מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. חזור על שלב זה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא המסוננת ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. עקבות סכום של 2% PBS + יישאר בצינור. שווי הצינור וקפיצי גלולה עד גלולה היא resuspended לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדום Lyse ידי מודעהדינג 2 מ&quot;ל של ACK תמוגה מאגר (0.15 מ &#39;NH 4 Cl, 1 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA, pH 7.2, חנות ב 4 ° C) לטחול לצינור חרוטי ולסובב ולהפוך את הצינור כדי להבטיח שכל התאים באים במגע עם חיץ ACK. מערבולת בעדינות את צינור דקות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח של ההשעיה תא 50 מיליליטר על ידי הוספת PBS + 2% הצינור לנטרל את חיץ ACK. להפוך את הצינור 10 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה היא מוחלטת, גלולה צריכה להיות לבן (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למזוג וזורקים supernatant, נזהר שלא להפריע את הכדור. השאר עקבות סכום של PBS + 2% בצינור, מכסה את הצינור, וקפיצי גלולה לresuspend זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תקשורת T תא [10% FBS, 10 מ&quot;מ HEPES (pH 7.0), 2 מ&quot;מ Glutamax, פירובט 1 מ&quot;מ נתרן, חומצות אמינו לא חיוניות 1X, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 מ&quot;מ β-mercaptoethanol], ועוד resuspend גלולה ידי בעדינותpipetting למעלה ולמטה. אז לסנן את ההשעיה דרך מסנן 70 מיקרומטר חדש לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש נוסף 5-10 מיליליטר של תקשורת תא T לשטוף את הצינור המקורי ולהעביר את זה דרך המסנן 70 מיקרומטר לתוך הצינור המכיל את שאר התאים המסוננים. אם עיבוד יותר משני טחולים, הנפח של תקשורת תא T יכול להיות מוגבר על מנת למקסם את ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התאים על קרח עד מוכן להיות מוכתמים. יש לספור תאים וכדאיות גישה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור תאים, לשלב 3 מיליליטר של תאים עם 24 מיליליטר של PBS + 2% ו- 3 מיליליטר של 0.4% trypan כחולים. טען 10 מיליליטר של זה לכל תא של hemocytometer נויבאואר השתפר. כדאיות, כפי שהוערך על ידי הרחקת trypan הכחולה, היא בדרך כלל בין 85-95%. </li></ol></li></ol> 2. יכולת הקיום והכתמת Surface <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend תאים בתקשורת תא T לריכוז של 1 x 10 7 תאים / מיליליטר. Transfאה 2 מיליון תאים (100 מיליליטר) לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 96-גם תחתית-U. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחת 96-היטב במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מכל טוב ידי מצליף נוזל בתוך הצלחת גם לכיור (התא גלולה יישאר בבאר) ומספיג את הצלחת על מגבת נייר נקייה. לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב200 μl PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לבצע את כל שטיפות בדרך זו, אלא אם כן צוין אחרת. הערה: אל תשתמש בPBS + 2% כפי שיפריע לכתם PI ניתן לתקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולהוסיף כתם של מוכן טרי מסחרי (למשל, כתם תא ניתן לתקן אדום מת) לכל 100 מיליליטר היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הכתם על ידי דילול 01:10 פתרון מניות צבע תגובתי בDMSO אחרי דילול 1:10 ב PBS. דגירה את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מוגנות מפני אור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמ &#39;מאוחר במשך 10 דקות ב 300 XG ב 4 מעלות צלזיוס. בנקודה זו קדימה, לבצע את כל העבודה עם הצלחת עם מכסה המנוע אור תרבית רקמה מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ידי מצליף הצלחת ולאחר מכן להוסיף לפתרון בלוק Fc 100 מיליליטר. הפוך פתרון בלוק Fc על ידי דילול מניות פתרון בלוק Fc 1: 100 ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים לדלל לשמש לצביעת משטח (למשל, אנטי CD4 או אנטי CD8) בPBS ולהוסיף 100 מיליליטר לכל טוב. דגירה צלחת 96-היטב במשך 30 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור. הערה: נוגדני כתם משטח צריכים להיות titered לביצועים אופטימליים. בדרך כלל משתמש בדילול 1: 400, לפרוטוקול של היצרן: 200 או 1. </li></ol> 3. תאיים מכתים להיסטון H3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של כתם המשטח, לשטוף את התאים פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, להוסיף של paraformaldehyde 4% 100 μl היטב כל אחד. דגירה צלחת 96-היטב במשך 5 דקות על RT. הפוך paraformaldehyde 4% על ידי diluting paraformaldehyde 16% ב- PBS. להפוך את זה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון פרם / חסום (פתרון פר המניה הוא PBS + 2% + 0.02% Triton X-100, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס) על ידי שילוב של 2 מיליליטר של סרום ארנבת רגיל לכל 100 מיליליטר פתרון פר מניה. לעשות מספיק עבור 60 מיליליטר / מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 מיליליטר פר / חסום לכל דגימה היטב ומערבבים היטב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, נזהר שלא לעשות בועות. דגירה את הצלחת על RT במשך 45 דקות בחושך. להציל את שנותר פרם / חסום לצעד 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן היסטון H3K4me1 fluorescently מצומדות בפתרון פרם / חסום שמורות בשלב 3.5 ולהוסיף 10 μl של דילול זה לכל אחד. מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה צלחת 96-היטב בחושך במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: השתמש בנוגדן H3K4me1 מצומדת באמצעות ערכת נטיית R-Phycoerythrin הבא הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמים PBS + 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 200μl PBS + 2% ולהעביר את הדגימות לצינורות FACS לניתוח cytometry זרימה. ניתן לאחסן הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. לקבלת תוצאות אופטימליות לנתח הדגימות בתוך יומיים. ביחידים דגימות מוכתמות יכולות לשמש כcytometry זרימת בקרות פיצוי. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פיתחנו פרוטוקול המאפשר להערכת עיבוי הכרומטין בתאי T. היא מסתמכת על התצפית הפשוטה שנוגדני היסטון H3 לא יכולים לגשת epitopes בקלות בתאים נאיביים, אבל על הפעלת תאי T, אותו נוגדנים אלה יכולים להיקשר לאפיטופים. על ידי השוואת צביעת MFI של היסטון H3 בין קבוצות טיפול, קרוב המשפחה מהדרגה של עיבוי או decondensation ניתן לקבוע. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לקבוע את מצב עיבוי יחסי בפיתוח thymocyte ובמהלך הפעלת תא T 4. גם אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנונים ששולטים בתהליך decondensation 5. פרוטוקול זה מסתמך על השימוש בנוגדן היסטון H3 כדי לזהות מצב עיבוי הכרומטין. מכיוון שאין שינוי הגלובלי בשינוי היסטון במהלך הפעלת תא T 4, אנו יכולים להשתמש בנוגדן H3K4me1 להעריך הכרומטיןמעמד בפרוטוקול זה. השתמשנו נוגדנים שהועלו נגד ללא שינוי היסטון H3; עם זאת, את האות מיוצרת הייתה כללית הרבה יותר חלשה. מניסיוננו, נוגדנים שהועלו נגד היסטון H3 שונה לעבוד טוב יותר בimmunofluorescence וcytometry זרימת מבחני, ואילו נוגדנים נגד ללא שינוי היסטון H3 לעבוד טוב יותר בכתם מערבי. יש לציין שזה גם אפשרי להשתמש נוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון אחרים, למרות שיש לנו לא ניסינו את זה. צעדי הנוגדן פרם / הבלוק והיסטון H3 הם השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול. הסכום של פתרון פרם / בלוק משמש צריך להיות מותאם בכל פעם פתרון פר המניה עשוי. ניתן לעשות זאת על ידי השוואת הביצועים של דילולים שונים של פתרון מניות. ניסוי טיפוסי כרוך השוואת מעמד הכרומטין בתאי T נאיביים לאלה הופעלו במשך 3 שעות (איור 4). יש לבחור הדילול שמייצר את השינוי הגדול ביותר בMFI מעלתקופת הזמן ניתחה. פתרון המניות יכול להיות מדולל ב 2% PBS + כדי להקטין את כוח הפר / חסום על ידי resuspending הראשון תאים בככל 100 מיליליטר PBS + 2% לאחר שלב 3.4 ולאחר מכן להוסיף את פרם / חסום בשלב 3.5. יש להשתמש בניסוי פיילוט דומה כדי לבדוק דילולים שונים של נוגדן היסטון H3 fluorescently מצומדות בכל פעם קבוצה חדשה של נוגדן שכותרתו. צעדים אלה הם קריטיים במיוחד לזיהוי מוצלח של הבדלי עיבוי מוקדם בהפעלת תא T (למשל, בתוך 3 שעות של הפעלה). מדי פעם, יש תאים שלא מקבלים permeabilized וכך לא יהיה כתם עם נוגדני היסטון H3. זה יכול לקרות אם התאים אינם resuspended גם בעת הוספה פרם / חסום או אם הפר / הבלוק הוא לא מספיק חזק. תאים אלה יופיעו כאירועים נלחצו הציר כאשר חזותי היסטוגרמה של מכתים היסטון H3. מאז אירועים אלה להטות את MFI הכולל, ניתן להשמיט את האירועים הללו מניתוח על ידי gatinז ההתפלגות הנורמלית של תאים חיוביים היסטון H3. ניתן למצוא סיוע נוסף במדריך לאיתור תקלות (הטבלה 1). הכללת כתם תאים מת ניתן לתקן מאפשרת ההערכה של כדאיות תא בassay. זה קריטי לחלוטין כאשר המניפולציה הפעלת תא T כי גירויים מסוימים יכולים לגרום למוות של תאים. במקרה כזה, נוגדני היסטון H3 יכולים להיקשר ההיסטונים בתאים מתים באופן שונה מאשר בתאים חיים, שמוביל לפירוש לא נכון של התוצאות. פרוטוקול זה מיועד לשימוש בפורמט צלחת 96-היטב, המאפשר ניתוח תפוקה גבוה של מצב הכרומטין. טחול מעכבר נקבת 6-8 שבוע ישן בדרך כלל יניב 60-90 מיליון תאים באמצעות הפרוטוקול. מאז הפרוטוקול מכתים דורש 2 מיליון תאים לדגימה, אפשר בקלות assay קבוצות מרובות טיפול ונקודות זמן בשלושה עותקים עם טחול בודד על צלחת 96-היטב יחידה. אפשר עמ &#39;erform הפרוטוקול עם פחות תאים לדגימה; עם זאת, בשל מספר צעדי צנטריפוגה וההפסד הגלום של תאים בכל אחת מהפעולות הבאות, זה לא מומלץ להפחית את מספר התאים בהרבה. יש לנו הושלם בהצלחה הפרוטוקול עם 1 מיליון תאים לדגימה. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את מעמד הכרומטין בתאי עוזר CD4 + T ותאי T ציטוטוקסי CD8 +. זה מתאפשר כי הפרוטוקול כולל צביעת משטח סטנדרטית. הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לבחינה של הכרומטין בתת אוכלוסיות לימפוציטים אחרות באמצעות נוגדנים כנגד סמני משטח אוכלוסייה ספציפית. פרוטוקול זה יכול גם בקלות להיות מותאם לסוגי תאים אחרים, כל עוד נוגדני הכרת סמני משטח רלוונטיים הם ידועים תנאי הקיבעון / permeabilization זמינות ונכון.

Cytometry זרימה היא טכנולוגיה מבוססת לייזר שפותחה עבור הניתוח של פרמטרים פיזיים וניאון מרובים באוכלוסיות תאים. טכנולוגיה זו פועלת כתאים תלויים בזרם של מפגש נוזל לייזר, סמני ניאון מרגשים על או בתוך התאים. סמנים אלה ולאחר מכן פולטים אור שהוא זוהה ולכמת ידי צינורות מכפיל. בעוד cytometry הזרימה באופן מסורתי משמש לזיהוי אוכלוסיות של תאים, זה הוכיח להיות טכנולוגיה שימושית כאשר לומד מערך של מאפייני תא כוללים שלמות תא קרום, אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר חלבון 1-3. פיתחנו פרוטוקול המאפשר טכנולוגיה זו כדי לשמש כדי לזהות המצב של הכרומטין בתאי T כפי שהם מופעלים במבחנה 4. גם אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את המנגנון של decondensation הכרומטין מושרה הפעלת תאי טי 5. activatio תא Tn ושגשוג הם קריטיים לתגובה חיסונית תקינה. תאי T, תת-קבוצה מסוימת של לימפוציטים במערכת החיסונית, הנדרשים לתגובה חיסונית תקינה והפיתוח של זיכרון חיסוני. הפעלה היא יזם כאשר אנטיגן מוצג בהקשר של מתחם התאימות העיקרי לקולט תא T (TCR) ממוקם על פני השטח תאיים של תאי T שקטים (שנסקרו ב6). זה מעורר שורה של אירועים מולקולריים דינמיים והורה מאוד בתוך תאי T שיגיעו לשיא בעלייה בCa 2 + ריכוז תאיים 7 וטרנסלוקציה הגרעינית של גורמי שעתוק הנדרשים להפעלה (שנסקרה ב8-10). ברגע שהופעלו, תאי T להשיג את היכולת להגיב לאינטרלויקין -2 (IL-2), גורם גדילה חזק שמנצל את JAK (יאנוס קינאז) / STAT (איתותים מתמר וActivator של תמלול) מסלול לנהוג התפשטות משובט של T מופעל תאים 11. בקצרה, IL-2 גירויתוצאות בזירחון של חלבוני STAT, משפחה של גורמי שעתוק cytosolic סמויים. ברגע שפוספורילציה, חלבוני STAT dimerize, translocate לגרעין ולנהוג ביטוי של גנים כולל אלו מעורבים בהתקדמות מחזור התא. בתאי T, IL-2 אותות באמצעות STAT5, אשר נדרש להתפשטות תאי T 12,13. על מנת להשיג התרחבות משובט של תאי T מופעלים, אלה תאים שלא חוו אירוסין אנטיגן-TCR (תאי T נאיביים), חייבים להיות מנגנון להתעלם מההשפעות החזקות של IL-2. זו מושגת באמצעות הסדרת מעמד הכרומטין. תאי T נאיביים להחזיק הכרומטין תמצית האוסר אירוסין STAT5-DNA בתגובה לIL-2 גירוי. עם ההפעלה, decondenses הכרומטין וSTAT5 יכולים לגשת ליזמים של גני המטרה, המאפשרים ריבוי משובט 4. מעניין לציין, שינוי זה במעמד הכרומטין אינו תלוי בשינוי אפיגנטיים של protei היסטוןNS (לסקירה, ראה 14) כפי שאנו לא הבחנו בשינוי עולמי בשינוי היסטון במהלך הפעלת תא T 4. בעת ביצוע מחקרים אלה, גילו שהנוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון גם התקשו הגישה epitopes בתאים נאיביים, אבל זה על הפעלה בקלות רבה יותר יכול לקשור epitopes 4. לפיכך, נוגדנים מחייבים ההיסטונים משמש כקריאת נתונים למצב עיבוי הכרומטין. כאן אנו מציגים את השיטה לשימוש cytometry זרימה לזהות נוגדני היסטון H3 מצומדות fluorescently כדי להעריך את מצב הכרומטין בתאי T. עיבוי הכרומטין באוכלוסייה של תאים נמדד כעוצמת הפריחה הממוצעת (MFI) של מכתים היסטון H3. בהקשר של הפעלת תא T, MFI של עליות צביעת היסטון H3, המסמלת את decondensation של הכרומטין. בנוסף למדידת מצב הכרומטין באמצעות הכתמת היסטון H3 תאית, פרוטוקול זה גם incorporaTES המשטח מכתים וכתם ניתן לתקן לתאים חיים, המאפשר ניתוח של תת-אוכלוסיות של תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

במהלך תגובה חיסונית תקינה, תאי T שקטים להיות מופעלים בהצגת אנטיגן לקולטן תא T אנטיגן הספציפי שלהם. זה מוביל לשגשוג משובט של רק אלה תאי T הנושאים קולט שמזהה את האנטיגן. decondensation הכרומטין הוא סימן היכר של הפעלת תא T, ודורש לתאי T לרכוש את היכולת להתרבות לאחר האירוסין אנטיגן. שינוי בעיבוי הכרומטין זה ניתן להבחין באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבוני היסטון. נוגדנים אלה לא יכולים להיקשר לאפיטופים בתאי T נאיביים, כמו גם שהם יכולים בתאי T מופעלים. אנו מתארים כיצד להכתים בו זמנית סמני T תא ספציפי משטח, כדאיות מסלול עם כתם תאים מת ניתן לתקן, ולמדוד מצב הכרומטין באמצעות צביעה תאית של חלבוני היסטון H3. תאים ויטראז מנותחים על ידי cytometry זרימה ומעמד עיבוי הכרומטין נמדד כעוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של כתם היסטון H3. Chromatבdecondensation במהלך הפעלת תא T בא לידי ביטוי בגידול בMFI

לימפוציטים מעכבר C57B / 6 עובדו להשעית תא בודדת על פי הפרוטוקול ונספרו באמצעות hemocytometer סטנדרטי. תאי זרע בשלושה עותקים ב2 x 10 6 / מיליליטר בתקשורת T-cell ב 15 מיליליטר צינורות חרוטי ואינם מטופל, או מגורה עם 1 מ&quot;ג / נוגדנים אנטי CD3 מסיסים מ&quot;ל (4C11 שיבוט) במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב תרבות תקן רקמות חממה. תאים מתים היו מוכתמים ולאחר מכן תאים היו אז משטח מוכתם באמצעות FITC-CD8 וAPC-CD4 נוגדנים על פי הפרוטוקול. נגישות היסטון נותחה באמצעות cytometry זרימה (איור 4). בשני תאי CD4 + CD8 + T והנאיביים, העצמה הממוצעת הניאון (MFI) היא נמוכה, המסמל מדינת הכרומטין מרוכזת. כתאים מופעלים עם אנטי CD3 נוגדני עליות MFI באופן משמעותי (p &lt;0.001, מבחן t סטודנטים) מצביע על כך שיש הכרומטין decondensed. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> איור 1. טכניקה לעיבוד טחולים להשעית תא בודדת באמצעות שקופיות מיקרוסקופ חלבית. () הטחול הוא נלחצה המשטחים החלבית של שתי שקופיות מיקרוסקופ. (ב) השקופיות נעו הלוך ושוב אחד נגד ימפוציטים שחרור אחרים לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ עד השרידים של הטחול הם לבנים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> איור 2. שימוש בפקק מזרק ללחוץ נותר עיסה אדומה דרך מסננת תא 70 מ&quot;מ. () עיסה אדומה שנותרה לאחר טחול אני<html> שעות מעובדים להשעית תא בודדת ועבר דרך מסננת תא 70 מ&quot;מ. חלק הפקק של מזרק 3 מיליליטר (ב) משמש ללחץ בעדינות שנותרה עיסה אדומה דרך מסננת התא. (ג) לאחר השימוש במזרק, לא צריך להיות כמעט שום עיסה אדומה שנשארה במסננת התא. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> איור 3. תמוגה ACK של תאי דם אדומים. צנטריפוגה (א) להשעית תא בודדת שנוצרה מטחול עכבר אחת לפני Ack תמוגה. (ב) לאחר תמוגה ACK של תאי דם אדומים, התא גלולה צריכים להיות לבן.תקבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> איור 4. נציגי תוצאות של הפרוטוקול. תכנית () gating משמשת לניתוח מצב הכרומטין בלימפוציטים מסוג CD4 + T. (B ו- C) תאי T היו מטופל או הופעלו עם 1 מ&quot;ג / נוגדנים-CD3 אנטי מיליליטר מסיסים לשעה 3 (בשלושה עותקים). תאים נותחו לאחר מכן על ידי הזרימה cytometry כדי לקבוע עיבוי הכרומטין בתאי CD4 + (B) ותאי CD8 + (ג). הנתונים הם אמצעי ± סטיית תקן של עוצמת הקרינה הממוצעת של מכתים H3K4me1. * P &lt;0.001 (מבחן T- של סטודנטים) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ על h</a>ere כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> טבלת 1:. מדריך לאיתור תקלות התייחסות מהירה לבעיות נפוצות ופתרונות אפשריים.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

Cytometry זרימה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את מצב הכרומטין בתוך תאי T. פרוטוקול זה מאפשר למדענים להבין את העדות של decondensation הכרומטין במהלך הפעלת תא T הפגינה על ידי עלייה בעוצמת הפריחה הממוצעת (MFI) של נוגדני היסטון H3 ניאון

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

the-use-of-flow-cytometry-to-assess-the-state-of-chromatin-in-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  Furman University.  Cytometry זרימה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את מצב הכרומטין בתוך תאי T. פרוטוקול זה מאפשר למדענים להבין את העדות של decondensation הכרומטין במהלך הפעלת תא T הפגינה על ידי עלייה בעוצמת הפריחה הממוצעת (MFI) של נוגדני היסטון H3 ניאון 

Video: The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

בידוד של עכבר כליות תושב CD8+ תאי T לניתוח ציטומטריה זרימה

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

השימוש בcytometry הזרימה מנת להעריך את המצב של הכרומטין בתאי T

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video