This study is supported by American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 and the National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). We thank Roberto Mendez from Wayne State University for assisting in the preparation of the manuscript.

1. ניתוק של אבי העורקים מעכברים כל הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש של וויין סטייט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר לתוך תא האינדוקציה של מכונת ההרדמה. הגדר את זרימת isoflurane ל 4% בשילוב עם 25% אוויר צח 75% O 2. להרדים את העכבר על ידי שאיפה של isoflurane (4% לזירוז, ± 1.0% לצורך תחזוקה) בשיתוף עם 25% אוויר צח 75% O 2 באמצעות תא אינדוקציה ואחריו חרטומו ייעודי. הערה: הרדמה עם isoflurane ניתן להעביר 75% חמצן / 25% האוויר או 100% חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העכבר כל 5 דקות עד הרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה (חוסר נסיגת קמצוץ בוהן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העכבר מחוץ לתא האינדוקציה ולהמשיך משאיפת isoflurane למרות חרטומו הייעודי המחובר למכונת ההרדמה. הבוררisoflurane לזרום עד 1% כדי לשמור על הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם זה בהרדמה, לשים את העכבר על כרית ניתוח, ממוקמת על הגב שלו. השתמש קלטת מעבדה להבטחת הגפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מנורת חימום כדי לשמור על חומו של העכבר. שמור את המנורה במרחק מתאים מן העכבר, כך העכבר לא יתר חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס החזה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לנתיחה כדי לפתוח את הבטן מן קו האמצע, ולחשוף את אבי העורקים בבטן. פתח את חלל החזה ולחשוף את הלב והריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים בבטן באמצע במספריים לנתיחה כדי לשחרר את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 1 מ&quot;ל (עם 25 מחט G) עם 1 מ&quot;ל של PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין. להזריק PBS המכיל 1,000 U / mL של הפרין אל החדר השמאלי ו perfuse האאורטה. דחוף את הלב ואת הריאות עם מלקחיים על העורקים הגדולים לצד ימין של עכברים כדי לחשוף את אבי העורקים החזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את אבי העורקים החזי באמצעות-di מיקרומלקחיים ssection והכניס אותו 1x קר כקרח PBS (סטרילי), ולאחר מכן להעביר את המיכל לתוך ברדס זרימת אוויר למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מזרק 1 מ&quot;ל מצויד עם 25 G מחט לתוך קצה אחד של אבי העורקים, בעדינות ולשטוף את אבי העורקים עם PBS קר כקרח כדי להסיר את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים מיקרו לנתיחה כדי להסיר כמה שיותר רקמת השומן המצורפת וקטנים כלי לרוחב ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את אבי העורקים אנדותל מדיום הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אבי העורקים לתוך 1 טבעות מ&quot;מ באמצעות סכין אזמל סטרילי. קציר על 8 - 10 טבעות לכל האאורטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח כל טבעת אבי העורקים באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה. </li></ol> זרע 2. מגזרי אבי העורקים על מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אינו בשימוש, לשמור על מטריקס צמיחה מופחתת גורם -20 ° C כדי למנוע התמצקות. שים את מטריקס גורם מופחת הצמיחה 4 מעלות צלזיוס לפחות לילה כדי לאפשר הפשרה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool טיפים צלחת pipet 6 גם ל -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות10 דק &#39;. מכניסים את הצלחת 6-היטב על קרח מעיל אחד טוב של צלחת עם 1 מ&quot;ל של מטריקס ללא החדרת בועות אוויר. מניח את הצלחת בתוך 37 ° C חממה עבור 20 דקות, כדי לאפשר המטריצה ​​כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתל החלקים אבי העורקים על מטריצה ​​הקרושה באמצעות מלקחיים מיקרו לנתיחה סטרילית. מניחים את חתיכות לומן-צדה על המטריצה ​​בלי לגעת האנדותל. מניחים 3 - 4 מגזרים אבי העורקים קרובים זה לזה על המטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מספיק מדיום גידול תא האנדותל כדי לשמור קטעים רטובים (~ 200 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO 2 ל -4 עד 6 שעות. בסוף היום, להוסיף מספיק בינוני כדי לכסות את פלחי אבי העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו במגזר אבי העורקים הנבטה מעת לעת תחת מיקרוסקופ שלב ניגודיות. בדוק את הרמה בינונית צמיחת תאים בכל יום. הוסף בינוני במידת צורך לשמור מגזרי אב עורקים מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 th, בעדינות להסיר את המדיום ולהסיר את f מגזרים אבי העורקיםROM מטריקס באמצעות מחט סטרילית בלי להפריע לתאי אנדותל גדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול סלולרי חדש אנדותל ולאפשר לתאי אנדותל ממשיכים להתרבות על מטריקס עבור 2 - 3 ימים. </li></ol> 3. Passaging ראשונית של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל בקבוקון T12.5 חדש עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את צלחות מטריקס בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של proteinase נייטרלי (50 U / mL) אל צלחות מטריקס דגירה בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה פלטפורמה עם רעד מדי פעם. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד לוודא שרוב התאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של D-Val כדי להשבית את proteinase נייטרלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant בקפידה צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. לשטוף את הצלחת עם 2 מ&quot;ל D-Val ולאסוף את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות ב רוטמפרטורה מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל צלחת בבקבוק T12.5 מצופה ג&#39;לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות. </li></ol> 4. Passaging של לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל שתי צלוחיות T12.5 חדש עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. טריפסין- EDTA טרום חום (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) PBS סטרילית על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים בזהירות עם 37 סטרילי ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין- EDTA (0.25% טריפסין, 0.02 EDTA ב PBS) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 דקות או עד שרוב התאים להסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש בתאמגרד כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את התא גלולה ב 4 מ&quot;ל של מדיום צלחת צמיחת תאים האנדותל 2 צלוחיות T12.5 מצופה ג&#39;לטין. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שהם 85% - 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי האנדותל אבי העורקים עכבר לאחר 2 - 3 קטעים. </li></ol> אפיון 5. לתאי אנדותל אבי העורקים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-צלחת התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 6-גם צלחת עם ג&#39;לטין (0.1%), דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. יש לשטוף את הצלחת עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו חימום מוקדם של טריפסין-EDTA ו PBS סטרילי עד 37 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. הוסף 0.5 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA על התאים, דגירה של ~ 1 דקות ב 37 ° C or עד שרוב התאים להסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מדיום הגידול תא האנדותל כדי לעצור את העיכול. פיפטה השעית התא למעלה ולמטה תוך זמני הבקבוק כמה. במידת הצורך, להשתמש מגרד תא לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 900 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות את התאים במדיום גידול תא האנדותל. זרעים התאים בצלחת 6-היטב מצופה ג&#39;לטין בצפיפות של 3 x 10 5 / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים לצרף אל פני שטח התרבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיל-AC-LDL uptaken ו Ulex -lectin מחייב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את-3,3,3 1,1&#39;-dioctadecyl &#39;, 3&#39;- tetramethylindo-carbocyanine שכותרתו פרכלורט LDL acetylated (דיל-AC-LDL) ב -20 ° C. לפני מכתים, להפשיר דיל-AC-LDL על הקרח. Solu המניות דיל-AC-LDLtion הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אחסן את agglutinin europaeus Ulex FITC שכותרתו (Ulex -Lectin, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בשעה 4 מעלות צלזיוס. פתרון המניות Ulex -Lectin הוא 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. חנות Hoechst 33342 ב 4 מעלות צלזיוס. המניה Hoechst 33342 הפתרון הוא 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של פתרון המניות דיל-AC-LDL ל 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות לעשות לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מכתים, להסיר את המדיום הישן לשטוף את התאים בכל טוב עם המדיום החדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום החדש ולהוסיף המדיום מכתים דיל-AC-LDL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור H 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. הימנע אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל סטרילי 1x PBS המכיל 10 μL של Ulex -Lectin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים ב חדר טמפרטורותמחדש בחושך במשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Ulex-לקטינים על ידי שטיפת התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, דגירה 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הקרינה של-LDL דיל-AC (אדום, גל עירור של 576 ננומטר), Ulex -Lectin (ירוק, גל עירור של 519 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים פלורסנט עבור CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin ו Calponin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FITC- מצומדות חנות אנטי עכבר נוגדנים CD31, נוגדן אינס, VE-cadherin נוגדן, FITC- מצומדות IgG נגד ארנב ב 4 ° C בחושך. VEGFR2 חנות נוגדן -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פורמלין 10% כדי לתקן את התאים. שים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כ 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם פעמים 1x PBS 3 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים CD31, להוסיף 1 מ&quot;ל של 1x סטריליPBS המכיל 10 μL של נוגדן CD31-FITC. כדי להכתים או VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי המכיל 4 μL של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin נוגדן ראשוני, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים על ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים של VEGFR2, אינס, VE-cadherin או calponin, להוסיף 1 מ&quot;ל של PBS 1x סטרילי המכיל 10 μL של IgG נגד ארנב FITC- מצומדות. דגירת התאים על קרח למשך 1 שעות בחושך. הסר את IgG ידי שטיפת התאים עם פעמים סטריליים 3 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 33342 לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל, דגירה 10 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את הקרינה של CD31, VEGFR2, אינס, VE-cadherin, calponin (ירוק, גל עירור של 518-535 ננומטר) ו Hoechst (כחול, גל עירור של 361 ננומטר) עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+early+structural-functional+changes+in+the+endothelium+for+vascular+disease.">Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).</li><li>Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells,+antineutrophil+cytoplasmic+antibodies,+and+cytokines+in+the+pathogenesis+of+systemic+vasculitis.">Endothelial cells, antineutrophil cytoplasmic antibodies, and cytokines in the pathogenesis of systemic vasculitis.</a> Current rheumatology reports. 6, 184-194 (2004).</li><li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Reactive+protein-induced+endothelial+microparticle+generation+in+HUVECs+is+related+to+BH4-dependent+NO+formation.">C-Reactive protein-induced endothelial microparticle generation in HUVECs is related to BH4-dependent NO formation.</a> Journal of vascular research. 44, 241-248 (2007).</li><li>Wang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+circulating+CD31+/CD42-+microparticles+are+associated+with+impaired+systemic+artery+elasticity+in+healthy+subjects.">Increased circulating CD31+/CD42- microparticles are associated with impaired systemic artery elasticity in healthy subjects.</a> American journal of hypertension. 20, 957-964 (2007).</li><li>Mackay, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterisation+of+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+from+patients+with+severe+emphysema.">Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema.</a> Respiratory research. 14, 23 (2013).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue.">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> Journal of immunological methods. 244, 205-215 (2000).</li><li>Bowden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+alpha4+integrin+and+VCAM-1+in+CD18-independent+neutrophil+migration+across+mouse+cardiac+endothelium.">Role of alpha4 integrin and VCAM-1 in CD18-independent neutrophil migration across mouse cardiac endothelium.</a> Circulation research. 90, 562-569 (2002).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+induces+apoptosis+in+mouse+aortic+endothelial+cells+and+endothelial+dysfunction+in+mice+fed+high-calorie+and+high-cholesterol+diets.">Palmitate induces apoptosis in mouse aortic endothelial cells and endothelial dysfunction in mice fed high-calorie and high-cholesterol diets.</a> Life sciences. 92, 1165-1173 (2013).</li><li>Atkins, G. B., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+differentiation:+molecular+mechanisms+of+specification+and+heterogeneity.">Endothelial differentiation: molecular mechanisms of specification and heterogeneity.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 1476-1484 (2011).</li><li>Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brothers+and+sisters:+molecular+insights+into+arterial-venous+heterogeneity.">Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity.</a> Circulation research. 108, 929-939 (2008).</li><li>Shimamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+foods+on+contraction+of+endothelial+cells+as+a+key+mechanism+in+atherogenesis+and+treatment+of+atherosclerosis+with+endothelial-cell+relaxants+(cyclic+AMP+phosphodiesterase+inhibitors).">Drugs and foods on contraction of endothelial cells as a key mechanism in atherogenesis and treatment of atherosclerosis with endothelial-cell relaxants (cyclic AMP phosphodiesterase inhibitors).</a> Advances in experimental medicine and biology. 60, 77-105 (1975).</li><li>Chiu, J. J., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium:+pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives.">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiological reviews. 91, 327-387 (2011).</li><li>Gimbrone, M. A., Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+dysfunction,+hemodynamic+forces,+and+atherogenesis.">Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 902, 239-240 (2000).</li><li>Rostgaard, J., Qvortrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+demonstrations+of+filamentous+molecular+sieve+plugs+in+capillary+fenestrae.">Electron microscopic demonstrations of filamentous molecular sieve plugs in capillary fenestrae.</a> Microvascular research. 53, 1-13 (1997).</li><li>Brutsaert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial-myocardial+signaling:+its+role+in+cardiac+growth,+contractile+performance,+and+rhythmicity.">Cardiac endothelial-myocardial signaling: its role in cardiac growth, contractile performance, and rhythmicity.</a> Physiological reviews. 83, 59-115 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מחקר זה מדגים שיטה פשוטה לבודדים תאי התרבות האנדותל מתוך האאורטה עכבר בלי שום ציוד מיוחד. מכתים immunofluorescence הצביע על כך שרוב התאים היו תאי אנדותל לאחר הקטע השני. הוא הציע כי תאים ב שני למעבר שלישי מתאימים במבחנה בניסויי vivo ללמוד ביולוגיה האנדותל. הערות המפתח מן הפרוטוקול הנוכחי ישנן חמש נקודות קריטיות בתהליך. ראשית, לומן וסקולרית סמוק מרוב הפרין המכיל PBS למזער הפעלת תא האנדותל היווצרות קריש דם. שנית, הזמן בין דום לב ואת הזריעה של קטע אב עורקים על מטריקס הוא קריטי כדאיות האנדותל. תוך שהוא מותיר את רקמת השומן פרי-עורקים ורקמות החיבור, למנוע מתיחת האאורטה ולהגביל את משך הזמן על שלב זה עד 10 - 15 דקות. שלישית, לשפוךרק תקשורת מספיק כדי לכסות את הפלחים אחרי שהם זורעים. מדי בתקשורת הרבה תגרום מגזרי אב העורקים לצוף. הרביעית, התרבות הבינונית מכיל ריכוז גבוה של תוספת צמיחת תא האנדותל, מה שהופך לתאי אנדותל לגדול הרבה יותר מהר מאשר כאשר בתרבית בינונית-2 צמיחה האנדותל. התולדה של תאי אנדותל תמנע את סוגי תאים אחרים כגון תאי פיברובלסטים שריר חלק. חמישית, את העיתוי כדי להסיר קטע אב עורקים מן מטריקס הוא גם חיוני לקיומו הטוהר תאי האנדותל. פעולה זו מונעת זיהום על ידי פיברובלסטים ותאי שריר חלק. המגזר יש להסירו לפני התפתחות רשת הצינור. הסרה מושהה של קטע אב עורקים תגרום לזיהום של סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים או תאי שריר חלק. יש לציין כי גישה זו משמשת גם ללמוד אנגיוגנזה במבחנת ההיווצרות של נימים כמו מבנים מצביע על יכולת אנגיוגנזה של מגזר אב העורקים. בהתבסס על הדואר שלנוxperience, אם מגזרים יוסרו לאחר מבנה דמוי נימי מפתחת באופן מלא, את השכיחות של עליות זיהום תאי שריר חלק דרמטי. לכן, אנו חשים כי נקודת הזמן הטובה ביותר כדי להסיר את הפלח הוא כאשר הרשת מתחילה להיות גלוי אך אינו מפותחת. בדרך זו, אנו מסוגלים לקצור כמה שיותר תאי אנדותל ככל האפשר תוך שמירת זיהום על ידי לתאי שריר חלק עד למינימום. המגבלות של הפרוטוקול הנוכחי ישנן מספר מגבלות של השיטות שתוארו. ראשית, יש סיכוי של זיהום של פיברובלסטים ותאי שריר חלק, אם מגזרי אב העורקים אינם מוסרים לפני רשתות צינור לפתח. הפיברובלסטים או תאי שריר חלק עשויים להתחיל לצרף המטריצה ​​מתרבים 3 עד 5 ימים לאחר הזריעה. לכן, תמיד להסיר את פלחי אבי העורקים מבעוד מועד. כאמצעי זהירות משנית, שינוי המדיום 2 שעות לאחר מחדש<html> -plating התאים על גבי בקבוק חדש מסייע גם לחסל את הזיהום האפשרי של פיברובלסטים ותאי שריר חלק. שנית, תאים אלה הם מתורבתים במבחנה במשך 7 - 10 ימים לאחר בידוד. יתכן כי פנוטיפים שלהם עשויים להיות שונים מתאי אנדותל הטריים מבודדים. לדוגמא, אם תאי אנדותל ממודל עכבר של היפרליפידמיה מתורבתים במדיום גידול תא האנדותל ללא ריכוז גבוה של שומנים, הם אינם חשופים לסביבת hyperlipidemic כפי שהיו בחיות. תאי אנדותל בתרבית עשויים להתנהג באופן שונה מתאי אנדותל מבודדים טרי 8. בעיה זו קיימת בכל במבחנת התאים הראשוניים בתרבית שורות תאים. הוספת הגירויים פתולוגי לתוך מדיום התרבות לחקות את הסביבה vivo יכולה להיות פתרון. לתאי אנדותל להפגין פנוטיפים שונים בענפי כלי דם שונים e_content &quot;&gt; מערכת כלי הדם היא מבנה היררכי מורכב עורקים, ורידים, נימים. ההטרוגניות של תאי אנדותל שוכני &#39;האזורים&#39; של כלי דם הספציפיים ממלאת תפקיד מרכזי ביצירת מגוון פונקציונלי 9,10 מערכת כלי הדם. אפילו מיטה כלי הדם יחיד, כגון אבי העורקים, ההטרוגניות האנדותל קיים. זרימת הדם למינרית עם הלחץ גזירה גבוהה בחלק הישר של אבי העורקים גורמת synthase תחמוצת החנקן אנדותל thrombomodulin 11. לכן, תאי אנדותל שנמצא לשביל הישר של האאורטה להפגין קרישה אנטי מודבקות אנטי, ונוגדות דלקתיות 12,13. לעומת זאת, זרימת הדם סוער לאזורים סניף העורקים או לפנייה חדה (קשת אבי העורקים) מפחית ביטוי synthase תחמוצת החנקן אנדותל ומשרה גנים atherogenic ב האנדותל תאים, כלומר, חלבון-1 chemotactic מונוציטים (MCP-1), ואת גורמי גדילה הנגזרות טסיות (PDGFs), וכתוצאה מכך פנוטיפ האנדותל פרו-דלקתי הטרשת העורק 6. בנוסף, תאי אנדותל של הכלי של כל איבר עוברים שינויים אדפטיבית אנטומיים ותפקודיים ומתאימים הפונקציות של האיבר 14,15. עם זאת, קיימת הסכמה כי סמני משטח מספר תא, גנים פעילים ופעילות תא יכולים לשמש כדי לאפיין שושלת תא האנדותל. סמנים פני התא אלה כוללים מולקולות הידבקות התא טסיות האנדותל (PCAM-1, CD31), גורם פון Willebrand (vWF), כלי דם האנדותל-cadherin (VE-cadherin, CD144). הגנים פונקציונלי השכיח ביותר כוללים synthase תחמוצת החנקן אנדותל (eNOS) ו הקולטן לגורם הצמיחה דם האנדותל (VEGFR). פעילות התא שבדרך כלל נראות שושלת תא האנדותל כוללת ספיגה של דיל-ad-LDL ומחייבים לקטינים, המהווה מבנים דמויי חוט שנכנס לטבלה. יישומי משמעויותיה עתיד של פריתאים בתרבית mary עכבר אבי העורקים האנדותל השיטה המתוארת כאן משמש ללמוד תאי אנדותל macrovascular. המשמעות של פרוטוקול זה היא בכך שהוא מספק הזדמנות מצוינת ללמוד את הפעילויות ספציפיות-אנדותל של מולקולות ממוקדות ויכול להיעשות בנוקאאוט ומודלי עכבר מהונדסים, מה שהופך אותו מאוד שימושי במחקר לב וכלי דם. היכולת לגדול מספרים גבוהים של תאי אנדותל אב עורקי עכבר בתנאים מוגדרים עושה את טכניקת האידאל הזה כדי להגדיר טוב יותר את פנוטיפים ופונקציות של האנדותל. טכניקה זו משפרת את המעשיות של בדיקת הפוטנציאל הפוטנציאלי של טיפול מבוסס תאים אנדותל במודלי Murine, בין אם באמצעות הזרקה תוך ורידית או engraftment של תאי אנדותל.

האנדותל של כלי הדם הוא לא רק שכבת מחסום שמפרידה דם ורקמות, זה נחשב בלוטת אנדוקרינית עצומה המשתרעת על עץ כלי הדם כולו עם שטח פנים של 400 מ&quot;ר 1. את רווחתם של האנדותל חיוני הומאוסטזיס וסקולרית. האנדותל מתפקדת משתתף והפרעות שונות לב וכלי דם, כולל טרשת עורקים, וסקוליטיס ופציעות איסכמיה / reperfusion, וכו &#39;2-4. נכון להיום, את המנגנונים תאיים ומולקולריים הספציפיים המעורבים הגדרות מחלות אלה אינם מובנים היטב בשל אופי אנטומיים המתפזר של האנדותל. העכבר הוא מודל חשוב למחקר כי טכניקות מניפולציה גנטיות הן יותר התפתחו בעכברים מאשר בכל מיני יונקים אחרים. עם זאת, את הבידוד של תאי אנדותל אב עורקים בעכברים העיקריים נחשב קשה במיוחד בגלל גודלו הקטן של אב העורקים עושה enzymatעיכול ic של האנדותל מעשי. חלקם דיווחו נהלים לבודדים ולטהר ECS דורשות 5-7. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בשיטה פשוטה כדי לבודד להרחיב בתאי האנדותל מן האאורטה העכבר ללא שימוש בכל ציוד מיוחד. בפרוטוקול זה, האאורטה המבודד הטרי נחתך למקטעים קטנים זורע על מטריצה ​​עם האנדותל פונה כלפי מטה על מנת לאפשר הנבטה האנדותל. לאחר המגזרים יוסרו, תאי אנדותל מורחבים במדיום האנדותל מועדף והם מוכנים לניסויים אחרי שניים או שלושה קטעים. היתרונות של השיטה המתוארת הם כי: 1) מספרים גבוהים באופן משמעותי של תאי אנדותל נקצרים מן האאורטה יחיד; 2) כדאיות התא נשמר היטב; ו -3) לא נדרש ציוד או טכניקה מיוחדת. הוא מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים תאיים ומולקולריים ספציפיים פתופיזיולוגיה תא האנדותל. לאלו המעוניינים ללמוד יחסי ציבורimary בתרבית תאי אנדותל מעכברי נוק-אאוט או גן, גן עקום בעכברים, או מודל מחלה בעכברים, פרוטוקול זה הוא מאוד שימושי וקל לתרגל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4- or 6-week-old mice (Jackson Laboratory, #000664).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X phosphate-buffered saline (PBS, Gibco, #10010-023).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1X PBS containing 1,000 U/ml of heparin (Sigma Aldrich, H3149).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium (Dulbeccos&#8217; Modified Eagle&#8217;s Medium[DMEM] with 25mM HEPES[Gibco, #12320-032 ], supplemented with 100&#956;g/ml endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma,#2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/ml heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000U/ml penicillin and 10mg/ml streptomycin [Gibco, #15140-122]).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced matrix (BD Biosciences, #356231).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral proteinase (Dispase, 1U/ml, Fisher Scientific #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034g/L[Sigma, #1255], in Dulbeccos&#8217; Modified Eagle&#8217;s Medium, low glucose[Gibco, #12320-032 ]).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (100&#8209;200 &#956;g/cm2, Sigma, #G1393).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1`-dioctadecyl-3,3,3`,3`- tetramethylindo- carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL, Life Technologies, #L3484),&#160; FITC-labeled Ulex europeus agglutinin (Ulex-Lectin, Sigma, #L9006),&#160; Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody (BD Biosciences, # 553372).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody (Cell signaling, #9698), anti-mouse endothelial nitric oxide synthase (Abcam, #ab5589), anti-mouse vascular endothelium-cadherin (Abcam, #33168), anti-mouse calponin (Abcam, #700), FITC-conjugated anti-rabbit IgG (Sigma, #F6005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One ml syringe fitted with 25-G needle (Fisher Scientific, #50-900-04222).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm Peri dishes (Fisher Scientific,&#160; #07-202-516).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates (Fisher Scientific, #08-772-1B).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T12.5 cultuer flask (Fisher Scientific, #50-202-076)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade (Fine Science Tools, Inc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane (Webster Veterianary Supply, #07-806-3204), heating lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted fluorescence microscope.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

הנבטת תא האנדותל תא האנדותל ספונטני נברא נכתב ממקטע עכבר אב עורקים. מגזר האאורטה העכבר היה מותר לגדל על מטריצה-מופחת גורם גדילה אז במדיום גידול תא האנדותל במשך 4 ימים. נביטת תא האנדותל מופיעה בדרך כלל 2 - 4 ימים. Photomicrographs נלקח ביום 4 (איור 1). כפי שניתן לראות בתמונות, תאי אנדותל רבים נודדים הרחק במגזר. הנבטים שהוקמו זה עתה ממשיכים להרחיב מהמגזר ואת הסניף. פנוטיפים תא האנדותל תאים אלה הפגינו הופעות כישוריות ו מרוצפות דמוית אחרי (איור 2 א) מעבר ראשוני. התאים מחוברים תויגו עם דיל-AC-LDL ו- Ulex -Lectin במשך שעה אחת. כפי שניתן לראות 2B-2E הדמוי, רוב התאים היו פעמים חיוביות עבור דיל-AC-LDL<html> ספיגת (אדום) ו Ulex -Lectin מחייב (ירוק). בינתיים, לאחר הקטע השני, יותר מ -95% מכלל התאים היו חיוביות עבור מולקולה הידבקות תא האנדותל טסיות 1 (CD31, PECAM-1, איור 2F), VEGFR2 (איור 2G), VE-cadherin (איור 2H), eNOS ( איור 2I) אבל שלילי עבור Calponin (איור 2J) אשר מהווה סמן תא שריר חלק. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig1.jpg" /> Cell איור 1. האנדותל הנבטה. קטע עכבר אב עורקים היה זורע על מטריצת גורם מופחת צמיחה בתרבית בינוני צמיחת תא האנדותל. נבראת התחיל תא האנדותל מוקדם ככל ביום 2 (א &#39;, בר = 100 מיקרומטר) והגדילה ב 2 הבא - 3 ימים (B, C, בר = 100 מיקרומטר). המגזר הוסר ביום 4 (D, בר = 500 מיקרומטר). אף אוזן גרון &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52965/52965fig2.jpg" /> איור 2. פנוטיפים תא האנדותל. התאים מחוברים להציג בצורת ציר מרוצפת דמוי הופעות (A, בר = 100 מיקרומטר), קרינת פעמים החיוביות של דיל-AC-LDL ו- Ulex -Lectin (BE, בר = 100 מיקרומטר). בינתיים, הדבקת תא האנדותל טסיות מולקולת 1 (CD31, PECAM-1), VEGFR2, VE-cadherin, eNOS היה חיובי&gt; 95% של התאים לאחר הקטע השני (FI, בר = 100 מיקרומטר) רוב התאים היו שליליים עבור מכתים Calponin, אשר מהווה סמן תא שריר חלק (J, בר = 100 מיקרומטר).

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

isolation-and-primary-culture-of-mouse-aortic-endothelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

30.4K Views.  Wayne State University. The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Video: Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

בידוד של תאים אנדותל valvular

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...