This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

참고 : 모든 현재 실험 (퀸즐랜드 대학의 해부학 생명 과학 윤리위원회의 승인) 퀸즐랜드 대학의 지역 동물 윤리 절차에 따라 수행되었다. 1. 작은 섬 격리 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 효소의 혼합물 <ol><li> 췌장 소화를 들어, liberase과 콜라겐 IV 형의 혼합물을 사용합니다. (써모 낮음) liberase의 TL DMEM 26 ㎖ (둘 베코의 수정 이글 중간) 5 mg을 1 병을 희석. </li><li> 된 5mm HEPES가 보충 된 0.5 ㎎ / ㎖의 농도에서 행크 버퍼 콜라게나 제 IV 형을 준비 후 0.5mM 염화칼슘 2를 0.1 mg / ㎖의 DNase 및 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민. </li><li> 즉, (체적) 한 TL + 1 ㎖의 콜라게나 제 용액 liberase 4 : 4의 비율로 liberase의 TL과 콜라겐 용액을 섞는다. -20 ℃에서 각각 저장을 2.5ml를 효소의 혼합물 나누어지는. 참고 : 조직 배양 시간이 v에효소의 배치 사이의 비트 (30 초에 1 분 차이)을 당하고. 따라서, 일괄 테스트가 필요할 수있다. </li></ol></li><li> RPMI 격리 미디어 <ol><li> 실온에서 물 1 L에 RPMI 1640 분말의 한 유리 병을 녹여와 2g의 NaHCO3, 4.02 G의 HEPES과 보충. </li><li> , 자석 교반기로 혼합, 대형 삼각 플라스크에 RPMI 분리 미디어를 결합 NaOH로 pH를 7.4로 조정, 필터는 살균 및 4 ℃에서 저장. </li></ol></li><li> RPMI 문화 미디어 </li><li> 10 % 소 태아 혈청 및 1 % 항생 물질 (예, 페니실린 100 U / ㎖, 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖), RPMI 배양 배지를 사용한다. </li></ol></li><li> 섬의 분리 및 배양 <ol><li> 동물 희생 <ol><li> 지역 기관의 윤리 절차에 따라 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 쥐를 희생. 70 % 에탄올로 충분히 마우스 본체 스프레이. </li></ol></li><li> 췌장 관류 <ol><li> 유측면 복부 피부와 복막을 통해 자체 2 긴 인하 V 자형 플랩을 확인합니다. 전체 복강을 밝히기 위해서 피부 최대의 플랩을 당기고 장을 따로 넣어 담관을 공개 접힌 휴지에 의해 장소에 간 유지 (그림 1, 2). 동물을 넣어 외과 의사 멀리 외과에서 꼬리쪽으로 머리 있도록. </li><li> 십이지장 (그림 1)를 입력에서 주입 된 효소를 차단하는 십이지장 벽에 팽대부에서 혈관 클램프를 적용합니다. 참고 : 주입 된 효소가 췌장 관에 가서 (클램프 이상) 주사 부위에 췌장 또는 역류를 관류 또는 (클램프 아래) 십이지장으로 이동할지 여부는 결정으로이 중요한 단계입니다. </li><li> 일반적인 간 덕트 및 담낭 관 (그림 1)의 교차점 근처에 31 G 바늘과 담관을 Cannulate 및 제 주입을위한 공간을 남겨 일 경우즉 췌장은 처음 관류 못한다. 천천히 (이상 ~ 10 초) 마우스 담관에 약 2 ml의 차가운 효소 혼합물의 주입. 주 : 클램프 우측 위치에있는 경우 췌장 신속 관류한다. </li><li> 바늘이 담관 내에 있지만 췌장 관류 할 수없는 경우 (예. 고정 이상의 경우 간에서 조금 떨어진 클램프를 이동하거나 고정 아래의 경우 간으로 조금 아래로 이동) 클램프 위치를 조정합니다. 주 : 바늘 가끔 둘러싸 캡슐보다는 덕트의 루멘으로 간다. 유용한 기호 담관이 주입 관의 팽창은 내부 바늘이 있는지 여부를 확인한다. 췌장 관류 못하면 대안 효소 혼합물이 예상보다 낮은 수율과 췌장의 여러 부위로 주입 될 수있다. 췌장 (비장 엽)의 왼쪽 사이트의 관류는 섬 수율의 극대화를 위해 중요하다. </li><li> 췌장은 P가되면erfused, 신속, 췌장을 제거 유리 병 (~ 20 ㎖, 유리)에 넣고 37 ° C의 물을 욕조에서 ~ 19 분을 품어. 주 : 배양 시간이 마우스 변형 및 나이에 따라 약간 다를 수 있습니다. </li><li> 배양 시간 후, 냉 ~ 분리 매체 20 ㎖를 첨가하여 소화 과정을 정지. 췌장을 방해하고 멸균 50 ㎖ 튜브에 일반 차 체 (1mm의 구멍 직경)를 통해 부어 부드럽게 병을 흔들어. 브레이크 오프 4 ° C에서 1 분 동안 400 XG에 격리 매체와 원심 분리기와 튜브를 최고. </li><li> 다시 분리 미디어에서 펠렛을 해산 한 후 브레이크 해제와 함께 4 ℃에서 1 분 동안 400 XG에 원심 분리기,이 15 ml의 튜브에 전송할 수 있습니다. 흡인 뜨는 후, 텍싱 또는 최대 피펫 아래로 튜브 당 밀도 구배 세포 분리 매체의 6 ㎖ (Histopaque 1077 용액)을 잘 두 개의 알약을 섞는다. 부드럽게 위에 튜브의 측면에 격리 매체 ~ 6를 가하여브레이크 오프 4 ° C에서 15 분 동안 100 XG에 밀도 구배 분리 매체와 원심 분리기. </li><li> 상단 (격리 미디어)의 상층 액 3 별도의 요리, 중간 및 하부 (밀도 구배 세포 분리 미디어) 레이어를 수집합니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여,이 3 요리의 섬을 따다. 주 : 중간 층이 섬의 대부분을 포함하고 있습니다. 섬의 크기는 ~ 50 μm의 500의 컴팩트 한 구조 (그림 3)으로 인식하고 있습니다. 우리는 (WT) 쥐에 ~ 200 섬과 DB / db 마우스에서 300- &lt;100 섬을 구하십시오. </li></ol></li><li> 섬의 배양 <ol><li> 독도는 37 ℃, 5 %, 효소 소화에서 6ml를 RPMI 배양액 (10 mM이 포도당)와 25cm 배양 접시에 40 섬의 문화 그룹을 복구 할 수 있도록하려면 / 95 % 라이브 전에 2 일간 CO 2 / O 2 -cell 2 광자 영상화. 매일 문화 미디어를 변경합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> (2). 라이브 셀 2 광자 이미징 <ol><li> 시약 준비 <ol><li> 세포 외 버퍼 <ol><li> 140 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 2.5 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의의 MgCl 2, 5 mM의 NaHCO3를 10 mM의 HEPES와 2 광자 분석의 나트륨이 풍부한 세포 외 버퍼를 준비합니다. </li></ol></li><li> 세포 외 염료 <ol><li> 2 광자 분석의 경우, -20 ° C에서 세포 외 버퍼, 나누어지는 작은 튜브에 저장에 스톡 SRB 8 mm로 준비합니다. 0.8 mm의 작업 농도를 얻기 위해 신선한 세포 외 버퍼에 주식 SRB 1:10 희석. </li></ol></li></ol></li><li> 광자 이미징 <ol><li> 먼저, 30 분 동안 3 mM의 글루코오스 외 버퍼에서 2 일간 배양 아일렛 사전 부화. 참고 : 우리는 문화에 2 오일 사이에 독도를 사용합니다. </li><li> 이어서, 현미경 스테이지 상에 열 제어실 상 유리 슬라이드를 배치. 용액의 누출을 방지하기 위해 그리스를 사용합니다. </li><li> extracell 500 μL와 챔버 커버다른 포도당 농도 (3 mm의 6 mm의 15 mM의 20 mM의 포도당)와 0.8 mM의 SRB를 포함 울라 버퍼입니다. </li><li> 다음에, 챔버의 중앙으로 미리 인큐베이션 아일렛 놓고 설치류 아일렛의 인슐린 면역 염색하여 가장 세포가 베타 세포 인 것을 나타내고, 췌도 세포로 3-4 층에 초점을 맞춘다. 주 : SRB 신속 아일렛 모든 세포막 윤곽 것이며 아일렛 이미지를 준비한다. </li><li> (예., ScanImage 11). 60X 오일 침지 대물 (NA 1.42) 및 이미징 소프트웨어와 2 광자 현미경을 사용하여 4 현미경 전형적인 배열을 도시한다. 형광으로 막 880 nm에서 펨토초 레이저 펄스에 의해 여기 impermeant 형광 세포 마커로 SRB를 사용하여 이미지 exocytic 이벤트, 550-650 nm에서 검출. 자극에 섬의 응답을 기록합니다. </li><li> 작은 형광 자리의 갑작스러운 출현에 의해 단일 ​​exocytic 이벤트를 식별 (해상도 10 픽셀 /1, M)와 관심 영역 (~ 0.78 μm의 2)을 통해 형광 신호의 빠른 상승 단계에 의해 확인합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035.">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li><li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell:+The+last+ten+years.">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li><li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes.">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li><li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+hyperglycemia,+independent+of+plasma+lipid+levels,+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db/db+mouse+model+of+diabetes.">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li><li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models.">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li><li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+a+new+mutation+in+mouse.">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+deficit+in+islets+from+db/db+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells.">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell.">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13 (2003).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

아일렛 분리에 가장 중요한 요인은 췌장의 초기 관류이고; 아래는 상당히 낮은 섬 수율 췌장 결과를 관류. 다른 인자는 또한 소화 시간 부분적 관류의 레벨을 보정 할 수 진탕 레벨로 분리 품질에 영향을 미친다. 예를 들어, 완전히 관류 췌장 부드럽게 진탕하면서 아래에서 췌장 세게 진탕 ~ 20 분 소화가 필요할 수 소화 반대로, 18 분 30 초 ~ 37 ° C에서 배양해야한다. 우리의 손에 두 개의 소화 효소의 혼합물을 혼자 둘 중 하나보다 더 섬 격리를 제공합니다. 콜라게나 유일한 방법은, 소화 시간이 매우 섬 수율과 30 초의 시간 차이가 극적으로 품질에 영향을 미칠 수있는 영향을 미친다. 만 liberase를 들어, 수율은 허용하지만 아래 - 소화 때때로 우리는 콜라게나 제를 첨가 더 잘 결합 조직을 소화하는 데 도움이 믿고 발생합니다. 아일렛 단리 된 후에 수행 될 수있는 가능한 실험들이있다. 격리 아일렛 즉시 차단 후, 파라 포름 알데히드 또는 메탄올로 고정하고 관심 10 단백질의 위치를 결정하기 위해 면역 형광 염색에 사용될 수있다. 고립 된 섬은 하나의 셀에 분산 될 수있다. 이것은 아일렛의 분리 같은 날 또는 췌장 배양 며칠 후에 수행 될 수있다. 단일 세포를 밖으로 도금과 같은 패치 클램프 전반사 현미경과 같은 기술에 대한 의지왔다이 준비된다. 측정 실험에서인슐린 분비뿐만 아니라 라이브 셀 2 광자 영상화를 위해, 우리는 아일렛 재현 데이터를 제공하기 위해 배양 2 일이 필요한 것을 발견 하였다. 무엇 배양에서 일어나는 것은 잘 이해되지 않지만, 분리 및 분해 공정으로부터 회수 기간이 될 것으로 생각된다. 여기에 제시된 2 광자 기술은 그대로 섬 내의 많은 세포로부터 개별 과립 융합 수준의 화상에 인슐린 분비 과정을 연구 할 수있다. 우리는 과립 융합 이벤트 및 그들의 타이밍의 개수가 양의 인슐린 분비를 8 시간 프로파일과 일관성이 있음을 발견 하였다. 이 방법은 인슐린 과립 융합 이벤트 다수 검출되어 나왔다. 정착 과립에 염료 항목이 7,8을 연구되고있다 베타 세포에서 인슐린 과립 융합을 보여 제어 실험을 수행하는 우리는 최선을 다했다 인슐린 과립 융합 이벤트를 검출하기위한 구체적인 방법이 아니라고 감안할 때 </sup&gt;. 그러나, 이러한 증거 성분은 베타 세포가 췌장의 코어에 충실 쥐 췌장의 구조에 의존한다. 다른 내분비 세포가 췌도 볼륨에 걸쳐 흩어져있다 인간의 아일렛, 서로 다른 구조는 베타 세포를 식별하기 위해 추가의 방식을 필요로한다. 모든 촬상 방식에 일반적으로 적용되는 2 광자 현미경 기술적 문제점이있다. 예를 들어, 우리는 신중하게 우리가 감지기의 이득을 줄일 수 있도록 독도에 충분한 빛을 얻으려고 노력의 반대 요인의 균형, 따라서 우리는 세포 손상의 원인이 섬에 너무 많은 빛을 가하고으로, 소음을 줄일 수 있습니다. 우리의 시스템에서, 포켈 셀에 펄스 레이저 (도 3)을 약하게하기 위해 사용된다; 모든 상용 시스템은 시편에 떨어지는 빛의 강도를 변경할 수있는기구. 요약하면, DB 조심 격리의 조합 / DB 독도 및 전체 섬 2 광자 현미경 현재 새로운 기회는 인슐린 분비의 과정을 공부하고 제 2 형 당뇨병의 주요 결함 요소를 확인합니다.

질병의 베타 - 세포 기능 부전의 역할은 광범위 3,4-을 인식하고있다. 이러한 MIN6와 INS-1 등의 세포주는 베타 세포 행동의 생물학을 이해하기 위해 유용한 도구이다. 그러나, 인슐린 분비의 생리적 제어는 랑게르한스의 섬 내에서 일어난다. 이 섬은 단단히 포장 베타 세포의 수천뿐만 아니라 혈관 및 기타 내분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 아일렛이 환경 내의 인슐린 분비에 영향을 당뇨병에 중요한 것으로 예상된다. 따라서, 인슐린 분비의 생리 학적 제어하고 질환의 병태 생리를 이해하기 위해서는 본래 아일렛을 연구하는 것이 필수적이다. 섬 격리 2 형 당뇨병 환자, 특히 인간의 아일렛 라이브 인간 섬과는 얻는 것이 곤란하다. 또한, 인간의 독도 실험 분자 조작에 대한 제한 가능성이 있습니다. 연구원은 그러므로 고용 한동물과 제 2 형 당뇨병 동물 모델에서 할 수 있습니다. 하나는 이러한 질병 모델은 DB / DB 마우스입니다. 이 모델은 밀접하게 인간의 질병 5,6 평행 표현형의 진행과 2 형 당뇨병 자발적인 돌연변이입니다. 당뇨병 DB / db 마우스에서 섬의​​ 격리를 위해 여기에 제시된 프로토콜은 더 나은 수율, 정화 및 강화 섬의 생존을위한 몇 가지 정련 다른 그룹과 공통점이 많은 단계가 있습니다. 2 광자 이미징 여기에 설명 된 라이브 셀 2 광자 분석법을 계량 숫자 7과 야생형 당뇨병은 8,9 아일렛의 많은 세포로부터 인슐린 단일 - 함유 과립의 특성을 평가하기 위해 연구를 가능하게한다.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

2 형 당뇨병은 2013 년 382,000,000명에 영향을 미치는 만성 질환이며, 지난 2 년 동안. 2035 1 592000000에 명확하게이 설립 된 제 2 형 당뇨병에서 베타 세포 기능 장애의 역할을 증가 할 것으로 예상된다. 연구 진행은 췌장 섬의 분리 방법을 요구하고있다. 섬 분리의 프로토콜은 야생형과 당뇨병 Lepr의 데시벨 (dB / DB) 마우스 모두에서 고립 된 섬의 수율과 품질을 개선하기 위해 일부 수정과 함께 공유 여기 다른 그룹의 프로토콜과 많은 일반적인 단계를 제시했다. 라이브 셀 2 광자 이미징 법은 아일렛 내에서 인슐린 분비의 조절을 조사하기 위하여 사용될 수 제시된다.

섬 수율 및 정화 정상적인 야생형 마우스의 200 아일렛이 예상된다. 건강한 섬은 둥근 모양, 밝은 모양과 부드러운 테두리가. 아래의 소화 배치가 적은 섬과 선방 세포 부착 섬 (그림 3)이 때 과열 소화 분리 배치는 일반적으로 작은 퍼지 섬이있다. 더 나은 혈당 마우스 (100) 아래 (반투명 외관과 작은 섬이 악화 혈당 쥐에 비해 (300 섬에) 더 큰, 더 밝고 섬이 당뇨병 DB / db 마우스의 경우, 섬 수율 및 외관은 질병의 진행에 따라 달라집니다 섬) 2 광자 분석법 2 광자 영상화는 단일 인슐린 과립 융합 수준에서 인슐린의 분비를 측정하는 간접 분석법이다. 높은 포도당 또는 칼륨과 같은 자극에 응답하여, 인슐린 과립은 세포막과 융합 및 세포 외 염료는 SRB 번째 진입직경 갑작스런 형광 스폿 ~ 400 nm 인 외관을 초래 E 과립 (도 5). 다양한 실험은 인슐린 분비의 예상 된 양, (2) 내의 반​​응 세포의 일관된 크기의 과립 융합 이벤트 수를 증가 의존성 글루코스 도즈 같은 인슐린 - 함유 과립의 융합의 측정 등이 분석의 유효성을 확인하기 위해 수행되어왔다 베타 세포의 광자와, 2 광자 및 전자 현미경으로 측정 한 유사 과립 직경이 염료 흡수 및 인슐린 colocalization을 8 염색. 녹화 시간 내에 식별 자극과 키스 앤 실행 또는 전체 융합 등 융합 이벤트의 이벤트의 위치, 모양의 시간, 기간 및 유형에 따라 모든 exocytic 이벤트는 특징 ( 도 5, 6). 융합 과정의 이러한 특성은 평가하는 가치가있다<html> 제 2 형 당뇨병 모델에서 과립 융합의 결함. 이 방법을 사용하여 우리의 이전 보고서는 당뇨병 DB / DB 섬에 결함이 전체 과립 융합의 손실이 아닌 개별 과립 융합 (7)의 반응 속도의 특성의 변화임을 보여줍니다. 또한, 우리는이 질병에서의 인슐린 분비 저하의 큰 요인은 반응 셀 (7)의 수가 감소임을 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig1.jpg" /> 그림 1. 클램핑 및 주사 부위의 도면과 공통 간관 담낭 관의 접합부 근처 담관에 효소를 주입한다. 췌장 관에 주입 된 효소를 촉진하기 위해 혈관 클램프에 의해 발터의 팽대부를 클램프. 2632fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2 : 마우스에 주입 과정. 최고 그림은 발터의 팽대부에 적용 혈관 클램프 담관 안에 바늘을 보여줍니다. 아래 그림은 주사 후 liberase - 관류 췌장을 보여줍니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig3.jpg" /> 그림 3 : 와일드 유형 및 DB / DB 고립 된 섬의 전형적인 이미지 (A) 야생 유형 고립 된 섬.. (B) DB / DB 고립 된 섬. 부착 선포 세포 (화살표)로 독도를 소화에서 - (C). (D) 작은 퍼지 섬 (화살표)와 오버 소화 섬. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" sRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52632 / 52632fig4.jpg&quot;/&gt; 그림 4 :. 맞춤 2 광자 현미경의 주요 구성 요소 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig5.jpg" /> 도 5 : 2 광자 현미경으로 기록 된 단일 인슐린 과립 융합 이벤트의 예 왼쪽 그림 (A) 전에 및 (B) 15 mM의 답변 exocytic 이벤트 (화살표)의 외관 글루코오스 자극 후에 세포를 나타낸다.. 이 세포막과 융합 될 때 (C)는 과립으로 세포 외 염료 SRB의 진입 각 SRB 라벨을 나타낸다. (D)는 exocytic 이벤트의 관심 영역 위에 형광 강도뿐 아니라 sequentia를 도시이 exocytic 이벤트 (규모 바 1 ㎛)의 L 이미지. 마 등의 알 2014 7에서 수정 된 이미지입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig6.jpg" /> 그림 6 :. 세포 외 염료 SRB와 2 광자 현미경 야생 형 당뇨병 DB / DB 섬의 응답이 실험 인슐린 과립 융합 이벤트에서 15MM 포도당 자극에 응답이 기록됩니다. 노란색 원은 기록의 20 분 동안 exocytic 이벤트 사이트입니다. 마 등의 알 2014 7에서 수정 된 이미지입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets at JoVE.com

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K 조회수.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

비디오: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

당뇨병 연구에서 β-세포 질량 분포의 평가를위한 적외선 광학 프로젝션 단층 촬영 부근

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

연구

의학

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

면역학 및 감염병학

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

생물학

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

췌장섬 접목: 생체 내 이미징을 위해 췌장섬을 마우스 눈의 전방에 이식하는 방법

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

Lepr

요약

더 많은 비디오 탐색