This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).

NOTA: Tutte le presenti esperimenti sono stati eseguiti secondo le locali procedure di etica animale dell&#39;Università di Queensland (approvati dalla University of Queensland, anatomico Biosciences Comitato Etico). 1. Islet Isolamento <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Miscela di enzimi <ol><li> Per la digestione pancreatica, utilizzare una miscela di liberase e collagenasi tipo IV. Diluire liberase TL (termolisina basso) 1 flacone di 5 mg con 26 ml di DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium). </li><li> Preparare collagenasi di tipo IV in tampone di Hank ad una concentrazione di 0,5 mg / ml, supplementato con 5 mM HEPES, 0.5mm CaCl 2, 0,1 mg / ml e DNAsi 1mg / ml sieroalbumina bovina. </li><li> Mescolare il TL liberase e soluzioni collagenasi in un rapporto di 4: 1 (in volume), cioè, 4 ml liberase TL + 1 ml di collagenasi. Aliquota della miscela di enzimi per 2,5 ml ciascuna e conservare a -20 ° C. NOTA: Le ore di incubazione tessuto vary un po &#39;tra i lotti di enzima (30 sec a differenza di 1 min). Pertanto, un test di gruppo può essere richiesto. </li></ol></li><li> RPMI Isolamento media <ol><li> Sciogliere una fiala di RPMI 1640 polvere in 1 l di acqua a temperatura ambiente e integrare con 2 g NaHCO 3, 4.02 g HEPES. </li><li> Combina i media isolamento RPMI in una grande beuta, mescolare con agitatore magnetico, regolare a pH 7,4 con NaOH, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Media Cultura </li><li> Utilizzare coltura RPMI con 10% di siero fetale bovino e 1% di antibiotici (ad esempio, penicillina 100 U / ml, streptomicina 100 mg / ml). </li></ol></li><li> Isolamento Islet e Coltura <ol><li> Sacrificio animale <ol><li> Sacrificio topi di dislocazione cervicale o di CO 2 asfissia secondo le procedure di etica dell&#39;istituzione locale. Spruzzare accuratamente il corpo del mouse con il 70% di etanolo. </li></ol></li><li> Perfusione pancreas <ol><li> USE 2 tagli lunghi lateralmente attraverso la pelle addominale e del peritoneo per fare un lembo a forma di V. Tirare il lembo della pelle fino a scoprire l&#39;intera cavità addominale, messo da parte dell&#39;intestino e mantenere il fegato in posizione da una carta velina ripiegata per rivelare il dotto biliare comune (figure 1 e 2). Mettere l&#39;animale in modo che la testa verso il chirurgo e la coda dal chirurgo. </li><li> Applicare un morsetto vascolare nella ampolla sulla parete del duodeno per bloccare gli enzimi iniettati di entrare duodeno (Figura 1). NOTA: Questo è un passo importante in quanto determina se gli enzimi iniettati andranno nel dotto pancreatico e profumato il pancreas o reflusso al sito di iniezione (oltre morsetto) o andare nel duodeno (sotto pinza). </li><li> Incannulare dotto biliare comune con un ago G 31 nei pressi dello svincolo del dotto epatico comune e dotto cistico (Figura 1) e lasciare spazio per una seconda iniezione se the pancreas non riesce a perfusione la prima volta. Lentamente (sopra ~ 10 sec) iniettare circa 2 ml di miscela di enzimi freddo nel mouse dotto biliare comune. NOTA: Il pancreas saranno perfusi rapidamente se la pinza è nella posizione corretta. </li><li> Regolare la posizione di blocco se l&#39;ago si trova all&#39;interno del dotto biliare comune, ma non può profumato pancreas (es., Spostare la pinza un po &#39;lontano dal fegato se oltre bloccato o spostarlo verso il basso un po&#39; per il fegato se sotto bloccato). NOTA: L&#39;ago volte va nella capsula circostante piuttosto che il lume del dotto. Un segno utile per verificare se l&#39;ago è all&#39;interno del dotto biliare comune è la dilatazione del condotto d&#39;iniezione. Se il pancreas non riesce a perfusione, un&#39;alternativa è la miscela enzima potrebbe essere iniettato a più siti del pancreas con minore rendimento previsto. La perfusione del sito sinistra del pancreas (lobo splenica) è importante per la massimizzazione della resa isolotto. </li><li> Dopo il pancreas è perfused, rimuovere rapidamente il pancreas, metterla in una fiala (~ 20 ml, vetro) e incubare per ~ 19 min in un bagno di 37 ° C Acque. NOTA: Il tempo di incubazione può variare un po &#39;a seconda del ceppo di topo ed età. </li><li> Dopo il tempo di incubazione, arrestare il processo di digestione aggiungendo ~ 20 ml di terreni di isolamento freddo. Agitare delicatamente il flacone di interrompere il pancreas e versare attraverso un normale colino del tè (diametro dei pori di 1 mm) in una sterile tubo da 50 ml. Rabboccare il tubo con terreni di isolamento e centrifugare a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. </li><li> Sciogliere di nuovo il pellet in terreni di isolamento e trasferire due provette da 15 ml, quindi si centrifuga a 400 xg per 1 min a 4 ° C con freno off. Dopo l&#39;aspirazione del surnatante, miscelare i due palline bene con 6 ml di mezzi di separazione cellulare gradiente di densità (Histopaque soluzione 1077) per provetta nel vortex o pipettando su e giù. Poi aggiungere delicatamente ~ 6 ml dei terreni di isolamento al lato del tubo in cimai mezzi di separazione gradiente di densità e centrifugare a 100 xg per 15 min a 4 ° C con freno off. </li><li> Raccogliere il surnatante nella parte superiore (terreni di isolamento), media e bassa (densità cellulare gradiente di mezzi di separazione) strato in 3 piatti separati. Handpick isolotti in questi 3 piatti, usando una pipetta sotto un microscopio da dissezione. NOTA: Lo strato intermedio contiene la maggior parte degli isolotti. Isolotti sono riconosciuti come strutture compatte di ~ 50 a 500 micron di dimensione (Figura 3). Otteniamo ~ 200 isolotti in topi WT e 300- &lt;100 isolotti nei topi db / db. </li></ol></li><li> Islet Culturing <ol><li> Per aiutare gli isolotti riprendersi dalla digestione enzimatica, gruppi culturali di 40 isolotti in un 25 centimetri capsula di Petri con 6 ml RPMI terreni di coltura (10mM glucosio) a 37 ° C, 5% / 95% di CO 2 / O 2 per 2 giorni prima dal vivo -cell 2-photon imaging. Modificare il terreno di coltura quotidiano. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photon Imaging <ol><li> Preparazione dei reagenti <ol><li> Extracellulare Buffer <ol><li> Preparare il sodio ricco tampone extracellulare per il test 2-fotone con 140 mM NaCl, KCl 5 mM, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 5 NaHCO 3 e 10 mM HEPES mM. </li></ol></li><li> Extracellulare Dye <ol><li> Per il saggio 2 fotoni, preparare magazzino SRB 8 mm in tampone extracellulare, aliquota in piccoli tubi e conservare a -20 ° C. Diluire lo stock SRB 1:10 in tampone fresco extracellulare per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> fotone Imaging <ol><li> Innanzitutto, pre-incubare 2 giorni isolotti coltivate in 3 mM glucosio tampone extracellulare per 30 min. NOTA BENE: Usiamo isolotti tra 2 e 5 giorni in coltura. </li><li> Quindi, inserire un vetrino sulla camera termo-controllo montato sul palco microscopio. Utilizzare del grasso per impedire la fuoriuscita di soluzione. </li><li> Coprire la camera con 500 ml di ExtracellBuffer colare contenente 0,8 SRB mm con differenti concentrazioni di glucosio (3 mm, 6 mm, 15 mm e 20 mm) di glucosio. </li><li> Quindi, posizionare l&#39;isolotto di pre-incubazione nel mezzo della camera e si concentrano a 3-4 strati di cellule nel isolotto dove, nelle isole di roditori, immunocolorazione per l&#39;insulina mostra che la maggior parte delle cellule sono cellule beta. NOTA: Il SRB illustrerà tutte le membrane delle cellule dell&#39;isolotto rapidamente e l&#39;isolotto è pronto per l&#39;immagine. </li><li> Utilizzare un microscopio 2 fotoni con un obiettivo 60X immersione in olio (NA 1.42) e software di imaging (ad es., Scanimage 11). La Figura 4 illustra una tipica disposizione microscopia. Immagine eventi esocitosi utilizzando SRB come una membrana impermeant marcatore extracellulare fluorescente eccitato da impulsi laser a femtosecondi a 880 nm, con la fluorescenza rilevati a 550-650 nm. Registrare le risposte isolotto alla stimolazione. </li><li> Identificare gli eventi esocitosi singoli dall&#39;improvvisa apparizione di una piccola macchia fluorescente (risoluzione 10 pixel /1; m) e confermare con la fase veloce di salita del segnale fluorescente sopra una regione di interesse (~ 0,78 micron 2). </li></ol></li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Il fattore più critico nell&#39;isolamento isolotto è la perfusione iniziale del pancreas; un sotto perfuso pancreas risultati in una resa isolotto notevolmente inferiore. Altri fattori influenzano anche la qualità di isolamento, come il tempo di digestione e il livello di agitazione che potrebbe in parte compensare il livello di perfusione. Ad esempio, un pancreas pienamente perfuso dovrà essere incubate a 37 ° C per ~ 18 min 30 sec agitatore, al contrario un sotto digerito pancreas possono richiedere ~ 20 min digestione difficile con agitazione. La miscela di due enzimi digestivi nelle nostre mani fornisce una migliore isolamento delle isole di solo uno dei due. Per la collagenasi unico metodo, il tempo di digestione influenza criticamente la resa isolotto e differenze di tempo di soli 30 secondi possono influenzare notevolmente la qualità. Per liberase soltanto, la resa è accettabile, ma sotto-digestione volte succede, riteniamo che l&#39;aggiunta di collagenasi aiuta a digerire il tessuto connettivo meglio. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Abbiamo trovato il db / topi db hanno diversi fenotipi diabetici, anche tra i fratelli. Come risultato, test di tolleranza al glucosio di ciascun animale prima sacrificare vengono eseguiti di routine. Ciò consente la classificazione degli animali in termini di riposo livelli di glucosio e l&#39;area sotto la curva in risposta al glucosio iniettato. Ci sono un certo numero di esperimenti possibili che possono essere eseguite dopo gli isolotti sono stati isolati. Isolato isole possono essere fissati in paraformaldeide o metanolo immediatamente dopo l&#39;isolamento e utilizzati in immunofluorescenza per determinare la posizione di proteine ​​di interesse 10. Isolate isole possono essere disperse in cellule singole. Questo può essere fatto nello stesso giorno di isolamento delle isole o dopo alcuni giorni di coltura isolotto. Le singole cellule sono poi placcati fuori ed è questa preparazione che è stato il pilastro per tecniche come patch clamp e totale microscopia a riflessione interna. Negli esperimenti che misuranola secrezione di insulina, così come per live-cell immagini 2-photon, abbiamo trovato che le isole richiedono 2 giorni di coltura in modo da fornire dati riproducibili. Quello che sta accadendo nella cultura non è ben compreso, ma è pensato per essere un periodo di ripresa del processo di isolamento e la digestione. La tecnica 2 fotoni presentato qui permette ai ricercatori di immagine del processo di secrezione di insulina, a livello dei singoli fusione dei granuli da molte cellule all&#39;interno isolette intatte. Abbiamo scoperto che il numero di eventi granuli di fusione e il loro calendario è in linea con gli importi e del profilo temporale della secrezione di insulina 8. Questo suggerisce il metodo rileva la maggioranza degli eventi di fusione dell&#39;insulina granuli. Dato che l&#39;ingresso in tintura ai granuli di fusione non è un metodo specifico per la rilevazione di insulina eventi di fusione dei granuli che abbiamo fatto di tutto per condurre esperimenti di controllo per dimostrare che la fusione di insulina granello in cellule beta sono allo studio 7,8 </sup&gt;. Tuttavia, un componente di questa prova dipende dalla struttura del isolotto roditore in cui le cellule beta sono arricchiti nel nucleo della isolotto. La diversa struttura delle isole umane, dove le cellule endocrine differenti sono sparsi in tutto il volume isolotto, richiederebbe ulteriori metodi per identificare le cellule beta. Ci sono una serie di problemi tecnici con il microscopio a 2 fotoni che sono generici per tutti gli approcci di imaging. Ad esempio, bilanciamo attentamente i fattori opposti di cercare di ottenere abbastanza luce per le isole in modo da poter ridurre il guadagno dei rivelatori, e di conseguenza ridurre il rumore, con la messa tanta luce per le isole che causare danni alle cellule. Nel nostro sistema, una cella di Pockels viene utilizzato per attenuare il laser pulsato (Figura 3); tutti i sistemi commerciali hanno meccanismi per alterare l&#39;intensità della luce che cade sul campione. In sintesi, la combinazione di un attento isolamento di db / db isolotti e tutto-isolotto microscopia 2 fotone presentano nuove opportunità per studiare i processi di secrezione di insulina e determinano gli elementi chiave difettosi nel diabete di tipo 2.

Il ruolo della disfunzione delle cellule beta nella malattia è stato ampiamente riconosciuto 3,4. Le linee cellulari, come il MIN6 e INS-1 sono strumenti utili per comprendere la biologia del comportamento delle cellule beta. Tuttavia, il controllo fisiologico della secrezione di insulina avviene all&#39;interno delle isole di Langerhans. Questi isolotti contengono migliaia di cellule beta fitte, così come i vasi sanguigni e di altri tipi di cellule endocrine. Questo ambiente all&#39;interno dell&#39;isolotto influenza la secrezione di insulina, ed è probabile che sia importante nel diabete. Pertanto, per comprendere il controllo fisiologico della secrezione di insulina, e la fisiopatologia della malattia, è essenziale studiare isolotti intatti. Isolamento Islet Isole umane vive e, in particolare, isolotti umani provenienti da pazienti affetti da diabete di tipo 2 sono difficili da ottenere. Inoltre, isole umane hanno limitate possibilità di manipolazione molecolare sperimentale. I ricercatori hanno quindi impiegato èlascia da animali e modelli animali di diabete di tipo 2. Un tale modello di malattia è il mouse db / db. Si tratta di una mutazione spontanea che i modelli di diabete di tipo 2 con una progressione fenotipo che ricorda molto da vicino la malattia umana 5,6. Il protocollo presentato qui per l&#39;isolamento delle isole da diabetici db / db topo ha molti punti in comune con gli altri gruppi con alcuni filtri per migliorare la resa, la purificazione e la sopravvivenza delle isole migliorata. Imaging 2 fotone Il live-cella 2 fotoni test qui descritta permette ai ricercatori di quantificare il numero e valutare le caratteristiche dei singoli granuli insulina contenente da molte cellule del diabetico 7 e wild type isolotti 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td>Roche</td><td>-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>to prepare isolation media</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>to prepare cultured media&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>to prepare cultured media</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>to dilute the liberase</td></tr><tr><td>Metamorph program</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>to analyze the 2-photon images</td></tr></tbody></table>

leprdb mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets

Il diabete di tipo 2 è una malattia cronica che colpisce 382 milioni di persone nel 2013, e si prevede un aumento di 592 milioni entro il 2035 1. Nel corso degli ultimi 2 decenni, il ruolo di una disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 è stato chiaramente stabilito 2. Progresso della ricerca ha richiesto metodi per l&#39;isolamento di isole pancreatiche. Il protocollo di isolamento delle isole qui presentata condivide molte fasi comuni con protocolli di altri gruppi, con alcune modifiche per migliorare la resa e la qualità delle isole isolate sia dal tipo selvatico e diabetico db LEPR (db / db) topi. Un live-cell imaging metodo 2-fotone è quindi presentata che può essere utilizzato per studiare il controllo della secrezione insulinica entro isolotti.

Resa Islet e purificazione Per un normale topo wild-type, sono attesi circa 200 isolotti. Isolotti sani guardare luminoso, di forma circolare e un bordo liscio. Un lotto di isolamento su digerito di solito ha piccole e sfocate isolotti mentre un partita sotto-digerito ha meno isolette e isolotti di cellule attaccato acinar (Figura 3). Per diabetici db / db topo, la resa isolotto e l&#39;aspetto dipende dalla progressione della malattia con migliori topi glicemico sono più grandi, isolotti più luminoso e più (fino a 300 isolotti) rispetto al peggio topi glicemico che hanno isolette più piccole con un aspetto traslucido (sotto 100 isolotti) Test 2 fotoni Immagini 2-photon è un test indiretto per misurare la secrezione di insulina a livello di singola fusione dell&#39;insulina granulo. In risposta a stimoli come glucosio o di potassio, granuli insulina fondono con la membrana plasmatica e il colorante SRB extracellulare entra the granuli cui risultato è la comparsa di una improvvisa fluorescente posto ~ 400 nm di diametro (Figura 5). Vari esperimenti sono stati condotti per validare questo test come misura della fusione dei granuli contenente insulina come la dose di glucosio dipendente di aumentare il numero di eventi granuli di fusione con la quantità prevista di secrezione di insulina, la dimensione coerente delle cellule risposto in 2 fotone con quello di una cellula beta, il diametro dei granuli simile misurata dal fotone 2 e il microscopio elettronico, la colocalizzazione della captazione colorante e insulina colorazione 8. Entro il tempo di registrazione, tutti gli eventi di esocitosi in risposta allo stimolo sono identificati e la posizione degli eventi, il tempo di comparsa, la durata e il tipo di eventi di fusione come-and-run bacio o completa fusione sono caratterizzati ( Figura 5, 6). Queste caratteristiche del processo di fusione sono utili per valutare<html> qualsiasi difetto nella fusione dei granuli in modelli di diabete di tipo 2. La nostra precedente relazione con questo metodo dimostra che il difetto in diabetici isolotti db / db è la perdita completa fusione dei granuli e non un cambiamento nelle caratteristiche cinetiche dei singoli granuli fusion 7. Inoltre, abbiamo dimostrato che il fattore più importante nella diminuzione della secrezione insulinica in malattia è una riduzione del numero di cellule responsive 7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig1.jpg" /> Figura 1:. Un diagramma dei siti di serraggio e iniezione Iniettare gli enzimi al dotto biliare comune vicino alla confluenza del dotto epatico comune e dotto cistico. Bloccare l&#39;ampolla di Valter da un morsetto vascolare per facilitare l&#39;enzima iniettato al dotto pancreatico. 2632fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2: Il processo di iniezione nei topi. Cifra superiore illustra l&#39;ago all&#39;interno del coledoco con un morsetto vascolare applicata presso l&#39;ampolla di Valter. La figura in basso mostra il pancreas liberase-perfusione dopo l&#39;iniezione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig3.jpg" /> Figura 3: immagini tipici di tipo selvaggio e isolotti db / db isolati (A) tipo selvatico isolato isolotti.. (B) db / db isole isolate. (C) Under-digerito isolotti con cellule acinari annessi (frecce). (D) Oltre digerito isolotti con le piccole e sfocate isolotti (frecce). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52632 / 52632fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4:. I componenti principali del microscopio 2 fotoni misura <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig5.jpg" /> Figura 5: Esempio di un singolo evento di insulina granulo fusione come registrato con microscopia a 2 fotoni figura sinistra rappresenta la cella prima (A) e dopo (B) la comparsa di un evento esocitica (freccia) in risposta a 15 mM stimolazione di glucosio.. (C) illustra l&#39;etichettatura SRB con l&#39;entrata del colorante SRB extracellulare nel granulo quando fonde con la membrana plasmatica. (D) mostra l&#39;intensità di fluorescenza su una regione di interesse di un evento esocitica nonché la sequentiaimmagini di questo evento l esocitica (scala bar 1 micron). Immagine modificata da Do et al 2014 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52632/52632fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52632/52632fig6.jpg" /> Figura 6:. Le risposte di tipo selvatico e diabetici isolotti db / db al microscopio 2 fotoni con SRB come il colorante extracellulare In questi eventi granello di fusione esperimenti di insulina in risposta alla stimolazione glucosio 15mm vengono registrati. Cerchi gialli sono luoghi degli eventi esocitosi durante 20 minuti di registrazione. Immagine modificata da Do et al 2014 7.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

leprdb-mouse-model-type-2-diabetes-pancreatic-islet-isolation-live

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

9.4K Views.  The University of Queensland. We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Video: Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of pancreatic tissue, such as the rat pancreas, and to increase the number of channels (cell types) that may be studied in a single specimen. We further describe the implementation of a number of computational tools that provide: 1/ accurate positioning of a specimen's (in our case the pancreas) centre of mass (COM) at the axis of rotation (AR)2; 2/ improved algorithms for post-alignment tuning which prevents geometric distortions during the tomographic reconstruction2 and 3/ a protocol for intensity equalization to increase signal to noise ratios in OPT-based BCM determinations3. In addition, we describe a sample holder that minimizes the risk for unintentional movements of the specimen during image acquisition. Together, these protocols enable assessments of BCM distribution and other features, to be performed throughout the volume of intact pancreata or other organs (e.g. in studies of islet transplantation), with a resolution down to the level of individual islets of Langerhans.

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

We describe the adaptation of optical projection tomography (OPT)1 to imaging in the near infrared spectrum, and the implementation of a number of computational tools. These protocols enable assessments of pancreatic &beta;-cell mass (BCM) in larger specimens, increase the multichannel capacity of the technique and increase the quality of OPT data.

Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Ricerca

Medicina

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations5, 6, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh7, 8, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient9, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a6 fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate6. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay10. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

A detailed description of mouse islet isolation is described using the technique of in situ pancreatic ductal cannulation and perfusion of a combination of purified collagenase and neutral protease.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Biologia

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologia e infezioni

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology have been developed and utilized in vivo, they are limited in terms of allowing single cell resolution and continuous longitudinal recordings. Because of the transparency of the cornea, the anterior chamber of the eye (ACE) in mice is well suited to study human and mouse pancreatic islet cell biology. Here is a description of how this approach can be used to perform continuous longitudinal recordings of grafting and revascularization of individual human islet grafts. Human islet grafts are inserted into the ACE, using NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mice as recipients. This allows for the investigation of the expansion of recipient versus donor cells and the contribution of recipient cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft. Further, a step-by-step approach for image analysis and quantification of the islet volume or segmented vasculature and islet capsule forming recipient cells is outlined.

The goal of this protocol is to continuously monitor the dynamics of the human pancreatic islet engraftment process and the contributing host versus donor cells. This is accomplished by transplanting human islets into the anterior chamber of the eye (ACE) of an NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mouse recipient followed by repeated 2-photon imaging.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocale Imaging di Neuropeptide Y-pHluorin: una tecnica per visualizzare esocitosi di granuli di insulina in isolotti intatti Murine ed umani

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

Microscopia a scansione laser confocale della dinamica del calcio in fette di tessuto pancreatico di topo acuto

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

Innesto di isole pancreatiche: un metodo per impiantare le isole pancreatiche nella camera anteriore dell'occhio del topo per l'imaging in vivo

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Ricerca sul cancro

Pancreatic Cancer

Assays & techniques

Intravital Imaging: A Method for Cellular Level Observation of the Mouse Pancreas Through a Stabilized Imaging Window

Source: Park, I. and Kim, P. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/62538">Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe the intravital imaging of a mouse pancreas through a stabilized window for long-term visualization of cellular dynamics.

Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

Source: Park, I. and Kim, P. Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital ...

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