저자는 현미경으로 도움말에 대 한 핵심 시설을 이미징 DRI에서 마 샤 Boulina 감사 합니다. 이 작품은 NIH 교부 금 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 및 R56 DK084321 (AC)에 의해 지원 되었다.

마이애미 대학의 동물 윤리 위원회는 모든 실험을 승인 했습니다.
 1. 바이러스 성 감염의 그대로 고립 된 인간 또는 마우스 췌 장 독도 <ol><li>섬 문화: 섬 문화 미디어 준비: Connaught 의료 연구 실험실 (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS 및 2 m L-글루타민.
	<ol><li>인간 췌 장 독도 통합 섬 배포 프로그램 (NIDDK, NIH)에서 얻을 수 있습니다. 도착 시 전송는 독도 (~ 500 섬 등가물) 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시.</li>
		<li>마우스 췌 장 독도 이전 설립된 프로토콜 16 다음 격리 될 수 있습니다. 절연, 다음 문화 ~ 200 섬 등가물에 35 m m 비-조직 문화 취급 37 ° C에서 2 mL CMRL 문화 미디어, 바이러스 성 감염 하기 전에 24 시간을 위한 5%/95% CO 2 /O 2 접시. 
		참고: NPY pHluorin와 형광 중복을 피하기 위해 독도 GFP 또는 YFP 기자 들과 유전자 변형 마우스를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol></li> <li>바이러스 준비 참고: NPY pHluorin 퓨전 pcDNA3 벡터 10으로 복제 되었고 adenoviral 생산 adenoviral vector에 subcloned [아 데 노비 루스 serotype 5 (DE1/E3)] 재조합 아 데 노 바이러스에 의해 제조 회사입니다. 바이러스는 aliquoted 및-80 ° c.에 저장 바이러스 성 재고 10 titers에서 회사에 의해 제공 됩니다 12 10 13 바이러스 성 입자 (~ 3 × 10 10-3 x 10 11 PFU).
	<ol><li>에 대 한 생체 외에서 섬, 사용 10 6 PFU/mL, 감염 (MOI)의 대략적인 다양성의 약 2 (자세한 토론 참조) 결과</li></ol></li>
	<li>췌 장 독도의 바이러스 성 감염 
	주의: 작업 adenoviruses Biosafety 수준 2 (BSL2) 절차와 인증을 요구 한다. 지도와 BSL2 절차에 대 한 교육 기관 Biosafety 장교와 확인 하십시오.
	<ol><li>위에서 설명한 대로 인간/마우스 독도 준비.</li>
		<li>추가 5-10 µ L 재고 바이러스의 인간/마우스 독도 CMRL 문화 미디어의 (10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL에 포함 된 각 35 mm 페 트리 접시. 
		참고: 바이러스 titer에 따라 사용 하는 회사 데이터 시트에서 제공 하는 바이러스의 볼륨 조절.</li>
		<li>포함 하는 바이러스에서 독도 문화 24 h. 위해 37 °C/5% CO 2 미디어</li>
		<li>후 24 h 발음 바이러스 포함 된 미디어 및 (와 함께 10 %FBS 2 mM L-글루타민) 2 mL CMRL 문화 미디어 바꿉니다.</li>
		<li>4-6 일 37 °C/5% CO 2, 대체 미디어 매 3 일에는 독도 문화.</li>
		<li>후 4-6 일 경작의 기대 주위 감염 되는 작은 섬 세포의 30%. 독도 라이브 이미징 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. Confocal 이미징의 감염 독도 참고: confocal 영상에 필요한 장비와 재료에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
<ol><li>시 약 준비 및 실험적인 체제 <ol><li>준비 extracellular 솔루션: pH 7.4, 살 균 필터링 추가 125 mM NaCl, 5.9 m m KCl, 2.56 m m CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0.1 %BSA. 
		참고:이 버퍼는 일반적으로 포도 당 없이 준비 하 고 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 포도 당 원하는 최종 농도 도달 하는 실험의 날에 추가 됩니다.
		<ol><li>준비 기저 포도 (3mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 75 µ L을 추가.</li>
			<li>Hyperglycemic (16mm) 매체: extracellular 솔루션 50 mL에 2 M 포도 당 재고의 400 µ L를 추가</li></ol>
		</li> <li>3mm 포도 당을 포함 하는 extracellular 해결책에 어떤 추가 자극 (예를 들어, KCl 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)) 희석.</li>
		<li>실험을 시작 하기 전에 1 h coverslip를 폴 리-D-리 솔루션 (1 mg/mL)의 30 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 H 2 o.와 그것을 rinsing 하 여 폴 리-D-리와 coverslips을 pretreat 
		참고: 폴 리 코팅 coverslips 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지.</li>
		<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 실험 하기 전에 적어도 1 시간 35 mm 페 트리 접시 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션을 포함 하는 독도 전송 합니다. 37 ° C, 5% CO 2에 독도 유지. 
		참고: 필요한 경우, 원형질 막이이 단계에서 표시 수 있습니다. 원형질 막에 레이블을, 3 mM 포도 당을 세포 외 솔루션 2 µ M 디-8-ANEPP 염료를 추가 합니다. 37 °C/5% CO 2에서 1 시간을 위한 염료 해결책에서 독도 품 어. 488에서 원형질 막 염료를 흥분 수 nm와 620에서 nm.</li>
		<li>분 실험을 시작 하기 전에 부착는 coverslip 이미징 챔버를 진공 실리콘 그리스와 씰링 합니다. 이미징 플랫폼 이미징 챔버를 수정 합니다. 20 분에 대 한 표면에는 독도 준수 coverslip의 폴 리 D Lysine 치료 영역에 20-30 독도 배치를 피 펫을 사용 하 여 
		참고: 그것은 중요 coverslip 섬 손상을 피하기 위하여 완전히 건조 하 게 하지 않습니다.</li>
		<li>는 독도 coverslip 준수는 하는 동안 철저 하 게 물으로 헹 궈 서 관류 시스템을 준비 합니다. 다른 채널에 추가 하는 각 솔루션: 3 mM 포도 당 (1 채널), 16 mM 포도 당 (2 채널), 16 mM 포도 당 100 µ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)와 10 µ M 산림 (채널 3), 3 mM 포도 당 (채널 4), 3 mM 포도 당 (에서 10 µ M ATP에에서 25 m m KCl 채널 5)입니다. 각 채널을 개별적으로 열고 몇 분 동안 솔루션 흐름을 보내는 여 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름 일관 (0.5 mL/min) 이며 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>관류 콘센트 튜브에 단일 인라인 솔루션 히터를 연결 하 고 37 outflowing 버퍼의 온도 조정 ° c.</li>
		<li>흡입 펌프를 준비합니다. 시스템에서 모든 거품을 제거 하 고 흐름은 일관 되 고 튜브 유출 되지 않습니다 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>는 독도 coverslip 표면에 고착 되 면 부드럽게 채워 이미징 챔버를 3 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션. 독도 coverslip의 표면에서 세척 하지 마십시오.</li>
		<li>현미경 단계에 독도와 이미징 플랫폼을 배치 하 고 관류 시스템 및 흡입 펌프에 연결.</li>
		<li>차례 흐름에 그리고 끊임없이 perfuse 3 세대 extracellular 솔루션 독도. 시스템은 이제 confocal 영상에 대 한 준비.</li>
	</ol></li> <li>Confocal 영상 <ol><li>낮은 확대와 함께 현미경 분야에는 독도 찾습니다. 일단는 독도에 초점, 더 높은 확대 목표 전환 (예를 들어, 63 X 물 침수 목표 (63 X / 0.9 없음)).</li>
		<li>소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 인수를 열고 공명 스캐너 모드 활성화.</li>
		<li>XYZT 영상 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성: <ol><li>설정에 아르곤 레이저와 488 nm 레이저 라인과 레이저 파워 pHluorin 여기에 대 한 50%를 조정.</li>
			<li>505-555 nm에 방출 수집.</li>
			<li>는 512 x 512 픽셀의 해상도 선택합니다. 보도 &#34; 라이브 &#34; 이미징 시작 (일반적인 이득은 약 600 V) 이득 레벨을 조정할을.</li>
			<li>설정 시작 및 z 스택의 끝:는 섬 위에 집중 하 고 선택 &#34; 시작 &#34; 마지막 집중 될 수 있는 선택 평면 이동 &#34; 끝 &#34;. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.</li>
			<li>1.5-2 s에 가까운 각 z 스택의 인수에 대 한 시간 간격을 설정 하 고 옵션 선택 &#34; 멈출 때까지 취득 &#34; 연속 이미징.</li>
			<li>보도 &#34; 시작 &#34; ini 버튼tialize.</li>
		</ol></li> <li>다양 한 자극 프로토콜을 사용 하 여 원하는 자극으로 독도 perfusing 하 여과 립 exocytosis를 유도. 자극 프로토콜 원하는 과학적 목적 (아래 참조)에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>자극 프로토콜 참고: 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 지속적인 관류 동안 섬 배경 활동의 적어도 2 분을 기록 하 여 시작 하는 모든 자극 프로토콜에서. 원하는 기간에 대 한 자극 제와 perfuse. 각성제의 순서, 자극의 지속 시간 녹음 기간 원하는 과학적 목적에 맞게 사용자 지정할 수 있습니다. 새로운 자극을 시작 하기 전에 3 mM 포도 당을 포함 하는 extracellular 솔루션과 독도 씻어 있는지 확인 하십시오. 아래 샘플 자극 프로토콜 메서드 기능을 보여 주기 위해 사용 되었습니다을 찾아.
	<ol>PHluorin pH 감도 및 바이러스 감염 효율 ( 그림 3)에 대 한 긍정적인 제어로 염화 암모늄 (NH 4 Cl)와 <li>Stimulate: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 50mm NH 4 Cl (2 분)에 3 mM 포도 당 &#8594; 포도 당 3 m m (2 분) 참고: NH에서 4 Cl 솔루션, 아데닌 기초에 NaCl을 대체.</li>
		<li>Stimulate ( 그림 5 및 그림 6) 포도 당 농도 증가 시켜 인슐린과 립 exocytosis: 3 mM 포도 당 (2 분) &#8594; 16 m m 포도 당 (15-30 분) &#8594; 3 m m 포도 당 (2 분 
		참고: 적어도 15 분에 대 한 16 G 솔루션으로 지속적으로 독도 perfuse 활동의 몇몇 파열을 보려면 
		참고: 분 비 응답 17의 일관성을 증가 하기 위하여 사용자가 3g와 16 G 솔루션 캠프 모금 에이전트 (100 µ M IBMX 및 10 µ M 산림)를 추가할 수 있습니다. 이 립 분 비의 시간적 패턴을 변경 하지 않습니다. 내용은 15와 토론을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+insulin+granule+biogenesis+and+exocytosis.">Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis.</a> Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).</li><li>Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell+identity,+glucose+sensing+and+the+control+of+insulin+secretion.">Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion.</a> Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).</li><li>Rorsman, P., Renstrom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+granule+dynamics+in+pancreatic+beta+cells.">Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).</li><li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet.">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).</li><li>Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vti1a+identifies+a+vesicle+pool+that+preferentially+recycles+at+rest+and+maintains+spontaneous+neurotransmission.">Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission.</a> Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).</li><li>Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+insulin+vesicle+dynamics+during+pulsatile+secretion.">Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion.</a> Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).</li><li>Ohara-Imaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+exocytosis+and+endocytosis+of+insulin+secretory+granules+in+the+pancreatic+beta-cell+line+MIN6+using+pH-sensitive+green+fluorescent+protein+(pHluorin)+and+confocal+laser+microscopy.">Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy.</a> Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).</li><li>Whim, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta+cells+synthesize+neuropeptide+Y+and+can+rapidly+release+peptide+co-transmitters.">Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters.</a> PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).</li><li>Tsuboi, T., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+&amp;#34;kiss-and-run&amp;#34;+exocytosis+revealed+by+evanescent+wave+microscopy.">Multiple forms of &amp;#34;kiss-and-run&amp;#34; exocytosis revealed by evanescent wave microscopy.</a> Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).</li><li>Zhu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+I+and+IX+function+redundantly+in+controlling+fusion+pore+of+large+dense+core+vesicles.">Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles.</a> Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).</li><li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+fusion+pore+opening+and+the+amount+of+hormone+released+are+regulated+by+myosin+II+during+kiss-and-run+exocytosis.">Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis.</a> Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).</li><li>Felmy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+cargo+release+from+dense+core+granules+by+size+and+actin+network.">Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network.</a> Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Gandasi, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+Red+Fluorescence+Proteins+as+Markers+for+Secretory+Granule+Exocytosis.">Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis.</a> PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).</li><li>Almaca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+coordination+of+insulin+granule+exocytosis+in+intact+human+pancreatic+islets.">Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets.</a> Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).</li><li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lepr(db)+mouse+model+of+type+2+diabetes:+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets.">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> J Vis Exp. (99), e52632 (2015).</li><li>Hanna, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kiss-and-run+exocytosis+and+fusion+pores+of+secretory+vesicles+in+human+beta-cells.">Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).</li><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment.">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+transfection+of+isolated+pancreatic+islets:+a+study+of+programmed+cell+death+(apoptosis)+and+islet+function.">Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function.</a> J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).</li><li>Michael, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cargo+proteins+in+pancreatic+beta-cells:+design+determines+secretion+kinetics+at+exocytosis.">Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis.</a> Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).</li><li>Serre-Beinier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cx36+makes+channels+coupling+human+pancreatic+beta-cells,+and+correlates+with+insulin+expression.">Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression.</a> Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).</li><li>Rutter, G. A., Hodson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+connectivity+in+pancreatic+islets:+a+type+2+diabetes+target?.">Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target?.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).</li><li>Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pHuji,+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+for+imaging+of+exo-+and+endocytosis.">pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.</a> J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology.">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li><li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature.">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 원고는 confocal 현미경 검사 법에 의해 exocytosis 그대로 췌 장 독도 내 베타 세포에서 인슐린 알갱이의 시각화를 사용할 수 있는 기술을 설명 합니다. 그것은 높은 transfection 효율을 보장 하기에 아 데 노비 루스 복제 형광 기자로 NPY-pHluorin를 사용 합니다.
방법은 우리 손에 고효율, 그것은 주로 두 개의 매개 변수 의존 하는 몇 가지 수정 해야 할 수도 있습니다: 1) 섬 준비, 및 감염 조건 최적화와 바이러스 성 주식의 2) titer의 품질. 독도의 바이러스 감염, 이전 섬 준비를 37 ° c.에 하룻밤 격리 및 수송 스트레스 로부터 복구할 수 있도록 셀 섬 표면 또는 섬 센터18 에 hypoxic 세포 (어두운 세포)의 존재에서 튀어나와 등 감소 생존의 흔적에 대 한 확인 하 고 감염/식 기간 내내 가벼운 현미경 섬 형태 검사 . 각 바이러스 성 주식의 titer 및 감염 효율성에서 달라질 수 있습니다. 바이러스 titer의 현미경 분석 결과 사전 문화 시간에 따라 사용 하는 바이러스의 볼륨을 조정 해야 합니다. 가장 중요 한 단계는 충분히 기자는 표현과 섬 무결성 및 응답 유지 감염 조건 (예를 들어, 바이러스 성 입자의 수, 시험 전에 문화 시간)의 최적화를. 감염 프로토콜을 최적화 하는 경우와 각 새로운 바이러스 성 배치와 함께, 다른 시간 지점에서 몇 가지 독도 수집 하 고 exocytosis KCl (30mm) 또는 높은 포도 당 (16mm) elicited 수 여부 확인. 우리는 발견 분석 결과 더 나은 작품 및 작은 섬 세포 건강 유지 포도 나 낮은 (약 2)와 문화 시간 때 응답 퓨전 구문 식 수준을 증가 (약 5 일) 확장 됩니다. 우리의 결과 이전 연구 유전자 제품의 효율적인 표현을 달성 될 수 있도록 더 나은 adenoviral vector의 낮은 transfecting 농도에서 섬 함수19를 유지 하면서 보여주는 라인.
그러나 기술은,, 몇 가지 제한이 있다. 하나는 기자로 서 NPY-pHluorin를 사용 하 여과 립 수 없습니다 구상 될 전에 그들은 원형질 막으로 융합 및 융합 공 열립니다입니다. 공부 하 고 인슐린과 립 exocytosis 대신 매매, 아 데 노 바이러스 NPY eGFP 인코딩 대신 사용할 수 있습니다. 또 다른 한계는, 낮은 정도로 NPY pHluorin 될 대상으로 수 있습니다 비 인슐린 포함과 립 이다. 그러나, NPY pHluorin에 감염 된 세포의 대부분은 또한 인슐린과 세포 표현 글 루카 곤 또는 somatostatin의 10% 미만 표현. 실제로,과 립 분 비, 타악기 패턴 및 공동 지역화, 인슐린과 포도 당 종속성 표시 가장 분 비 이벤트 인슐린과 립에서 화물 자료를 나타냅니다. 인슐린의 모니터링 되도록 exocytosis 발생, 분석 결과 (예를 들어, 높은 포도 당) 인슐린 분 비를 자극 하는 조건 하에서 수행 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 베타 셀 식의 특이성을 개선 하기 위해, NPY pHluorin는 쥐 인슐린 발기인 등 선택적 발기인의 통제 할 수 있습니다. 기술의 또 다른 한계는 그것은 exogenous 인슐린과 립, 그들의 속 및 동작20를 교란 할 수 있는 단백질의 식이 필요. 이 실험의 결과 해석할 때 고려해 야 하 고, 만약에 가능 하다 면, 결론 유효성을 검사 해야 다른 인슐린과 립 화물 단백질을 사용 하 여 (예를 들어, C-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티) 기자로.
또한이이 프로토콜 에이전트 캠프 모금 (IBMX 및 산림) 인슐린과 립 exocytosis에 높은 포도 당의 효과 약효를 포함 하는 것이 좋습니다. 이 자극 프로토콜 모방의 순수 관련 증폭 경로 (incretins 또는 paracrine 및 신경 신호 분자에 의해 트리거) 인슐린 분 비 췌 장 베타 세포에서 캠프를 증가 시켜 약효를 활성화 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 모금 에이전트 캠프의 부재, 높은 포도 당 (16 m m)는 또한과 립 exocytosis elicits 하지만 분 비 이벤트 관찰 수 낮습니다. 과 립 여전히 개별 버스트에서 평균 셀 응답와 동기화 나타나고 비슷한 버스트 기간 표시: 1.5-10 분 혼자 높은 포도 당에 대 높은 포도 당 플러스 IBMX/산림에서 1.4-6.6 분.
그것이 충분 한 공간 및 시간 해상도 그대로 독도 내 베타 세포에서 실시간으로에서 단일 퓨전 이벤트 시각화를 여기에 설명 된 분석 결과 기존의 방법에 관하여 중요 하다. 예를 들어, 그것은 높은 동기화를 인슐린과 포도 당 자극에 따라 인간의 독도에 출시는 밝혔다. 또한, 만약 독도 coverslip 잘 부착은, 그들은 수 수 몇 군데 장기간 (적어도 15-20 분) 동안. 이것은 인간의 독도 exocytosis 타악기 vivo에서 인슐린 분 비의 비슷한 기간에 나타나는 고유 파열에서 발생 보여 사용 되었다. 분석 결과 또한 인슐린 exocytosis murine 또는 인간의 독도 사용 하 여 여러 자극의 효과 테스트할 수 있습니다. 또한, 다른 방법 처럼 작은 섬 세포 분리는 필요 하지 않습니다, 때문에 그것은 베타 세포 인구는 섬 내에서 동작을 연구에 적용할 수 있습니다. 사실, 우리 이웃 베타 세포 클러스터의 형태로 관찰 ~ 5-10의 세포 활동이 동기화 됩니다. 동일한 클러스터에서 베타 세포는 아마 갭 정션 채널 connexin 3621의 의해 결합 됩니다. 동기화 응답 그들의 적절 일 분 비22필수적인 베타 세포 연결을 보여 줍니다.
미래에,이 기술은 어떻게 cytosolic 칼슘 또는 막 잠재력, 변화 예를 들어, 연관 베타 세포에서과 립 exocytosis 실시간으로 시각화 기능 이미징에 대 한 다른 형광 성 염료와 결합할 수 있습니다. 특히, 새로운 pH 민감한 붉은 형광 단백질 사용 가능한14,23 되고있다 고 NPY 또는 다른 인슐린과 립 화물 단백질을 융합 될 수 있는, 기능적인 화상 진 찰에 대 한 녹색 염료를 사용할 수 있습니다. 또한,이 기술은 vascularized 독도24마우스 눈 앞쪽 챔버에 이식의 비보에 이미징에 대 한 마우스 모델와 결합할 수 있습니다. 독도 adenoviruses 감염 될 수 있습니다 눈에 이식 하기 전에 48-72 h. 면역 결핍 생쥐 인간의 독도 이식 하는 경우 사용 되어야 한다. 이 모델을 사용 하 여, 인슐린과 립 분 비의 subcellular 공간 패턴 혈관 준비25와 상관 될 수 있다.

인슐린은 췌 장의 작은 섬의 베타 세포에 의해 생산 하 고 포도 당 물질 대사1의 키 레 귤 레이 터 이다. 죽음 또는 베타 세포의 기능 장애 포도 당 항상성을 방해 하 고 당뇨병2리드. 인슐린은 캘리포니아2 +에서 출시 된 코어 조밀한과 립에 포장-종속 방식3. 인슐린과 립 exocytosis 규제 어떻게 elucidating 완벽 하 게 이해 어떤 인슐린 분 비를 결정 하 고 당뇨병의 치료에 대 한 새로운 치료 대상의 식별에 대 한 새로운 경로 열 며 필수적 이다.
인슐린 exocytosis는 광범위 하 게 연구 되었습니다 형광 분자와 함께에서 막 커패시턴스 측정 등 미세한 접근 electrophysiological 접근을 사용 하 여. 막 커패시턴스 측정 좋은 시간적 해상도 있고 단일 셀 레코딩을 허용. 그러나, 커패시턴스에 변경 셀의 net 표면 변화를 반영 고 할 하지 개별 퓨전 이벤트를 캡처 또는 다른 비 인슐린 분 비 소포3에서 인슐린과 립 퓨전을 구별. 형광 프로브 및 소포 화물 단백질와 함께 2 광자 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등 미세한 방법을 추가 정보를 제공합니다. 이러한 기술은 단일 exocytotic 이벤트 및 사전 및 사후 exocytotic 단계를 캡처하고 셀3의 인구에 있는 exocytotic 패턴을 공부 하 고 사용할 수 있습니다.
형광 기자 세 가지 유형의 수: 1) extracellular, 2) 세포질, 또는 3) 나노미터. 1) extracellular 기자는 extracellular 환경4를 통해 소개 될 수 있는 폴라 추적기 (예를 들어, dextrans, sulforhodamine B (연료 부스터), 루시퍼 노란색, pyranine). 폴라 추적기를 사용 하 여 셀의 인구에는 퓨전의 조사 가능 하며 혈관 등 다양 한 세포 구조를 캡처합니다. 그러나, 그들은 소포 화물 동작에 보고 하지 않습니다. 2) 세포질 기자는 세포질 얼굴과 도킹 및 exocytosis에 참여 막 관련 단백질에 결합 하는 형광 프로브. 예는 신경 전달 물질 방출5공부에 대 한 신경 과학에서 성공적으로 사용 된 성 N-ethylmaleimide-민감한 요소 첨부 단백질 수용 체 (무) 가족 구성원을 포함 합니다. 이러한 여러 바인딩 파트너는 단백질과 인슐린과 립 하지 않습니다 특정. 3) 기공을 기자는 화물 전용 기 행동의 조사에 대 한 허용 하는 기공을 화물 단백질을 융합 하는 형광 프로브. 인슐린과 립 특정 화물 단백질 등이 인슐린, c-펩 티 드, 작은 섬 녹말 체 폴 리 펩 티 NPY 등6,7. NPY는 인슐린과 립, 포함에 이며 공동 출시, 인슐린과 형광 기자8에 대 한 우수한 파트너 만들기.
Exocytosis 신경 내 분 비 세포, 특정 synaptotagmin isoforms9,10 의 요구 등의 다양 한 측면을 연구 NPY 다른 형광 단백질의 융합 이전 고용 방법 방출의 시간-과정에 따라 다릅니다 말라 골격 myosin II11,12. 이 연구에서 우리는 비 형광은 수정 된 GFP가 형광 기자로 pHluorin를 선택 고밀도 코어 내부 산 성 pH에서과 립 하지만 된다 중립 extracellular pH13에 노출 되 면 밝은 형광. 성숙한 인슐린과 립 산 성 pH를 5.5 아래 있다. 일단은 립 원형질 막 및 열립니다 퓨즈, 그것의 화물 수 기자로 서 pH에 민감한 단백질 pHluorin 사용 하 여7,147.4의 extracellular 중립 pH에 노출 됩니다.
PH 민감한 성격의 pHluorin 그리고 인슐린과 립에 있는 NPY의 선택적 식에 비추어 NPY pHluorin 퓨전 구문 인슐린과 립 exocytosis의 다양 한 속성을 공부를 사용할 수 있습니다. 융해 구성의 바이러스 배달 높은 transfection 효율을 보장 하 고 고립 된 섬에 뿐만 아니라 기본 베타 셀 또는 셀 라인에 작동 합니다. 이 방법은 exocytosis NPY 포함 된 소포와 다른 세포 유형에서 공부에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 exocytosis에 어떤 유전자 변형 마우스 모델 연구 특정 조건 (knockdowns, overexpression, 등)의 효과를 결합할 수 있습니다. 이 기술은 이전 인간의 독도15베타 세포 인구에서 인슐린과 립 분 비의 공간 및 시간 패턴을 특성화 하기 위해 사용 되었습니다.

<table width="845">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="width:280px;height:63px;">Upright laser-scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:232px;">Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:167px;">TCS-SP5</td>
			<td style="width:167px;">includes LAS AF, the image acquisition software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Imaging chamber</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Imaging chamber platform</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">PH-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">22x40 glass coverslips</td>
			<td style="width:232px;">Daiggerbrand</td>
			<td style="width:167px;">G15972H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Vacuum silicone grease</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">Z273554-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Multichannel perfusion system</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">VC-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:232px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">TC-324C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Peristaltic Suction pump</td>
			<td style="width:232px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:167px;">P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:280px;height:42px;">35 mm Petri dish, non-tissue culture treated</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td style="width:167px;">10861-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">CMRL Medium, no glutamine</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">11530037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">FBS, heat inactivated</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">L-Glutamine 200mM</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">5M NaCl solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S5150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">3M KCl solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">60135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:280px;height:25px;">1M CaCl2 solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="width:280px;height:25px;">1M MgCl2 solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">1M HEPES solution</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Vacuum filter</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td style="width:167px;">431098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:232px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:167px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Di-8-ANNEP</td>
			<td style="width:232px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:167px;">D3167</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I5879</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:280px;height:21px;">Forskolin</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">F3917</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of neuropeptide y-phluorin: a technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets

인슐린 분 비 뿐만 질병에서 정상적인 생리 적인 조건 하에서 포도 당 항상성에서 중심 역할을 한다. 전기 생리학 또는 현미경 형광 기자 들의 표현에 결합 하거나 사용 하는 인슐린과 립 exocytosis 공부를 현재 접근. 그러나 이러한 기술의 대부분 클론 세포 라인에 대 한 최적화 되었습니다 또는 췌 장 독도 해리 요구. 대조적으로, 여기에 제시 된 방법 그대로 췌 장 독도에 인슐린과 립 exocytosis의 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 먼저 인코딩하는 pH에 민감한 녹색 형광 단백질 (GFP), pHluorin, neuropeptide Y (NPY)에 결합 된 아 데 노 바이러스와 격리 된 췌 장 독도의 바이러스 성 감염을 설명 합니다. 둘째, 우리는 confocal 이미징 독도의 5 일 후에 바이러스 성 감염 및 인슐린과 립 분 비를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 간단히, 감염 된 독도 이미징 챔버에 coverslip에 배치 되며 지속적으로 다양 한 자극을 포함 하는 extracellular 솔루션과 끼얹는다 되 하는 동안 똑바로 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. 공초점 이미지는 섬의 50 µ m에 걸친 빠른 공명 스캐너를 사용 하 여 시간 경과 녹음으로 획득 됩니다. 시간이 지남에 따라 인슐린과 립 원형질 막으로 융합을 다음 수 있습니다. 이 절차 또한 단일 실험에서 자극의 배터리를 테스트 가능, 마우스와 인간의 독도 이며 기능적인 화상 진 찰 (예를 들어, 막 잠재력 또는 cytosolic 칼슘 염료)에 대 한 다양 한 염료와 결합 될 수 있다.

기술의 전체 워크플로 그림 1에 표시 됩니다. 간단히, 마우스 또는 인간의 독도 수 NPY pHluorin 인코딩 하는 아 데 노 바이러스에 감염 되며 문화, confocal 현미경 아래에서 몇 일 후 몇 군데. 과 립 원형질 막 및 오픈 퓨즈, 형광 증가 관찰 고 측정할 수 있습니다 (그림 1). NPY pHluorin 실제로 인슐린과 립 역학을 모니터링 하는 데 적합 한 도구 인지 확인, 감염 된 독도 GFP와 다른 섬 호르몬 인슐린, somatostatin 또는 글 루카 곤에 대하여 항 체와 immunostained 했다. 대부분의 세포 표현 NPY-pHluorin (GFP 긍정적인) 베타 세포 했다 그들은 또한 인슐린을 표현 (~ 90%; 그림 2A, 2B). 몇 글 루카 곤-긍정적인 알파 세포 또는 somatostatin 긍정적인 델타 세포 GFP 표시 (그림 2B) 했다. 감염 된 세포, 인슐린 (GFP와 0.21 ± 0.05 GFP와 글 루카 곤 및 0.07 ± 0.01 GFP 및 somatostatin 대 인슐린 0.61 ± 0.04의 Pearson의 상관 계수)와 colocalized NPY 퓨전에서 중요 한 것은.
우리는 pHluorin는 효과적인 pH 센서 시연 50mm NH4세포내 pH를 증가으로 Cl 결과 &#62; (그림 3A, 3B, 비디오 1) 세포내 형광에 500% 증가. NPY pHluorin를 포함 하는 립 막 도발은 KCl (그림과 같은 인슐린 exocytosis를 자극 하는 조건에 따라 표시 되는 퓨전 원형질 막과 융합 숨 구멍의 오프닝에는 립 내부의 pH 증가 4, 비디오 2).
그대로 독도 내 베타 세포에서 분 비 이벤트를 단일 NPY pHluorin 감염 독도의 confocal 시간 경과 영상으로 구상 될 수 있다. 이러한 직접 막 도발은 KCl 또는 다른 여러 가지 생리 적 자극 (그림 4 및 그림 7, 아래 참조)에 발생 합니다. 기저 세포 외 포도 당 농도 (3mm)에 작은 분 비 활동 관찰 됩니다. 그러나, 플라즈마 막으로과 립 퓨전 높은 포도 당 (16mm) (그림 5A, 비디오 3)와 자극에 대 한 응답에서 트리거됩니다. 다른 크기를 가진 ROIs를 배치 하 여, 다른 지역에서 개별 셀 또는 셀 근접 (클러스터) (그림 5B)의 그룹의 분 비과 립의 응답 속도 비교할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석을 사용 하는 결정: 1)는 개별 분 비 이벤트 매우 동기화 하 고 분 비 평균 세포 반응에서 몇 초 이내 및 근접에서 2) 베타 세포 기능 클러스터 동기화 된 활동의 형성.
신체에서 인슐린 분 비는 타악기 방식으로 발생합니다. 장기간 (15-20 분) (그림 6, 비디오 4) 분 비의 여러 펄스 (또는 파열) 상승 했다에 대 한 높은 포도 당 농도와 NPY pHluorin 감염 독도 자극. 각 펄스 동안 개별과 립 (그림 5) 전에 같이 동기화 된 패션에 플라즈마 막으로 퓨즈. 분 비 활동의 파열 될 수 있습니다 볼 수 모든 3-4 분.
과도 NPY-pHluorin 포함과 립 또한 purinergic 주 작동 근 ATP에 대 한 응답에서 관찰 될 수 있는 형광에 증가 (10 µ M) 또는 muscarinic 주 작동 근 아 세 틸 콜린 (ACh, 10 µ M) 둘 다의 자극으로 알려져 있다 (그림 7), 인슐린 분 비 인간의 독도입니다. 예상 했던 대로, KCl (30mm)와 막 도발은 인슐린과 립 exocytosis (그림 5)를 실행. 여러 자극으로는 독도 자극 사이 잘 씻어 같은 섬 준비에 적용할 수 있습니다. 실험을 반복 하는 경우 응용 프로그램의 순서를 변경할 수 있는지 확인 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 분석 결과 설명 하는 구조 개발. NPY를 결합 하는 pH에 민감한 GFP (pHluorin)를 인코딩하는 아 데 노 바이러스 생산과 마우스 또는 인간의 췌 장 독도 감염 하는 데 사용 했다. 감염 후 4 ~ 6 일에 독도 coverslip에 배치 되었고 수직 레이저 검사 confocal 현미경 아래 몇 군데. NPY pHluorin 구조는 베타 세포에서 인슐린과 립에 표현 된다. 그것의 형광 성숙한 인슐린 알갱이의 산 성 pH에서 침묵 이다 하지만 립 퓨전 원형질 막 및 7.4의 extracellular 중립 pH에 노출 시 밝은.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig2.jpg"> 
그림 2입니다. 인슐린과 립 표현 된 NPY 퓨전 구성. (A) 그대로 인간의 독도의 공초점 이미지 감염 된 NPY-pHluorin, immunostained GFP (녹색) 및 인슐린 (왼쪽된 패널, 빨간색), somatostatin (중간, 빨간색) 또는 글 루카 곤 (오른쪽, 빨간색). 세포 핵 블루 (DAPI 표시)에 표시 됩니다. 스케일 바 = 10 µ m. (B) 또한 인슐린 (Ins), somatostatin (소마) 또는 글 루카 곤 (Glu)를 포함 하는 GFP-긍정적인 세포의 일부분의 정량화. 표시 된 평균 ± SEMs, n = 5 독도. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig3.jpg"> 
그림 3입니다. NPY pHluorin 효과적인 pH 센서 이다. 3mm (상단 패널, 3 세대) 전에 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션에서 NPY pHluorin 감염 마우스 섬의 공초점 이미지의 (A) 최대 투영 및 50 mM NH4Cl (하단 패널)의 존재. 눈금 막대 = 100 µ m. (B) 평균 형광 강도 (임의의 단위) NH4cl. 파선 선 유도 전체 섬에 있는 변화를 보여주는 추적 NH4Cl 응용 프로그램을 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig4.jpg"> 
그림 4입니다. 일단 그들은 원형질 막 및 오픈 퓨즈 NPY pHluorin를 포함 하는 립 표시 되. NPY pHluorin 아 데 노 바이러스와 인간 isletsinfected가 했다 incubat플라즈마 막으로에 드 디-8-ANEPP (레드) 염료. KCl (30mm)와 섬 자극 (녹색에서 표시) 셀 표면에 형광 알갱이의 급격 하 고 과도 모양이 트리거됩니다. 인간의 섬 내의 셀의 공초점 이미지 exocytotic 응답 앞에 표시 됩니다 (t = 0), 동안 (t = 3-9 s) 후 (t = 12 s). 대비 배경 녹색 형광을 제거 하려면 조정 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig5.jpg"> 
그림 5입니다. 높은 포도 당 유발 플라즈마 막으로 NPY pHluorin 퓨전. (A) 그대로 인간의 섬 기저 포도 당 농도 (3 세대-3 m m 포도 당, 왼쪽 패널) 또는 높은 혈당 (포도 당 16 G-16 m m, 오른쪽 패널)에서 NPY pHluorin 감염의 공초점 이미지 최대 투영 Extracellular 솔루션 포함 에이전트 산림 및 IBMX (자세한 내용은 프로토콜 참조)을 모금 하는 캠프. 눈금 막대 = 10 µ m. (B) 세포 (녹색) 또는 셀 클러스터 (블루) 추적 ROIs에서 녹색 채널에 평균 형광 강도 (임의의 단위)에 변화를 보여주는 단일 분 비 이벤트 (레드과 립), 주위에 배치. 높은 포도 당 5 분 후 적용 ~ 3 세대에서 2.5 분. 형광 값 초기 형광 값 (초기 계획)을 정상화 했다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig6.jpg"> 
그림 6입니다. 분 비 이벤트 생성 시 높은 포도 당 분 비의 개별 펄스. 추적에 있는 변화를 보여주는 ROIs 16 m m 포도 당으로 지속적인된 자극 동안 그대로 인간의 섬 내의 다른 셀 주위에 배치에 형광 강도 (임의의 단위)을 의미 합니다. 각 개별 셀을 나타냅니다. 분 비 활동의 파열 될 수 있습니다 볼 수 모든 3-4 분 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56089/56089fig7.jpg"> 
그림 7입니다. NPY pHluorin 퓨전 플라즈마 막으로 알려진 자극의 인슐린 분 비에 의해 트리거됩니다. 추적 ROIs 의미 형광 강도 (임의의 단위) 변화를 보여주는 개별 분 비 이벤트 KCl (30 m m), ATP에 의해 유도 된 그대로 인간의 독도 내 셀 주위에 배치 (10 µ M), 높은 혈당 (16 G, 16 m m)과 아 세 틸 콜린 (Ach, 10 µ M). KCl과 ATP 기저 포도 당 농도 (3mm)에 적용 했다. 블랙 라인 표시 평균과 립 및 회색 라인 sem의 값을 반영 합니다. 녹색 추적 해당 세포 응답을 표시합니다. 수평 시간 규모 (2 분) 모든 그래프에 적용 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/56089fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/56089/56089video1.jpg"> 
1 비디오입니다. NPY pHluorin 아 데 노비 루스 효율적으로 감염 섬 세포와 감각 pH 변화. 마우스 독도 4 일 동안 인코딩 NPY pHluorin 아 데 노비 루스 감염 되었습니다. 감염 된 독도 coverslip에 배치 하 고 이미징 챔버에 장착 했다. 세포내 pH를 증가 하는 독도 50mm NH43 mM 포도 당을 포함 하는 세포 외 솔루션에 추가 하는 Cl 끼얹는다 했다. NH4Cl 응용 프로그램에 따라 형광에 빠르고 강한 증가 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 영화 속도 = 5 fps. 영화의 총 기간은 90 s. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/Video_1_JoVe.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/56089/56089video2.jpg"> 
비디오 2입니다. 일단 그들은 원형질 막 및 오픈 퓨즈 NPY pHluorin를 포함 하는 립 표시 된다. 인간의 독도 NPY pHluorin 아 데 노비 루스 감염 했다 플라즈마 멤브레인 염료 디-8-ANEPP와 함께 알을 품을. KCl (30mm)와 섬 자극 세포 표면에 형광 알갱이의 급격 하 고 과도 모양이 트리거됩니다. Confocal 비행기의 최대 투영 표시 됩니다. 대비 배경 녹색 형광을 제거 하려면 조정 되었다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 = 5 fps. 영화의 총 기간은 60 s. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/Video_2_JoVe.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/56089/56089video3.jpg"> 
비디오 3입니다. NPY-pHluorin를 포함 하는 알갱이의 높은 포도 당 트리거 Exocytosis. NPY pHluorin 포함 된 알갱이의 퓨전 높은 포도 당 (16 m m)와 자극에 대 한 응답에서 트리거됩니다. 기저 세포 외 포도 당 농도 (3mm), 작은 분 비 활동을 관찰 합니다. 그러나, 높은 포도 당에 따라 인슐린과 립 정도 동기화 방식에서 섬에 다른 세포의 원형질 막에 나타납니다. 높은 포도 당 후 적용 ~ 3 세대에서 2.5 분 (16 G 레이블을 나타납니다). Confocal 비행기의 최대 투영 표시 됩니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 10 fps =. 영화의 총 기간은 7 분 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/Video_3_JoVe.avi" target="_blank">가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/56089/56089video4.jpg"> 
4 비디오입니다. 높은 포도 당으로 장기간된 자극 Exocytosis의 여러 파열을 트리거합니다. 높은 포도 당으로 장기간된 자극 분 비 독도, 동안과 립 뚜렷이 표시의 다중 펄스 상승을 제공 합니다. 분 비 활동의 펄스를 볼 수 있는 모든 ~ 인간의 섬의 3-4 분 Confocal 평면 표시 됩니다. 모조 색상 구성표는 형광 강도 대 한 적용 되었습니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 영화 속도 = 30 fps. 영화의 총 기간은 20 분 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56089/Video_4_JoVe.avi" target="_blank">가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오입니다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

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Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

Confocal Neuropeptide Y-pHluorin의 이미징: 그대로 Murine 인간과 독도에 인슐린과 립 Exocytosis를 시각화 하는 기법

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

confocal-imaging-neuropeptide-y-phluorin-technique-to-visualize

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K 조회수.  University of Miami. 우리는 pHluorin, pH에 민감한 녹색 형광 단백질을 사용 하 여 그대로 독도에 인슐린 exocytosis의 시각화를 위한 프로토콜을 설명 합니다. 격리 된 독도 소포 화물 neuropeptide Y에 결합 하는 pHluorin를 인코딩 하는 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 인슐린과 립 퓨전 이벤트의 검출에 대 한 수 있습니다.

비디오: Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

연구

생물학

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

인간 췌장 아일릿 절연 : 2 부 : 인간 아일 레츠의 정화와 문화

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징<em&gt; 생체</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

고해상도 시간 경과 이미징 및 생활 인간 제대 정맥 내피 세포의 미세 소관 역학의 자동 분석

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle cells is of major relevance for all studies dedicated to exploring muscle glucose metabolism and characterizing metabolic alterations. In muscle cells, glucose transporter type 4 (GLUT4) proteins translocate to the plasma membrane in response to insulin, thus allowing massive entry of glucose into the cell. The ability of muscle cells to respond to insulin by increasing the rate of glucose uptake is one of the standard readouts to quantify muscle cell sensitivity to insulin. Human primary myotubes are a suitable in vitro model, as the cells maintain many features of the donor phenotype, including insulin sensitivity. This in vitro model is also suitable for the test of any compounds that could impact insulin responsiveness. Measurements of the glucose uptake rate in differentiated myotubes reflect insulin sensitivity.
In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes, and glucose uptake rates with and without insulin stimulation are measured. We provide a detailed protocol to quantify passive and active glucose transport rates using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose ([3H]2dG). Calculation methods are provided to quantify active basal and insulin-stimulated rates, as well as stimulation fold.

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In this method, human primary muscle cells are cultured in vitro to obtain differentiated myotubes and glucose uptake rates are measured. We provide a detailed protocol to quantify rates in basal and insulin-stimulated states using radiolabeled [3H] 2-deoxy-D-Glucose.

포도당 섭취량 측정 및 인슐린 자극에 대한 반응<em&gt; In Vitro</em&gt; 배양 된 사람의 주요 근육 세포

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...