건선 환자의 피부 조직 검사는 친절 박사 안드레아스 Koerber 과학적인 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 (에센, 독일의 대학 피부과 부서)에 의해 제공되었다. XH도 NSFC 61263039과 NSFC 11101321에 의해 지원됩니다.

참고 : 건강한 사람에서 피부 조직 검사가 과학적 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 선택 과목 성형 수술을받은 개인의 복부 피부에 남은에서 얻었다. 인간의 피부의 사용은 승인 된 Radboud 대학 의료 센터, 네이 메헨, 네덜란드, 독일 에센 대학의 인간 연구를위한 의료 윤​​리위원회가 설정 한 규정에 따라한다. 인간의 피부에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 (흐름 캐비닛에서 작업 멸균 이후 세포 배양 경우 필수) <ol><li> 세포 배양 배지를 준비 : 없음 혈청 RPMI 1640 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (ml의 최종 농도 100 단위 / 100 μg의 / ㎖, 각각) + 피루 베이트 (0.02 밀리미터)와 루타 (0.02 mM)을 추가. </li><li> 완전 배지 준비 : 배양액 단계 1.1 + 10 % 인간 혈청 풀 (HPS)에서 제조; 4 ℃에서 저장한다. 우리 앞에 20 ° C ± 2 중간 가져와ING. </li><li> 4mm 라운드 생검 펀치기구를 사용하여 피부 조직 검사를 구하여 최대 4 시간 동안 4 ° C ON에서 20 ° C ± 2에서 RPMI1640 전체 문화 매체에 보관합니다. 실험실에 도착하면 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다. 참고 : 피부의 이상 저장 셀 수율 및 세포 생존에 영향을 미칠 것이다. </li><li> 푸른 덮인 해리 튜브 레이블과 레이블이 튜브에 5 ml의에게 완전한 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 6 웰 배양 판 (총 3 웰)를 각 웰에 완전 배지 2 ㎖를 추가합니다. 따라서 세 린스의 총을 달성, 단일 잘으로 조직 검사를 배치 린스, 두 번째 아니라 그것을 통해 이동하고이 단계를 한 번 더 반복 살균 도구를 사용합니다. </li><li> 멸균 페트리 접시로 잘 헹구고 피부 생검 전송 생검의 위에 완전 배지 100 ㎕를 추가하고, 신중 스테인리스 일회용 무균 메스를 이용한 피하 지방층을 긁어. 참고 : 목하는 중요한 단계입니다. </li><li> 멸균 페트리 접시에 4 작은 조각으로 각각의 피부 조직 검사를 잘라. 전송 샘플 (튜브 당 최대 4mm 생검 네) 완전 배지 5 ㎖를 함유하는 제조 해리 튜브. </li><li> 단단히 캡 튜브를 닫고, 자동화 된 조직 dissociator의 소매에 거꾸로 연결합니다. 모든 샘플 재료는 회 전자의 지역에 위치하고 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;프로그램 m_spleen의 _01&quot;56 초에 해당하는 회전 속도로 조직 검사를 해리 (첨부 된 프로그램 카드 기기의 내부 메모리 또는 제공하는 미리 정의 된 프로그램)을 실행하여 해리 프로세스를 시작합니다. </li><li> 처리 후, dissociator에서 분리 튜브를 분리하고 모든 해리 물질이 튜브의 바닥에서 수집되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 37 진탕 수조에서 분리 튜브에 콜라게나 IA (80 ㎎ / ㎖) μL (150)를 추가하고 샘플을 품어60 분 동안 C를 °. thedissociation 튜브에의 DNase I 100 ㎕ (5 MU / ㎖)를 추가, 잘 섞는다. 주 : 콜라게나 제 또는 세포 생존을 변경한다 긴 배양 시간의 고농도. </li><li> 자동화 된 조직 dissociator의 슬리브로 분리 튜브를 연결하고 조직 검사를 한 번 더 해리하려면 &quot;프로그램 M_ 비장 _01&quot;를 실행합니다. </li><li> 50 ㎖의 팔콘 튜브의 상단에 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 놓습니다. 세포 덩어리 / 조직 파편을 제거하기 위해 셀 스트레이너에 해리 샘플 자료를 적용합니다. </li><li> 완전한 배지 5 ㎖로 한 번 셀 스트레이너를 씻으십시오. 20 °에서 원심 분리기 C ± 2, 10 분, 흡인 상층 액 450 XG. </li><li> 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 전체 문화 매체의 300 μL에 재현 탁 세포 펠렛. 단일 세포 현탁액은 추가 분석을 위해 준비; 생체 세포 배양을위한 프로토콜을 계속하거나 분석 유동 세포 계측법. </li><li> 상기 난 경우ntracellular 사이토 카인 염색은 37 ℃에서 4 시간 동안 PMA (12.5 NG / ㎖), 이오 노마 이신 (500 ng의 / mL) 및 Brefeldine A (5 μg의 / ml)로 세포를 자극하고, 5 % CO 2 인큐베이터 플로우를 실행하기 전에 4 시간 동안 세포 계측법 분석. </li></ol> 피부 주민 T 세포의 2 클론 활성화 (예 생체 세포 배양) <ol><li> 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 100 μL 분취 단일 세포 현탁액 (1.15 단계에서 제조). 주 : 4mm 피부 생검 각각에 대해 획득 된 단일 세포 현탁액을 96- 웰 플레이트 중 적어도 두 개의 우물로 분할 될 수있다. </li><li> 항 -CD3 / 항 CD28 단클론 항체 - 코팅 된 마이크로 비드 (웰 당 25,000 비드), 재조합 인간 사이토 카인 RIL -2- (최종 농도 25 U / ml) 및 RIL-1β (50 ng의 최종 농도 / ㎖)을 추가한다. </li><li> 5 % CO 2에서, 100 % 습도, 37 부화 잘 표지 접시 뚜껑 배양 플레이트 커버 C 배양기를 °. 중간 색상이 노란색으로 변합니다 때 매체를 변경합니다. <br/&gt; 참고 : 투명 세포 식민지가 세포 배양의 날 (8)에서 관찰 할 수있다. </li></ol> 3. 주요의 유동 세포 계측법 분석 / 배양 된 피부 주민 T 세포 <ol><li> PBS + 0.2 % BSA : FACS 버퍼를 준비합니다. </li><li> V 바닥 96 웰 플레이트에 관심의 세포를 전송합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> PBS 100 ㎕에서 펠렛을 재현 탁. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> (: PBS를 사용하여 1,000 희석 1) 4 ° C에서 30 분 동안 고칠 가능성 염료를 결합 준비 eFluorescence780 100 ㎕와 얼룩 세포. 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다. </li><li> , 필요한 세포 표면 마커 모노클로 날 항체를 선택 예를 들면 : CD45-BV421 (HI30 1:20), CD3-ECD (UCHT1 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1 : 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1 : 400), CD14-FITC (TUK4 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188 1:50), CD25-PeCy7 (BC96 1:50)의 CD11c-PeCy7 (BU15 1:10), 및 CD1c-APC (AD5-8E7, 1시 10분) 시험 각 단클론 항체 희석 배수에 의한 FACS 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 - 혼합물을 제조한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다. </li><li> 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 25 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호, 20 ° C ± 2시 20 분을 품어. </li><li> 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다. </li><li> 단지 세포 표면의 얼룩을 필요로 샘플 단계 3.16를 계속합니다. </li><li> Foxp3의 세포 내 염색시 : <ol><li> 희석제 3 부를 농축액의 일부를 혼합하여 고정하고 permeabilization 버퍼를 준비한다. </li><li> 1 배 permeabilization 버퍼를 준비 : 멸균 H 2 O 1 부 10 배의 permeabilization 버퍼 + 9 부 </li></ol></li><li> 고정 및 permeabili 100 ㎕에 재현 탁 펠릿zation 버퍼는, 잘 혼합, 4 부화 30 분 동안 C를 °. </li><li> 450 2 분 동안 실온에서 XG 및 대기음 뜨는에서 각 웰, 원심 분리기 100 μL permeabilization 버퍼를 추가합니다. </li><li> permeabilization 버퍼를 한 번 더와 세포를 씻으십시오. </li><li> 예를 들어 필요한 세포 내 모노클로 날 항체를 선택 Foxp3를-eFluo450 (PCH101 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1 1:50) 및 IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1 : 400). 각 시험 단클론 항체 희석 인자에 따라 2 % 정상 쥐의 혈청을 함유 permeabilization 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 혼합물을 준비한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다. </li><li> 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 4 품다 빛으로부터 보호 30 분 동안 C를 °. </li><li> 30 분 부화 후, 각 웰에 permeabilization 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는. </li><li> permeabilization의 buffe와 세포를 씻으십시오R 한 번 더. microFACS 튜브에 110 FACS 완충액 μL 및 전송 세포 현탁액에 재현 탁 펠릿. 참고 : 샘플 10 색 유동 세포 계측법 사용하여 측정을위한 준비가되어 있습니다. </li><li> 필요한 정확한 세포 수의 경우, 즉시 유동 세포 계측법 사용하여 측정을 수행하기 전에 각 샘플에 fluorospheres의 잘 혼합 된 균일 한 현탁액의 10 μl를 추가합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서는 효율적으로 인간의 피부 생검으로부터 피부 상주 T 세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 장점은 가능한 림프구의 상대적으로 높은 수의 분리이고, 관련 표면 마커를 발현. 식별 된 셀의 서브 세트가 있었다 :하는 CD11c + 수지상 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포와 Foxp3의 + CD25 + 세포를 포함한다. 중요한 것은, 절연 피부 상주 T 세포의 생체 외 배양 잘 실현 후속 기능적 분석 하였다. 인간의 피부 조직의 구조적 일체 성을 유지하는 기능 외 부착 단백질의 분해 효소로 분해 기계적 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. 표피 및 진피의 디스 파제 기질 층 분리 이들 각 스킨 층의 세포 침투를 결정하기 위해 널리 사용되는 방법이지만, 우리는 디스 파제 처리 t 주도 눈치OA CD25 및 CD27의 세포 표면 발현의 중요한 감소 (도시되지 않음). 이러한 마커 림프구의 부분 집합의 특성을하는 것이 중요합니다, 우리는 그 디스 파제 처리의 영향 이후의 면역 표현형을 믿습니다. 이 분 T 세포의 숫자는 표피 (10)에 존재하면서 진피의 제거는 T 세포의 대부분 진피에 편재되어 건강한 사람의 피부 때문에, CD25 또는 CD27 발현 세포에서 관찰 된 감소에 대한 책임이 있다는 것 같지 않다 -12. 격리 된 각화 세포의 증식 능력의 디스 파제의 해로운 효과는 이전에보고되었다 (13). 세포 기능이 연구의 목적은 따라서, 디스 파제의 신중한 사용을 보장한다. 우리의 프로토콜에서 우리는 내가 피부 생검의 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 콜라게나 유형을 사용하고있다. 콜라게나 I 콜라게나 제 IV에 비해 높은 트립신 활성을 가지고 있으며, 따라서 더 가혹한하지만 그것은 테 되었기 때문에, 우리는이 특정 콜라게나을 선택한세포 배양에 대한 적합성에 대한 STED. 세포 배양에 적합하다 콜라게나 제 IV의 사용은 상기 현재 프로토콜을 최적화 할 수있는 미래의 단계가 될 수도있다. 그것의 특성으로 피부 인장력 및 기계 세분화에 매우 강하다. 지금까지 인간의 피부에서의 면역 세포의 포괄적 인 분석은 비교적 열악한 소화 프로토콜을 사용할 때 충분한 세포 수를 획득하는 기술적 과제에 의해 방해되어왔다. 그 결과, 현재까지 발표 대부분의 연구는 면역 분석에 의존한다. 피부 생검으로부터 CD4 + T 세포의 직접적인 분리는 일반적으로 복잡 여겨진다. 다른 방법은 피부 이식편의 사용은 배양 물 (10)를 크롤링 할 것이다. 그러나, 이러한 문화 2 ~ 3 주가 걸릴, 피부 이식편 배양 배지는 특정 T 세포 하위 집합 중 우선 크롤링으로 이어질 수있는 사이토 카인과 케모카인의 선택 세트가 포함되어 있습니다. 또한 배양 기간은 affec 수 있습니다세포의 표현형에서 t. 현재 프로토콜 표현형 직접 분리 한 후 T 세포 개체군의 기능적 연구를 모두 가능하게 첨가 사이토 카인 또는 케모카인과 CD4 (및 다른 세포 마커)의 발현을 잘 분리 한 후 보존하고, 사용하지 않는다. 시판 자동화 조직 dissociator이 열화 외 기질에 필요한 콜라겐과의 인큐베이션 전 피부 단편의 분리에 사용된다. 세포 외 기질로부터 세포의 후속 릴리스는 자동화 dissociator 다시 사용된다. 피부의 광범위한 설명서 절단 (데이터 미도시)와 유사한 세포 수를 얻을 수 있지만, 그 결과는 이하와 일치 연주자의 경험에 의존한다. 기기에 의해 제공되는 사전 정의 된 절차를 사용하여 피부의 해리 더욱 재현 가능한 결과를 산출 할 것이다. 그 피부를 보여주는 이전의 연구와 일치하는 다양한 리터를 포함eukocytes는 2,14, 중 CD11c + 수지상 세포, CD8 + 및 CD4 + T 세포 서브 세트 및 Foxp3의 + 세포는 여기에 제시된 프로토콜에 의해 제조 된 단일 세포 집단에서 관찰되었다. 중요한 것은,이 프로토콜은 가능한 림프구의 비교적 높은 수율을 산출한다. 때문에 프로토콜의 효율로, 단지 하나의 4mm 피부 생검 얻을 수 종종 환자 물질을 유용 공부 때. 상기 방법을 사용하여, 우리는 건선 환자의 피부 병변에서 분리 한 T 세포는 건강한 피부 9에 비해 IL-17A 및 IFNγ 생산하는 높은 용량을 보여 주었다 표시 할 수 있었다. 연구의 질문에 따라, 상기 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 특정 셀의 서브 세트를 정화 할 필요가있다. 이 경우, 피부의 큰 조각 일부 분석에 충분한 셀의 수율을 보장하기 위해 사용될 수있다. 이렇게하면 피부가 작은 파이로 절단되어야한다는 것을, 확인분리 프로토콜을 시작하기 전에 X 2mm 약 2mm의 eces. 결론적으로, 본 프로토콜은 피부 면역 반응하여 우리 통찰력을 향상 단일 세포 수준에서 의미 표현형 및 기능 분석을 용이하게 피부에 상주하는 세포를 분리하는 개선 된 방법을 제공한다. 해리 튜브 이상의 생검 처리 특히 현재 프로토콜의 중요한 단계는, 피하 지방 조직의 적절한 제거하고 작은 조각으로 피부의 절단이다. 지방 조직 및 / 또는 큰 조직 조각은 dissociator가 다시 실행을 요청, 제대로 작동하게됩니다. 이 심각 세포 생존 해를 끼칠 것입니다. 기술의 한계는 단일 4mm 피부 생검 유래의 세포 수는 셀의 서브 세트의 후속 분리를위한 충분하지 않은 점이다.

피부는 몸과 환경 사이의 기본 인터페이스로, 외부의 물리적, 화학적 및 상처, 자외선 및 미생물 등의 생물 모욕에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 피부는 두 개의 주요 구획, 표피 및 진피를 포함하고, 랑게르한스 세포, 대 식세포, 수지상 세포, 및 약 200 억 메모리 T 세포를 포함하여 면역 세포의 다양한 전체 혈액량 한 거의 두 배가 존재를 포함 2. 증가하는 데이터 기관은 피부 조직의 항상성 동안 다양한 병리 적 상태 모두에서 중요한 면역 기능이 개념을 지원한다. 정상 피부에 상주 면역 세포 immunosurveillance 3을 수행하는 것으로 생각되고, 이러한 4 건선 같은 염증성 질환의 발달에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 건선 병변 피부에서 CD4 +와 CD8 + 모두 T 세포가 OBS했다 침투erved하고는 CD4 및 CD8의 비율은 질병 상태 (5)에 따라 다르다는 것을 나타내었다. 그러나, 이러한 세포의 집단은 기존의 기술은 단지 소수의 세포를 분리 할 수​​ 있기 때문에 연구하기가 어렵다. 인간 피부 T 세포의 분리를위한 현재 널리 사용되는 기술은 효소 처리로 기계적 피부 분리를 결합한다. 인간의 피부 조직 검사는 광범위하게 다진 및 트립신, 콜라게나 제 및 / 또는 EDTA 6-8와 같은 효소와 함께 배양한다. 피부 인장력 기계적 세분화에 매우 내성이 배리어 티슈 인 것을 고려하면, T 세포의 분리의 설정 방법은이 세포 집단 어렵고 생체 외 세포 배양한다 거의 세포 및 생존 세포의 더 낮은 수를 생산 도전적인. 여기, 우리는 mechan을 결합하여 건강하고 참여 모두 건선 인간의 피부에서 림프구를 분리하는 수정 방법을보고효소 소화 콜라 사용과 함께, 자동화 조직 dissociator 닦지 않고 광범위의 기존 방법을 사용하여 피부의 iCal 해리. 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포 생존 서브 세트는 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 관찰되었다. 중요한 것은 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8의 발현이 잘 보존되었다. 이와 같이 제조 된 세포를 생체 외 세포 배양 또는 유세포 분석에 사용하기위한 준비가되어있다. 이 프로토콜은 성공적 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 단일 피부 생검 (4 ㎜)의 분석을 위해 사용되어왔다. 결과는 피부 거주 환자의 T 세포가 건강한 지원자 9 비교하여 IL-17, IFNγ와 같은 더 많은 염증성 사이토 카인을 생산 것으로 나타났다.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automated tissue dissociator. Using the &quot;program spleen_01&quot; for dissociation of the skin biopsy.</td></tr><tr><td>Cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, for flow cytometry</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

인간의 피부는 중요한 장벽 기능을 가지고 있으며, 병원균에서 조직의 항상성 및 보호에 기여하는 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다. 피부 액세스 비교적 용이하기 때문에, 이는 주변 면역 조절 메카니즘을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공한다. 면역 상주 건강한 피부 실시 immunosurveillance 세포 있지만는 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발달에서 중요한 역할을한다. 새로운 통찰력에도 불구하고, 다양한 염증성 피부 질환의 기초가되는 생물학에 대한 우리의 이해는 여전히 제한된다. 피부 생검 샘플로부터 분리 된 양질의 (하나의) 세포 집단이 필요하다. 지금까지 분리 절차 심각한 생존 세포의 충분한 수를 얻기의 부족에 의해 방해되어왔다. 분리 및 후속 분석 인해 수득 현재 분리 절차에 의해 야기되는 기계적 및 화학적 스트레스, 면역 세포 계통 마커의 손실에 의해 영향을받은단일 세포 현탁액. 여기서는 자동 조직 dissociator 및 콜라게나 제 처리를 사용하여 기계적 피부 분리를 조합하여 건강 관련 건선 모두 인간 피부 T 세포를 분리하는 개질 방법을 설명한다. 이 방법은 단일 세포 현탁액의 준비 시점에 CD4, CD8, Foxp3의와의 CD11c 대부분의 면역 계통 마커의 발현을 유지합니다. 성공적인 CD4 + T 세포의 분리 및 후속 표현형 및 기능 분석의 예는 도시된다.

여기에 제시된 프로토콜은 단일 4mm 피부 조직 검사를 사용하는 경우 760 ± 178,000까지 615 (± SEM, 건강한 지원자의 피부를 평균) ± 2,200 사이는 인간의 피부에서 가능한 림프구 (± SEM, 건선 환자의 피부 병변을 의미) 얻을 것입니다. CD45 + 세포의 종류는 CD4 + T 세포 (~ 45 %), CD8 + T 세포 (~ 30 %)을 포함 건강한 사람의 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액의 식별과의 CD11c + 수지상 세포 (~ 5 %했다 ) 몇 B 세포 (CD19 +의), NK 세포 (CD56 + CD3 반면, -), 또는 단핵구 / 대 식세포 (CD14 + 또는 CD1c +)가 관찰되었다 (도 1A). 이 방법은 인간의 피부 생검에서 CD4 + CD25 + Foxp3의 + 세포의 분석을 위해 수 있습니다. 고정 및 permeabilization 후 세포 내 염색을 사용함으로써, 전사 FAC의 발현을 입증 할 수있다CD25 + T 세포 토르 Foxp3를 (도 1a). 인간의 피부 생검으로부터 유래 단일 세포 현탁액 (데이타 미기재) FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD) FL9 (태평양 블루) 및 FL10 (크롬 오렌지)를 세포 계수기를 사용하여 채널에서 높은 자기 형광 배경을 보였다 . 림프구 인구의 적절한 분석을 위해, 우리는 따라서 림프구 인구 및 autofluorescent 세포 인구 (그림 1B)의 배제의 게이팅을위한 화려한 바이올렛 (421) 형광 색소가 결합 항 - 인간 CD45 단클론 항체의 사용을 권장합니다. 인간의 피부에 상주 세포의 대부분은 CD3 + T 세포 (도 1c)이었다. 세포 생존 분석을 위해 그것은 죽은 / 죽어가는 세포 (그림 1C)에서 가능한 구별하기 위해 고칠 가능성 염료를 사용하는 것이 좋습니다. 7.7 (평균은 ± SD) 가능한 세포 ± 65.3 %에서 일반적으로이 프로토콜 결과. 데이터 유세포의 추가 분석을 위해, advis 인죽어가는 또는 죽은 세포 보낸 생존 세포 집단의 게이트에 ED는 세포막 완전성을 상실하고, 이에 비특이적 백그라운드 염색을 증가 공액 된 항체를 결합 할 수있다. 이 프로토콜에 의해 고립 된 T 세포는 추가 기능 분석에 적합하다. 건선 환자의 피부 병변의 단일 4mm 생검을 사용함으로써, 생검 유도 T 세포 Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 자극 (도 2) 다음의 IL-17A 및 IFNγ 생산 것으로 나타났다. 관련 건선 피부 병변으로부터 새로 제조 된 단일 셀 피부 현탁액은 또한 생체 외 세포 배양 이후의 기능 분석을 위해 사용될 수도있다. 친 염증성 사이토 카인 IL-1β 또는 IL-23에 대한 팔일의 존재 하에서 항 CD3 / 항 CD28 단클론 항체가 코팅 된 마이크로 비드와 클론 자극 후 팽창 후, 세포를 예를 들면 그들의 cytok에 대해 분석 할 수있다오프라인 용량 (그림 3) 생산. 이렇게함으로써, 건강 및 건선 개인의 피부에서 유래 된 세포의 사이토 카인 생산 전위 사이에 명확한 차이를 관찰 하였다. 건선 개인의 T 세포는 건선 관련 시토 킨 IL17A하고 IFNγ을 생성하는 더 높은 용량을 나타내었다. 이것도 생체 외 배양 후 본보기 건선 사이토킨 표현형이없는 정상인의 경우에는, 유지되는 것을 의미한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig1.jpg" /> 그림 1. 백혈구의 종류는 텍스트에 기술 된 프로토콜을 사용하여 격리 된 건강한 사람의 피부에 상주 림프구 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액에서 식별 관심 플러스 정착 생존 염료, 형광 접합 된 모노클로 날 항체로 염색하고 즉시 분석 하였다 유동 세포 계측법. (A) 흐름 CY, CD4 +, CD8 + 및 CD25 + Foxp3의 피부에 상주 림프구에서 + 서브 세트 - 단핵 세포 (CD14), 수지상 세포 (중 CD11c), B 세포 (CD19), NK 세포 (CD56 + CD3)의 tometric 검출. 반대로 인간 CD45 / BV421 단클론 항체는 autofluorescent 세포에서 림프구를 구분합니다. CD45 + 세포를 사용 게이팅 전략은 (B)에 도시한다. 분리 후 가능한 CD45 + CD3 + T 세포의 (C) 비율입니다. 번호 양성 세포의 비율을 나타낸다. 세 가지 실험 / 기증자 중 대표적인 실험이 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig2.jpg" /> 도 2 : 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 T 세포 수 PRODU가전 ​​IL-17A와 IFNγ는. 단일 4mm 피부 조직 검사는 구두에 건선 환자의 피부 병변에서 촬영 또는 과학적 사용을위한 동의서를 작성되었습니다. 피부 상주 T 세포는 본문에 설명 된 프로토콜을 사용하여 단리 하였다. 피부 상주 T 세포에 의한 IL-17A와 IFNγ의 생산. Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 자극에 응답하여 사이토 카인의 세포 내 축적을 유동 세포 계측법으로 측정 하였다. 사이토 카인 양성 세포의 백분율이 표시됩니다. 세 가지 다른 환자의 데이터가 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig3.jpg" /> 도 3 : 피부에 상주하는 T 세포가 IL-17A 및 IFNγ 다음 생체를 생산할 수있는 <st건강 또는 건선 환자의 4mm 피부 생검으로부터 유도 룽&gt; 폴리 클로 자극. 피부에 상주하는 셀은 본문에 기술 된 프로토콜을 사용하여 제조 하였다. 그 후, 세포는 IL-1β 하나의 존재 하에서 항 CD3 / 항 CD28 단클론 항체가 코팅 된 마이크로 비드 (50 ng를 / ㎖, A) 또는 IL-23 (50 ng를 / ㎖, B) δ 일간 자극 하였다. 이어서, 세포 Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 동안 자극 한 후, 유동 세포 계측법에 의해 세포 내 사이토 카인 생산을 분석. 3 개의 독립적 인 실험 / 기부자 중 대표적인 예는 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.5K 조회수.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

유전학

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

의학

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

생물학

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Murine Dermal Lymphatic Capillaries에서 내피 세포 분리

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

저자 스포트라이트: Magnetic Bead-Based Isolation of murine Dermal Lymphatic Endothelial Cells

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리

요약

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마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서