Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt. XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.

HINWEIS: Hautbiopsien von gesunden Personen aus Bauchhaut Überbleibsel von Individuen erhalten wurden elektiven plastische Chirurgie nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke. Die Verwendung menschlicher Haut wurde genehmigt und in Übereinstimmung mit den gesetzten Regeln von der medizinischen Ethikkommission für Humanforschung der Radboud University Medical Center, Nijmegen, Niederlande und Universität Essen, Deutschland. 1. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus der menschlichen Haut (Work Sterile in einem Fluss Schrank wenn Nachfolgende Zellkultur ist erforderlich) <ol><li> Bereiten Zellkulturmedium: RPMI 1640 + Penicillin / Streptomycin (endgültige Konzentration 100 Einheiten / ml und 100 ug / ml, jeweils) + Pyruvat (0,02 mM) und Glutamax (0,02 mM) ohne Serum zugesetzt. </li><li> Bereiten komplette Kulturmedium: Kulturmedium, hergestellt in Schritt 1.1 + 10% humanes Serumsammel (HPS); Lagerung bei 4 ° C. Bringen Medium auf 20 ° C ± 2 vor unsing. </li><li> Besorgen Sie sich die Hautbiopsie eine 4mm lang Biopsie Punch Instrument und halten Sie es in RPMI1640 komplettem Kulturmedium bei 20 ° C ± 2 für bis zu 4 Stunden oder bei 4 ° C an. Verarbeiten Sie die Biopsie so schnell wie möglich bei der Ankunft im Labor. HINWEIS: Eine längere Lagerung der Haut wird die Zellausbeute und die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen. </li><li> Beschriften Sie eine blau-capped Dissoziation Rohr und mit 5 ml komplettem Kulturmedium in das markierte Rohr. </li><li> 2 ml komplettem Kulturmedium in jede Vertiefung (insgesamt 3 wells) einer sterilen 6-well-Kulturplatte. Verwenden Sie sterile Werkzeuge, um die Biopsie in einem einzigen gut zu platzieren, spülen, verschieben Sie es zu einem zweiten weit über und wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, also insgesamt drei Spülungen zu erreichen. </li><li> Übertragen Sie die gut gespült Hautbiopsie in eine sterile Petrischale, 100 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium auf der Oberseite der Biopsie und vorsichtig abkratzen das subkutane Fettgewebe mit einem Edelstahl-sterilen Einweg-Skalpell ab. HINWEIS: Thist, ist ein kritischer Schritt. </li><li> Schneiden Sie jede Hautbiopsie in 4 kleinere Stücke auf einer sterilen Petrischale. Transfer-Proben (bis zu vier von 4 mm Biopsien pro Röhrchen) auf die vorbereitete Dissoziation Röhrchen mit 5 ml komplettem Kulturmedium. </li><li> dicht schließen die Rohre mit der Kappe, und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator. Stellen Sie sicher, dass alle Probenmaterial in dem Bereich des Rotors befindet. </li><li> Starten Sie den Dissoziationsprozeß durch das &quot;Programm m_spleen _01&quot; läuft (ein vordefiniertes Programm zur Verfügung gestellt von den internen Speicher des Instruments oder durch die Begleitung Programmkarte), um die Biopsie bei der entsprechenden Drehzahl für 56 Sekunden zu distanzieren. </li><li> Nach der Bearbeitung lösen sich von der Dissociator die Dissoziation Rohr und stellen Sie sicher, dass alle das dissoziierte Material am Boden des Rohres gesammelt wird. </li><li> In 150 ul Kollagenase IA (80 mg / ml) in den Spaltrohr und Inkubation der Probe in einem geschüttelten Wasserbad bei 37° C für 60 min. 100 l DNase I (5 MU / ml) in thedissociation Rohr, gut mischen. Hinweis: Eine höhere Konzentration von Kollagenase oder längere Inkubationszeit wird die Lebensfähigkeit der Zellen zu verändern. </li><li> Bringen Sie die Dissoziation Rohr an der Hülse des automatisierten Gewebe Dissociator und führen Sie das &quot;Programm m_ Milz _01&quot; die Biopsie ein weiteres Mal zu distanzieren. </li><li> Legen Sie eine 70 &amp; mgr; M Nylon Zelle Sieb auf der Spitze eines 50 ml-Falcon-Röhrchen. Anwenden dissoziierten Probenmaterialien auf diese Zellsieb Zellklumpen / Gewebereste zu entfernen. </li><li> Waschen Zellsieb einmal mit 5 ml vollständigem Kulturmedium. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 10 min und Überstand absaugen. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt ein weiteres Mal. Resuspendieren Zellpellets in 300 &amp; mgr; l komplettem Kulturmedium. Einzelzellsuspensionen sind bereit für die weitere Analyse; weiterhin mit Protokollen für die ex vivo Zellkultur oder Zytometrie Analyse fließen. </li><li> Bei weiteren intracellular Zytokinfärbung stimulieren Zellen mit PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) und Brefeldin A (5 ug / ml) für 4 h bei 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 4 Stunden vor dem Strömungsdurchführen Zytometrie Analyse. </li></ol> 2. polyklonalen Aktivierung der Haut-Einwohner - T - Zellen (ex vivo Zellkultur) <ol><li> Aliquot 100 ul Einzelzellsuspensionen (hergestellt in Schritt 1.15) in einen Rundboden-96-Well-Platte. HINWEIS: Für jede der 4 mm Hautbiopsie können die erfassten Einzelzellsuspensionen in mindestens zwei Vertiefungen einer 96-Well-Platte aufgeteilt. </li><li> Hinzufügen anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beschichteten Microbeads (25.000 Kügelchen pro Vertiefung), rekombinantes menschliches Cytokin rIL-2 (Endkonzentration 25 U / ml) und rIL-1β (ng / ml Konzentration 50 final). </li><li> Decken Sie die Kulturplatte mit einem gut markierten Platte Deckel, Inkubation in 5% CO 2, 100% Luftfeuchtigkeit, 37 ° C Inkubator. Ändern Medium, wenn das Medium Farbe gelb wird. <br/&gt; Hinweis: Eine klare Zellkolonie von Tag 8 der Zellkultur beobachtet werden können. </li></ol> 3. Durchflusszytometrie Analyse von Primär- / kultivierten Haut-Einwohner-T-Zellen <ol><li> Bereiten Sie FACS-Puffer: PBS + 0,2% BSA. </li><li> Übertragen Zellen von Interesse in einer V-Boden 96-Well-Platte. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 ul PBS. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Stain Zellen mit 100 &amp; mgr; l präparierte eFluorescence780 konjugiert fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff (1: 1000 Verdünnung mit PBS) bei 4 ° C für 30 min. Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wählen Sie das gewünschte Zelloberflächenmarker mAb, zum Beispiel: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TÜK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), und CD1c-APC (AD5-8E7, die mAb-Mischung unter Verwendung von FACS-Puffer 1:10), bereiten nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 25 ul vorbereitet mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren 20 min bei 20 ° C ± 2, vor Licht schützen. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer, Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Bei Proben, die nur Zeiloberflächenfärbung erfordern, weiter mit Schritt 3.16. </li><li> Bei intrazellulären Foxp3-Färbung: <ol><li> Bereiten Fixierung und Permeabilisierung Puffer von einem Teil Konzentrat mit 3 Teilen Verdünnungsmittel zu mischen. </li><li> Vorbereitung 1x Permeabilisierung Puffer: 1 Teil 10x Permeabilisierung Puffer + 9 Teile sterilisiert H 2 O. </li></ol></li><li> Resuspendieren Pellets in 100 ul Fixierung und Diffusionsratesation Puffer, mischen, und Inkubation bei 4 ° C für 30 min. </li><li> 100 l Permeabilisierung Puffer in jede Vertiefung, Zentrifuge bei 450 × g bei RT für 2 min und absaugen Überstand. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung Puffer noch einmal. </li><li> Wählen erforderlich intrazellulärem mAbs, beispielsweise Foxp3-eFluo450 (pCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) und IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereiten Sie die mAbs Mischung Permeabilisierung Puffer mit 2% normalem Rattenserum nach jedem mAb Verdünnungsfaktor getestet. Definieren Gate-Einstellungen unter Verwendung von Isotyp-Kontrolle von Antikörper zusammen mit nicht-Fleck Probe. </li><li> In 20 ul der vorbereiteten mAb-Mischung in jede Vertiefung. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, vor Licht zu schützen. </li><li> Nach 30 min Inkubation in jede Vertiefung 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. Zentrifuge bei 20 ° C ± 2, 450 xg für 2 min und Überstand absaugen. </li><li> Wash-Zellen mit Permeabilisierung buffer ein weiteres Mal. Pellet in 110 &amp; mgr; l FACS-Puffer und Transfer Zellsuspensionen in microFACS Rohr. HINWEIS: Probe ist bereit für die Messung mit 10-Farben-Durchflusszytometrie. </li><li> Bei genaue Zellzahl erforderlich, fügen Sie 10 ul gut gemischten einheitliche Suspension von Fluorospheres in jeder Probe unmittelbar vor der Durchführung von Messungen mittels Durchflusszytometrie. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell - Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T - Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex - vivo - Kultur der isolierten Haut resident T - Zellen war sehr gut machbar und für die nachfolgende funktionelle Analyse erlaubt. Menschliche Haut kann mit den enzymatischen Abbau der extrazellulären Adhäsion Proteine, die durch die Kombination von mechanischer Dissoziation in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden funktionieren, um die strukturelle Integrität von Geweben aufrechterhalten. Obwohl Dispase basierte Schicht Trennung der Epidermis und Dermis eine weit verbreitete Methode ist die Zellinfiltration in diesen jeweiligen Hautschichten zu bestimmen, haben wir festgestellt, dass Dispase-Behandlung führte toa deutliche Verringerung der Zelloberflächenexpression des CD25 und CD27 (nicht gezeigt). Da diese Marker sind wichtige Lymphozytensubpopulationen zu charakterisieren, glauben wir, dass Dispase Behandlung Einflüsse nachfolgenden Immunophänotypisierung. Es ist nicht wahrscheinlich , dass die Entfernung der Dermis für die beobachtete Verringerung der CD25 oder CD27 - exprimierenden Zellen, da in der Haut von gesunden Personen die Mehrheit der T - Zellen in der Dermis lokalisiert ist , während minute T - Zellzahlen vorhanden sind , in der Epidermis verantwortlich 10 -12. Die nachteilige Wirkung von Dispase auf der Proliferationskapazität der isolierten Keratinocyten wurde zuvor 13 berichtet. Daher wird umsichtige Verwendung von Dispase gerechtfertigt, wenn die Zellfunktion das Ziel der Studie ist. In unserem Protokoll haben wir Kollagenase Typ unter Verwendung von I Einzelzellsuspension von Hautbiopsien zu erhalten. Obwohl Kollagenase I hohe tryptischen Aktivität im Vergleich zu Kollagenase IV hat und somit ist härter, haben wir diese besondere Kollagenase gewählt, weil es te gewesensted auf seine Eignung für die Zellkultur. Die Verwendung eines Kollagenase IV, die für die Zellkultur sein könnte ein zukünftiger Schritt weiter zu optimieren unsere aktuellen Protokoll geeignet ist. Aufgrund seiner Natur ist die Haut von Zugkräften und mechanischen Disaggregierung sehr widerstandsfähig. Bisher eine umfassende Analyse von Immunzellen in der menschlichen Haut wurde von technischen Herausforderungen bei der Beschaffung von genügend Zellzahlen behindert, wenn relativ harten Verdauung Protokolle. Als Konsequenz setzen auf immunhistochemischen Analysen meisten Studien bisher veröffentlicht. Die direkte Isolierung von CD4 + T - Zellen aus Hautbiopsien wird in der Regel aufwendig angesehen wird . Eine Alternative wäre die Verwendung von Hautexplantat kriechen aus Kulturen 10. Allerdings nehmen diese 2-3 Wochen Kultur, und die Haut Explantation Kulturmedium enthält eine Reihe ausgewählt von Zytokinen und Chemokinen, die den präferenziellen Crawling aus spezifischen T-Zell-Subpopulationen führen könnte. Darüber hinaus könnte der Kulturperiode affect den Phänotyp der Zellen. Das aktuelle Protokoll nicht die Verwendung von zugesetzten Cytokinen oder Chemokinen, und die Expression von CD4 (und auch andere Zellmarker) machen, ist gut nach der Isolierung erhalten, sowohl phänotypische und funktionelle Untersuchung der T-Zell-Populationen direkt nach der Isolierung ermöglicht. Eine im Handel erhältliche automatisierte Gewebe Dissociator ist für die Dissoziation von Hautfragmente vor ihrer Inkubation mit Kollagenase, die für den Abbau der extrazellulären Matrix verwendet. Für die anschließende Freisetzung der Zellen aus der extrazellulären Matrix wird die automatisierte Dissociator wieder verwendet. Obwohl eine umfangreiche manuelle Schneiden von Haut ähnliche Zellzahlen ergeben kann (Daten nicht gezeigt), sind die Ergebnisse weniger konsistent und sind abhängig von der Erfahrung des Ausführenden. Die Dissoziation von Haut der vordefinierten Prozedur durch das Instrument angeboten verwendet, wird ergeben viel mehr reproduzierbare Ergebnisse. In Übereinstimmung mit früheren Studien, dass die Haut zeigt, enthält verschiedene leukocytes Teilmengen 2,14, CD11c + DCs, CD8 + und CD4 + T - Zellen, und + Foxp3 - Zellen wurden in Einzelzellpopulationen , die durch das Protokoll hier vorgestellten beobachtet. Wichtig ist, ergibt das Protokoll eine relativ hohe Ausbeute an lebensfähigen Lymphozyten. Aufgrund der Effizienz des Protokolls, ist es besonders nützlich, wenn das Studium Patientenmaterial, wobei häufig nur ein einziges 4 mm Hautbiopsie erhalten werden kann. Mit der Methode konnten wir zeigen , dass T isolierte Zellen aus der fallener Haut von Psoriasis - Patienten eine höhere Kapazität zeigte produzieren IL-17A und IFNy im Vergleich zu gesunden Haut 9. Je nach Fragestellung kann es erforderlich sein, um bestimmte Zellen-Untergruppen nach der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu reinigen. In diesem Fall größere Hautstücke können verwendet werden, um die Ausbeute an Zellen ausreichend, um sicherzustellen, für die Teilmenge analysiert. Dabei ist darauf zu achten, dass die Haut in kleinere pi geschnitten werdenECES von etwa 2 mm x 2 mm vor der Isolierung Protokoll zu starten. Abschließend bietet das vorliegende Protokoll eine verbesserte Art und Weise Haut resident Zellen zu isolieren, sinnvolle phänotypische und funktionelle Analyse auf Einzelzellebene zu fördern und so unsere Erkenntnisse in der Hautimmunantworten zu verbessern. Kritische Schritte im aktuellen Protokoll sind die richtige Entfernung von subkutanem Fettgewebe und das Schneiden der Haut in kleinere Stücke, vor allem, wenn mehr als eine Biopsie in einer Dissoziation Rohrbearbeitung. Fettgewebe und / oder große Gewebestücke bewirkt, dass der Dissociator unsachgemäß arbeiten, bitten um wieder läuft. Dies wird ernsthaft die Lebensfähigkeit der Zellen zu schaden. Die Begrenzung der Technik ist, dass die Zellzahlen aus einer einzelnen 4 mm Hautbiopsie abgeleitet sind nicht genug für die nachfolgende Isolierung von Untermengen von Zellen.

Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans&#39;schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis - T - Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T - Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen. Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd. Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex - vivo - Zellkulturen oder Durchflusszytometrie - Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T - Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.

<table><tbody><tr><td>Disposable Biopsy Punch</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpels</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tube</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Blue-capped, used as the dissociation tube.</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Automated tissue dissociator. Using the &quot;program spleen_01&quot; for dissociation of the skin biopsy.</td></tr><tr><td>Cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 &amp;micro;m nylon</td></tr><tr><td>96-well U-bottom plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Human Pooled Serum (HPS)</td><td>in house prepared</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, suitable for cell culture</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000</td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Concentrate</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Fixation/Permeabilization Diluent</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization Buffer (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Mouse anti-human CD45</td><td>BD</td><td>563879</td><td>Clone: HI30; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>FITC Mouse anti-human CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone: TUK4; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PE Mouse anti-human CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone: MOC-1; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>ECD Mouse anti-human CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.</td></tr><tr><td>PC5.5 Mouse anti-human CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone: BU15; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>APC Mouse anti-human CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone: B9.11; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone: J3-119; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone: BC96; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;PE Rat anti-human CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone: HECA-452; dilution factor 1:</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-human Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Mouse anti-human IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Counting beads, for flow cytometry</td></tr></tbody></table>

lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture

Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T - Zell - Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.

Das Protokoll hier präsentiert wird Ausbeute zwischen 2200 ± 615 (Mittelwert ± SEM, Haut von gesunden Probanden) bis 178.000 ± 760 (Mittelwert ± SEM, fallener Haut von Psoriasis-Patienten) rentable Lymphozyten aus der menschlichen Haut, wenn eine einzelne 4 mm Hautbiopsie. Verschiedene Arten von CD45 + Zellen wurden in Einzelzellsuspensionen identifiziert , die von der Haut von gesunden Personen einschließlich CD4 + T-Zellen (~ 45%), CD8 + T-Zellen (~ 30%) und CD11c + DCs (~ 5% ), während einige B - Zellen (CD19 +), NK - Zellen (CD56 + CD3 -) oder Monozyten / Makrophagen (CD14 + oder CD1c +) beobachtet (1A). Die Methode erlaubt auch die Analyse von CD4 + CD25 + Foxp3 + Zellen in menschlichen Hautbiopsien. Durch die Verwendung von intrazelluläres Färben nach Fixierung und Permeabilisierung, ist es möglich, die Expression des Transkriptions fac demonstrierentor Foxp3 in CD25 + T - Zellen (1A). Einzelzellsuspensionen aus menschlichen Hautbiopsien abgeleitet zeigten eine hohe Autofluoreszenz-Hintergrund in FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (pacific blue) und FL10 (Chromorange) Kanäle mit einem Zytometer mit (Daten nicht gezeigt) . Für eine korrekte Analyse der Lymphozyten - Population, also wir die Verwendung eines Anti-Human - CD45 mAb mit einem Brilliant Violet 421 Fluorochrom zur Torsteuerung der Lymphozyten - Population und den Ausschluss von der autofluoreszenten Zellpopulation (1B) konjugiert empfehlen. Die Mehrheit der Bewohner Zellen in der menschlichen Haut waren CD3 + T - Zellen (1C). Für die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse wird empfohlen , von den toten / sterbende Zellen (1C) eine fixierbare Lebensfähigkeit Farbstoff zu unterscheiden , rentabel zu verwenden. Typischerweise Ergebnisse dieses Protokolls auf 65,3% ± 7,7 (Mittelwert ± SD) lebenden Zellen. Zur weiteren Analyse der Durchflusszytometrie Daten ist es advised zum Tor auf der lebensfähigen Zellpopulation, da tote oder sterbende Zellen verlieren ihre Integrität der Zellmembran, und nicht-spezifisch konjugierten Antikörper binden kann, wodurch die Hintergrundfärbung zu erhöhen. T-Zellen durch dieses Protokoll isoliert sind gut geeignet für die weitere funktionelle Analyse. Eine einzelne 4 mm Biopsie lesional Haut von Psoriasis - Patienten durch Verwendung wurde gefunden , dass die Biopsie - abgeleiteten T - Zellen nach 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A (Figur 2) erzeugte IL-17A und IFNy gezeigt. Auch für weitere ex vivo Zellkultur und nachfolgende funktionelle Analyse Einzelzellsuspensionen aus der Haut beteiligt psoriatischen Hautveränderungen können Frisch zubereitete verwendet werden. Nach der Expansion nach polyklonale Stimulation mit anti-CD3 / anti-CD28 mAb beschichteten Mikrobeads in Gegenwart der proinflammatorischen Zytokine IL-1β oder IL-23 für 8 Tage, können beispielsweise die Zellen für ihre cytok analysiert werdenine Produktionskapazität (Abbildung 3). Dadurch wurde so eine deutliche Differenz zwischen dem Zytokin produzierenden Potential von Zellen, die aus Haut von gesunden und psoriatischer Individuen beobachtet. T-Zellen von psoriatischer Individuen zeigten eine viel höhere Kapazität der Psoriasis Zytokine IL17A und IFNy zu erzeugen. Dies bedeutet , dass auch nach der Ex - vivo - Kultur ist eine prototypische Psoriasis Zytokin - Phänotyp beibehalten, fehlt bei gesunden Kontrollen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig1.jpg" /> Abb . 1: Verschiedene Arten von Leukozyten identifiziert werden in Einzelzellsuspensionen von der Haut abgeleitet von gesunden Menschen Haut resident Lymphozyten isoliert unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben wurden mit den fluorochromkonjugierten mAb von Interesse und fixierbar Lebensfähigkeit Farbstoff und sofort analysiert gefärbt durch Durchflusszytometrie. (A) Durchfluss cymetrisches Nachweis der Monozyten (CD14), DCs (CD11c), B - Zellen (CD19), NK - Zellen (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + und CD25 + Foxp3 + Subsets innerhalb der Haut resident Lymphozyten. Anti-Human CD45 / BV421 mAb unterscheidet Lymphozyten von autofluoreszenten Zellen. Die Gating - Strategien für CD45 + Zellen ist in (B) gezeigt. (C) Prozentsatz der lebenden CD45 + CD3 + T - Zellen nach der Isolierung. Zahl zeigt den Prozentsatz der positiven Zellen. Ein repräsentatives Experiment aus drei verschiedenen Experimenten / Geber angezeigt wird. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig2.jpg" /> Abbildung 2: T - Zellen aus fallener Haut von Psoriasis - Patienten abgeleitet produ könnence IL-17A und IFNy. Eine einzelne 4 mm Hautbiopsie wurde bei oral von der fallener Haut von Psoriasis Patienten entnommen oder informierte Zustimmung für wissenschaftliche Zwecke geschrieben. Die T-Zellen der Haut Bewohner wurden unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben isoliert. Produktion von IL-17A und IFNy durch Haut resident T-Zellen. Intrazelluläre Akkumulation von Zytokinen in Reaktion auf 4 h Stimulation mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A wurde durch Flusszytometrie gemessen. Prozentsatz der Cytokin-positiven Zellen gezeigt. Daten von drei verschiedenen Patienten gezeigt werden . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52564/52564fig3.jpg" /> Abbildung 3: Skin-resident - T - Zellen sind in der Lage IL-17A und IFNy folgenden ex vivo zu produzieren <strong&gt; polyklonalen Stimulation. Haut Bewohner aus einer 4 mm Hautbiopsie von gesunden oder Psoriasis Patienten gewonnenen Zellen wurden unter Verwendung des Protokolls im Text beschrieben , hergestellt. Danach wurden die Zellen mit anti-CD3 / anti-CD28 mAb beschichteten Mikrobeads in Gegenwart von entweder IL-1β (50 ng / ml, A) oder IL-23 (50 ng / ml, B) angeregt für 8 Tage. Als nächstes wurden die Zellen für 4 Stunden mit PMA / Ionomycin in Gegenwart von Brefeldin A und danach analysiert, für die intrazelluläre Zytokinproduktion durch Durchflusszytometrie stimuliert. Ein repräsentatives Beispiel aus drei unabhängigen Experimenten / Geber angezeigt wird. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52564/52564fig3highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

14.5K Aufrufe.  Radboud University Medical Centre. We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Serie: Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetik

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Medizin

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biologie

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Isolierung von Endothelzellen aus dermalen Lymphkapillaren der Maus

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autor im Rampenlicht: Magnetische Bead-basierte Isolierung von murinen dermalen lymphatischen Endothelzellen

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und

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