이 작품은 박사 Ungrin에 대한 새로운 조사 시동 부여에서 캘거리 대학에 의해 투자되었다.

주 : 마이크로 웰 플레이트는 원하는 결과에 따라 다른 형식으로 사용할 수 있습니다. 사양뿐만 아니라 각 형식으로 표기 세포의 최소 및 최대 숫자에 대한 대략적인 지침을 표 1에 나타낸다. 작은 마이크로 웰은 날카로운 점에 테이퍼와 상체 사이의 변화는 작은 크기에 더 중요한되고 있지만, 따라서 더 낮은 크기 제한은 없다. 적은 20 세포 각각의 평균에서 상체의 일상적인 생산은 간단 8입니다. 큰 마이크로 웰의 크기가 가늘어되지 않으며, 따라서 각각의 마이크로 웰에있는 여러 개의 작은 상체가 발생할 수 있습니다 세포의 작은 숫자에서 상체를 형성하려고 시도합니다. AggreWell 400Ex 플레이트를 사용하는 경우로 인해 표면 특성에 약간의 차이, 계면 활성제 용액 (단계 1.2)와 준비는 선택 사항이 아닙니다. 이 프로토콜은 AggreWell 400 판의 사용을 기반으로합니다 - 다른 형식의 죄수ULT 표 1. 각 웰에로드 할 셀의 수는 각 회전 타원체 클러스터 화하는 세포의 숫자로 포함 마이크로 웰의 수를 곱함으로써 결정된다. 예를 들어, 개당 1,000 세포에서 상체를 생성하기 위해, 각 웰은 (1,200 상체 1,000 배 세포 각 =) 1.2 × 10 6 세포로로드해야합니다. 세포 밀도가 세포 0.4 ㎖를로드 할 것을 관련 계산해야한다. 그래서 1000 셀 각각 형성 상체의 예를 들면, 0.4 ml의 1.2 X 10 6 세포 밀리리터 당 3 × 10 6 세포의 밀도로 변환합니다. 1. 세포를 수신 할 준비 마이크로 웰 <ol><li> 마이크로 웰 플레이트를 제공 한 멸균하고, 그러한 층류 흐름 생물 안전 캐비닛 등의 무균 환경에서 자신의 포장에서 제거해야합니다. 불임 프로토콜에 걸쳐 유지되어야한다. 불임은 우물 물을 사용하여 70 % 에탄올을 사용하여 resterilized하는, 타협해야한다옵션 단계를 수행. <ol><li> 사용되지 않는 각 웰에 70 % 에탄올 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 에탄올 증기는 신속하게 거품을 투과해야하는 동안 다수가 있으면이를 제거하는 것이 바람직 할 수있다. 2,000 X g에서 2 분간 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑으로 5 분 동안 배양한다. </li><li> 기음 에탄올. 플레이트는 지금 즉시 사용할 수 있도록 멸균 또는 PBS로 세척, 또는 저장을 위해 공기 건조 할 수있다. </li></ol></li><li> 세포를 마이크로 웰의 표면과 상호 작용하지 않도록하기 위해서는, 계면 활성제를 사용하여 제조 될 수있다. 일반적으로 그것은이다이후에 처음이 단계를 수행하는 것이 바람직하고, 함께 계면 활성제 코팅 된 마이크로 웰없이 생성 상체를 비교합니다. <ol><li> 각 웰에 세정 용액 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑에 적어도 삼십분 동안 품어, 또는 4 박 ° C에서 제대로 건조 방지하기 위해 밀봉하면 필요할 때까지 플레이트는 우물에서 계면 활성제 용액에 네 개의도에 저장 될 수있다. </li><li> 멸균 또는 사용하는 PBS 직전에 접시를 씻으십시오. 판에게 허용하지 않습니다코팅 후 건조합니다. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 참고 : 셀 준비의 세부 사항은 특정 세포 유형이 연구되고와 다소 다를 수 있습니다. 그러나 우리는 여기서 설명 줄뿐만 아니라 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포 (ESC), 사람의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC), 섬유 아세포, 추정 원시 내배엽 포함한 세포의 광범위한 범위를 갖는 효과가 이러한 조건을 관찰 와 기질 세포. 다른 그룹은 중간 엽 줄기 세포 9 연골을 포함한 광범위한 애플리케이션에 성공적으로 시스템을 채용 한, 다 능성 줄기 세포 (10)로부터 신경 전구체의 표준화 된 세대는 독성이 간세포 (11)와 도롱뇽 12 척수 재생의 평가에서 분석한다. HT29 세포를 사용하기위한 특정 프로토콜은 다음과 같습니다. <ol><li> DMEM에서 배양 HT29 세포를 T75 플라스크로 시작+ 10 % FBS </li><li> 대기음 성장 플라스크 매체와 트립신 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 품어 </li><li> 성장 배지 3 ㎖를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다. 셀 카운팅 나누어지는을하고 15 ML의 원심 분리기 튜브에 나머지를 전송합니다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. </li><li> 원심 분리가 진행되는 동안, 세포를 센다. </li><li> 대기음 트립신 / 중간 혼합물 위의 계산으로 필요한 세포 밀도에 의해 결정 신선한 성장 매체, 볼륨 교체합니다. </li><li> (선택 사항) 어떤 덩어리를 제거하기 위해 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 참고 : 셀 수확 조건이 줄 사이에 다소 차이가 있습니다. 예는 또한 세포를 계대 대한 해리 프로토콜을 사용할 수있는 경우, 그 출발점으로 사용되어야한다. 트립신의 민감한 세포 라인의 사용으로 과도한 세포의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 이러한 경우에 우리는 대안 dissociati로 TrypLE을 사용하여 좋은 결과를 관찰시약 8. 세포를 분리하는 동안 응집되어 생존을 분실 한 경우, 효소 용액에 DNA 분해 효소를 첨가하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 해리 시간을 줄이고 세포 덩어리를 분쇄하는 분쇄 단계를 사용하면 생존 가능성을 높일 수 있습니다. </li></ol> 3. 회전 타원체의 형성 NOTE : 상체 그러나 초기 실험은 세포 배지 조성을 변화의 결과로부터 3 차원 배양 시스템으로 전환의 결과를 구별하기 위해, 배양 된 배지를 이용하여 수행되어야 매체 제형 다양한 생성 될 수있다. <ol><li> 각 웰 성장 매체의 0.4 ML을 추가합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 회 전자 사전에 원심이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 0.4 ML을 추가합니다(위의 계산)에 필요한 밀도로 세포 현탁액. 조심스럽게 마이크로 웰에 공기 방울을 도입하지 않고, 아래로 피펫 팅에 의해 혼합. 이것은 세포가 균일 일관된 상체를 얻기 위해, 우물에 걸쳐 분산되는 것을 보장하기 위해 중요하다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. 판을 원심 분리하는 동안 자기 수준을하지 않는 경우, 대류 전류는 마이크로 웰을 통해 세포의 편재에 그 결과를 발생할 수 있습니다. 가중치 플레이트 캐리어의 양면에 균일하게 분포되도록 따라서 판은 다른 플레이트에 대하여뿐만 아니라 내부적으로 균형을 이루어야한다. </li></ol> 참고 : 고르지 세포 분포의 기록을 볼 수있는 경우,이 플레이트 캐리어의 피벗 포인트에 윤활의 작은 금액을 적용 할 필요가있다 - 지침은 원심 분리기 제조 업체에 문의하십시오. 참고 : 세포가 마이크로 웰에 원심 분리되고 나면, 그들은 합리적으로 RESIS 있습니다판의 작은 움직임에서 세척하기에 TANT. 매체의 슬로 싱 결과 급격한 운동은 피해야하지만, 현미경 원심 분리기 판 또는 보육의 전송이 중요한 세포의 변위가 발생하지 않아야합니다. <ol start="6"><li> 거꾸로 현미경을 사용하여, 세포가 마이크로 웰 내에 클러스터, 그들이 균일하게 잘 분산되어 있다는 것을 확인합니다. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 배양한다 </li><li> 도립 현미경을 사용하여, 회전 타원체의 형성 과정을 관찰. 일부 세포 라인은 다른 사람들이 더 오래 걸릴 수 있습니다, 24 시간 내 소형 상체를 형성 할 것이다. HT29 세포 집계 클러스터에서의 진행은도 2에 도시된다. </li><li> 마이크로 웰에서 상체를 복구하고 부드럽게 피펫을 분출에 의해 현탁 배양에 전송할 수 있습니다. 대안 적으로, 중간 여분 8 시튜 상체를 유지 - 기간은 초기 크기와 성장 속도에 의존하는 DEF그들은이 형성되는 마이크로 웰을 빨리 성장할 때까지의 시간을 이네. <ol><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물의 가장자리에 상체, 대기음 매체를 잃지 않고 매체를 교체하십시오. 천천히가 메 니스 커스 (meniscus)에서 액체를 그리기 시작 때까지 끝을 가지고, 그리고 인하로 메 니스 커스 (meniscus)을 따릅니다. 그 후 같은 장소에서 잘 벽에 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 몇 상체는 매체가 항상 흡입과 같은 위치에 치환​​ 된 경우에는,이 숫자가 잘 다수에 비해 작은 남아 손실 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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박사 Ungrin 발명가로 AggreWell 기술 금융 관심을 가지고 있습니다.

우리는 균일 한 회전 타원체 많은 수의 서로 다른 소스에서 여러 개의 세포주에서 생성되도록하는 시스템을 구축했다. 우리는이 상태에서 상체를 형성하지 않는 부착 세포주가 발생할 못하고있다. 우리는 이전하지만 현재까지이 문제가 종양 라인을 제기하지 않은, anoikis 5,8하는 경향이 인구의 세포 손실을 관찰했다. 이 시스템은 24 웰과 6 자 형식뿐만 아니라 현재 개발중인 50,000 마이크로 웰을 각각 포함 된 프로토 타입의 생물 반응기에서 마이크로 웰 일관된 행동, 표면적 임의로 확장 성이다. 비대칭 우려 타원체 있으면, 단계 4.8에서 배양 시간은 2-3 일까지 증가 될 수있다. 구 상체는 또한 그러나이 경우 치료가 서로 WI 접촉 상체로서, 충분히 낮은 배양 밀도를 유지하기 위해 취해야, 대칭성을 증가시키는 마이크로 웰로부터 추출 후 기간 동안 배양 될 수있다LL 종종 더 큰 구조로 융합. 이러한 이유로, 우리는 이전에 골재가 일차 제한 타원체의 크기되는, 형성되는 마이크로 웰 내에 배양을 유지하고있다. 이것은 차례로 성장 속도 및 초기 크기 (8)의 함수이며, 마이크로 웰 플레이트 내에서 연장 배양 계획되는 경우, 이것은 사전에 고려되어야한다. 증식을 방지하는 옵션이 발생한다은 작은 상체로 시작하는, 또는 AggreWell 800 판의 큰 마이크로 웰을 사용 하나 있습니다. 상체가 시간이 지남에 일관성이 증가하지 않을 경우, 하나의 잠재적 원인은 세포의 죽음이 될 수있다. 특히 고도의 대사 활성 세포의 큰 집계에 산소와 필수 영양소의 전달에 대량 전송 제한이 괴사 코어 2 발생할 수 있습니다 - 따라서 비 응집 ​​된 구형은 단순히 과도한 세포 죽음의 결과 일 수있다. 대안으로, 기계적 COHE 잼상체의 시온은 주어진 셀 라인 (13)의 전이 가능성의 관계에서, 세포 간 결합력을 평가하는 데 사용되었습니다. 이는 아마도 이러한 면적비 진원도 및 경계로 형태 학적 파라미터를 사용하여, 회전 타원체 형상 및 전이성 전위 사이의 관계를 조사하기 위해 흥미로울 것이다. 상체의 기계적 및 형태 학적 특성을 조사하는 것 외에도, 마이크로 웰 시스템 어셈블리는 여러 세포 유형 및 / 또는 6,7 생체 재료의 조합으로 이루어지는 혼합 조성물 상체의 대규모 생산을 허용한다. 다른 세포 유형의 종양 세포의 상호 작용에 따라서는 예를 들어, 섬유 아세포 및 내피 세포와 함께 종양 세포에서 상체를 생성하는 데 관심이있을 수 있으며, 더 자세히 생체 (14)에서 종양의 동작을 모델링하는 것이 중요하다. 각종 생체 물질의 미립자도 혼입 될 수 있고, SPH 영향을 미칠 수있다직접 세포 7,15, 또한 회전 타원체 (16)의 내부로 성장 인자 및 사이토 카인의 방출 제어를위한 저수지로와의 상호 작용을 통해 모두 eroid 속성. 불임에 대한 우려가있는 경우 이전 실험의 일환으로 인큐베이터에 약간의 시간을 보냈습니다 수있는 몇 가지 우물이 이전에 사용되어있는 마이크로 웰 플레이트, 작업을 할 때, 예를 들어, 우물 70 % 에탄올로 resterilized 할 수있다 물. 상체가 형성되고 나면, 이들은 또한 셀 스트레이너 위에 현탁액을 통과시켜 잔류 비법 세포로부터 분리 될 수있다. 상체가 유지됩니다 동안 개별 세포를 통해 전달합니다. 구형이 배양 과정 동안 잠재적 전이성 세포를 흘리는 것으로 의심되는 경우,이 절차를 여러 번 수행하는 것이 바람직 할 수있다 - 처음 비법 세포를 제거하고,이어서 purifie을 격리세포의 D 인구는 상체으로 해제가 없습니다.

종양 세포가 더 생리 학적으로 관련 시스템 1로 전환하면 기존의 조직 문화 플랫폼에서 확인 된 치료제가 효능을 잃을 수 있다는 것을 그들이 때 플라스틱 배양보다 입체 문화에서 다르게 행동하고, 증거의 증가 몸이있다. 그것은 모두 그들의 내부 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해, 이러한 조건 하에서 암 세포의 거동을 연구하기 위해, 또한 병원에 검사 시설에서 새로운 치료제를 전환의 성공률을 증가시키는 것이 바람직하다. 긴 역사를 가진 하나의 유용한 모델 시스템은 종양 상체 1,2로 알려진 암 세포의 3 차원 클러스터를 사용합니다. 이상적으로, 구형 형성 기술은 크기와 구성 실험자에 의해 제어되는 균일 한 상체의 큰 숫자의 생산을 허용하는 것입니다. 매달려 드롭 잘 플레이트에 접근하는 동안 3,4이 다시 중 일부를 수행 할 수 있습니다요건, 처리는 일반적으로 제한되며, 상체 많은 수의 생성은 노동 집약적 인 작업이됩니다. 우리는 최근에 재생 의학 분야 5 유사한 문제를 해결할 수있는 시스템을 개발했습니다. (도 1 참조) 밀집 마이크론 스케일 웰 시리즈 내의 강제 응집을 이용하는이 방법은 여러 종류의 세포 (6)의 혼합물뿐만 아니라 다양한 생체 물질 (7)의 혼입을 포함한 세포의 임의의 번호로부터 상체의 생성을 허용한다. 수천 이상 수백 수천 - - 상체가 다수 형성되어 즉시 추출하거나 두 (미발표 관찰) 주 적어도 하나 08 배지 교환에 형성되는 마이크로 웰에서 유지 될 수있다. 이 시스템은 따라서 잘 EFFE의 평가를 위해 균일 한 많은 수의 재생 가능한 종양 상체의 생성에 적합새로운 항 종양 제 또는 기본적인 생물학적 조사 ctiveness.

<table><tbody><tr><td>AggreWell 400 plate</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>Rinsing Solution</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (37 &lt;span id=&quot;docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604&quot; style=&quot;font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;&amp;micro;m&lt;/span&gt;)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>VWR / Motic</td><td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

종양 상체 점점 입체적으로 종양 세포의 거동에 대한 중요한 시험 관내 모델로서 인식된다. 더 생리학 관련 기존 접착 시트의 문화에 비해, 그들은 더 정확하게 복잡성과 실제 종양에 존재하는 상호 작용을 요점을 되풀이하다. 나은 종양 생물학, 또는 신규 치료제의 효능을 평가하기 위하여,이 모델을 활용하기 위해서는, 제어 된 방식과 상당수에서 재현성 상체를 생성 할 수있을 것이 필요하다. AggreWell 시스템은 단일 세포 현탁액을 원심으로하는 피라미드 형 마이크​​로 웰의 고밀도 배열로 구성된다. 세포의 숫자는 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터링 및 관련된 뚜렷한 세포 유형의 수와의 비율은 실험에 의해 도입 현탁액의 속성에만 의존한다. 따라서, 우리는 함께 임의의 크기와 구성의 종양 상체를 생성 할 수 있습니다기본 플랫폼 기술을 수정할 필요가 부족합니다. 차례 문화 면적의 제곱 센티미터 당 마이크로 웰의 수백 매우 높은 생산 수준이 간단, nonlabor 많이 사용하는 프로세스를 통해 달성 될 수 있다는 것을 확인합니다. 따라서 우리는이 프로토콜은 종양 구형 분야의 연구자에 크게 도움이 될 것으로 기대합니다.

: 서로 다른 해부학 적 기원의 여러 종양 라인에서 상체를 쉽게 생성 및 현탁 배양으로 추출 할 수있다. 3 각 조건에서 매우 균일 한 구형의 인구가이 방법을 통해 얻을 수있는 일관성있는 크기의 컨트롤을 보여줍니다 그림. 된 LNCaP 전립선 암 세포는 불규칙한 경계를 덜 일관된 상체에 상승했다 동안 행동의 명확한 라인 사이의 차이 (가능한 이유에 대한 설명을 참조, 선명하게 정의 경계 밀집 상체를 형성 HT29 대장 암 세포와 TE6 식도암 세포로도 볼 수 있습니다 ). 더 일관된 집계에 강한 내부의 힘은 동안에도 여전히이 형성되는 마이크로 웰의 더 대칭 형태로, 특히 큰 사이즈로 된 LNCaP 집계, 눈에 띄게의 사각 피라미드 형상을 유지하는 반면에 붕괴의 결과 마이크로 웰. 입력 셀 번호와 매가 간의 관계<html> 그 결과 회전 타원체의 iCal의 크기는 변수의 수에 따라 달라집니다. 셀당 부피와 사용하는 셀의 수의 곱에 기초하여 이론적 볼륨 차례로 인해 단일 ​​세포 현탁액 단계에서 세포의 손실뿐만 아니라, 지나치게 작은 골재 손실을 포함 할 수있다 세포 손실에 의해 감소​​ 될 수있다 부족한 이웃의 숫자 및 핵심 기술의 제약으로 괴사 수송에 의한 과대 집계에서. 크기는 또한 응집 공정 중에 발생할 수있는 확산에 의해 영향을받을 것이다. 이러한 매개 변수는 세포주에서 세포 라인에 달라집니다대로, 특정한 물리적 차원의 상체가 필요한 경우는 소개하는 세포의 정확한 숫자는 실험적으로 결정해야합니다. 세포 수의 13 배 증가가 구형 직경의 두배 초래한다 예 - 제 근사치로서 구형 직경 혼입 세포 수의 세제곱근으로 증가 할 것으로 예상된다. <html> &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;_content 항상 &quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> 그림 1. 구형 제품의 개략도. 마이크로 웰 시스템은 세포를 원심 분리 될 수있는에 단단히 포장 사각 피라미드 마이크로 웰의 배열 (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ M 사이즈 cm 2 당 625)로 구성되어 있습니다. 세포는 경 사진 측벽들에 의해 소집하고, 얻어진 구형의 크기는 사용 된 세포 현탁액의 농도를 변화시킴으로써 제어된다. 50665fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 상체에 클러스터 세포의 조립. 상체는 칠백 HT29 세포 각각에서 형성되었다. 즉시 원심 분리 한 후 (A), 세포를 느슨하게 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터됩니다. 클러스터가 균일이 경우 오른쪽으로 오프셋합니다. 이 클러스터 크기 배열에 걸쳐 일관성을 유지 제공 허용됩니다. 중요한 클러스터 크기의 차이가 다른 배열의 한 측면에서 본 경우, 단계 3.5의 참고를 참조하십시오. 24 시간 (B) 배양 한 후, 세포 간 접착 힘은 클러스터가 다음 추출 될 수있다 일관된 상체, (C)을 집계하고 형성하는 원인이있다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> R /&gt; 그림 3. 마이크로 웰 플레이트에서 발생 상체는. 구 상체를 형성 하였다 칠백 (A, C, E) 또는 천오백 (B, D, F) HT29 결장 암 세포 (A, B), 된 LNCaP 전립선 암 세포 (C, D) 또는 TE6 식도암 세포 (E, F). 더 밀집 HT29 및 TE6 세포에 비해 특히 느슨한 된 LNCaP 응집체 - 제제 내의 구 상체의 일관성, 또한 세포주 간의 편차를 참고. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> 마이크로 웰 형식 </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell (400) </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 폭 (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> (400) </td><td> (400) </td><td> 800 </td></tr><tr><td> cm 2 당 마이크로 웰 </td><td> (625) </td><td> (625) </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> 물론 당 마이크로 웰 </td><td> 1200 </td><td> 4,700 </td><td> (300) </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최대 셀 * </td><td> 2,000 </td><td> 2,000 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> 물론 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> 물론 당 최대 셀 * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70 % 에탄올의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - 세척 용액의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - 예압 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - 셀 로딩 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> 이 값이 사용되는 특정 셀의 크기로 다양하며, 경험적으로 결정되어야한다 *로서 마이크로 웰 당 세포의 숫자는 단지 근사치 </td></tr></tbody></table> 표 1. AggreWell 옵션 및 프로토콜 수정.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.4K 조회수.  University of Calgary.  우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다. 

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

생체공학

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

생화학

PEG 하이드로겔에서 종양 스페로이드의 3D 캡슐화 후

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth. Here, we designed an in vitro 3D glioblastoma model for spheroid encapsulation to mimic the tumor extracellular microenvironment. First, we formed square pyramidal microwell molds using polydimethylsiloxane. These microwell molds were then used to fabricate tumor spheroids with tightly controlled sizes from 50-500 &#956;m. Once spheroids were formed, they were harvested and encapsulated in polyethylene glycol (PEG)-based hydrogels. PEG hydrogels are a versatile platform for spheroid encapsulation, as hydrogel properties such as stiffness, degradability, and cell adhesiveness can be tuned independently. Here, we used a representative soft (~8 kPa) hydrogel to encapsulate glioblastoma spheroids. Finally, a method to stain and image spheroids was developed to obtain high-quality images via confocal microscopy. Due to the dense spheroid core and relatively sparse periphery, imaging can be difficult, but using a clearing solution and confocal optical sectioning helps alleviate these imaging difficulties. In summary, we show a method to fabricate uniform spheroids, encapsulate them in PEG hydrogels and perform confocal microscopy on the encapsulated spheroids to study spheroid growth and various cell-matrix interactions.

저자 스포트라이트: 교모세포종 미세환경 연구를 위한 체외 하이드로겔 모델

Here, we present a protocol that enables fast, robust, and cheap fabrication of tumor spheroids followed by hydrogel encapsulation. It is widely applicable as it does not require specialized equipment. It would be particularly useful for exploring spheroid-matrix interactions and building in vitro tissue physiology or pathology models.

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마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

스페로이드-매트릭스 상호 작용 연구를 위한 폴리에틸렌 글리콜 하이드로겔의 종양 스페로이드 제조 및 캡슐화