우리의 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델의 생성을 설명하기 때문에 중요하며, 이 모델은 세포주보다 실제 종양 생물학을 더 잘 나타냅니다. 이 접근법은 다양한 고형 종양에 적용 할 수 있습니다. 또한 일반적인 세포 생물학 실험실에서 처음부터 끝까지 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다.
이 접근법을 사용하여 생성된 3D 종양 모델은 항암 요법 또는 요법의 조합에 대한 종양의 민감도 및 내성에 대한 연구를 지원합니다. 이 접근 방식은 원발성 암세포에서 3D 모델을 생성합니다. 따라서 특정 환자에게 어떤 치료법이 효과적인지 식별하여 치료를 개인화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Ella Itzhaki가 될 것입니다. 먼저, 단일 세포 부착성 1차 세포 배양이 있는 작은 T25 플라스크를 취하여 세포 배양 배지를 제거합니다. 세포를 PBS로 세척하고, 섭씨 37도에서 3분 동안 1x Accutase 1밀리리터를 첨가하여 75 내지 100% 합류의 부착성 원발성 종양 세포 배양액의 단세포 현탁액을 제조한다.
5 밀리리터의 세포 배양 배지를 첨가하여 Accutase 용액을 중화시킨다. 10 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 세포를 흡인하고 15 밀리리터 원추형 튜브에 증착합니다. 튜브를 800g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
세포 배양 배지를 제거하고 세포 펠릿 위에 8밀리리터의 신선한 세포 배양 배지를 추가한 다음 부드럽게 혼합합니다. 혈구계로 생존 가능한 세포를 계산하려면 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 취하여 50 마이크로 리터의 트리판 블루와 혼합하십시오. 그런 다음 살아있는 세포를 세고 현탁액에 있는 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.
다음으로, 3D 배양 배지를 준비한다. 그리고 분석에 필요한 세포 수와 필요한 총 부피를 계산한 후 200마이크로리터의 3D 배양 배지에서 원하는 수의 세포로 세포 현탁액을 준비합니다. 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫과 부드럽게 혼합하십시오.
현탁액을 피펫팅 저장소로 옮기고, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 다중-채널 피펫을 갖는 초저 부착 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 300g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세포의 클러스터링을 시행하여 세포 응집을 개선하고, 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 다시 300g에서 상온에서 10분간 원심분리한 후 배지의 50%를 부드럽게 제거하여 버리고 100마이크로리터의 신선한 3D 배양액을 첨가하여 기존 용액을 교체합니다.
이 단계를 반복하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다. 스페로이드 형성을 모니터링하기 위해 1-2일마다 현미경으로 세포를 검사합니다. 이미징 소프트웨어의 스케일 도구를 사용하여 형성된 스페로이드의 직경을 측정합니다.
그리고 스페로이드 직경이 100 내지 200 마이크로미터에 도달하면, 약물 효능 실험을 수행한다. 스페로이드 수집의 경우 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 각 웰에서 스페로이드를 수집하고 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 증착합니다. 원뿔형 튜브를 300g에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 피펫을 이용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하여 버린다.
세포 배양 배지 0.5 밀리리터를 첨가하고 펠렛을 잘 그러나 부드럽게 재현탁하십시오. 스페로이드 계수를 수행하려면 96웰 플레이트를 사용하고 웰 밑면에 더하기 기호를 그려 웰을 사분면으로 나눕니다. 50 마이크로 리터의 현탁액을 우물에 첨가하십시오.
그리고 10x 대물 렌즈를 사용하여 현미경으로 수동으로 스페로이드를 계수합니다. 각 사분면의 스페로이드를 세고 웰에 있는 총 스페로이드 수를 계산합니다. 그런 다음 부피를 계산하여 스페로이드 수를 두 배로 늘려 스페로이드 농도를 계산하고 현탁액의 총 스페로이드 수를 계산합니다.
새 튜브에서 세포 배양 배지 200마이크로리터당 스페로이드 200개 농도의 스페로이드 현탁액을 준비합니다. 각 약물 처리에 대해 다른 튜브에 스페로이드 스톡을 준비하십시오. 반복에 필요한 웰 수로 각 약물에 필요한 총량을 계산하고 필요한 최종 농도까지 튜브에 약물을 추가합니다.
200 마이크로리터의 스페로이드 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 웰로 옮기고, 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 스페로이드를 연구 약물과 함께 24 내지 72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 300g에서 원심분리하고, 170 마이크로리터의 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 웰의 바닥에 30 마이크로리터를 남겼다. MTT 용액을 준비하고, 70 마이크로리터의 용액을 각 웰에 웰 당 100 마이크로리터의 최종 부피에 첨가한다.
우물의 최종 MTT 농도는 100 마이크로 리터 당 0.05 밀리그램입니다. 또한 세포가없는 MTT 용액으로 빈 웰을 준비하십시오. 웰 내 용액의 색상 변화가 관찰 될 때까지 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 3-4 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
변화가 관찰되면 각 웰에 100 마이크로 리터의 정지 용액을 넣고 기포를 생성하지 않고 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 파라미터 ELISA 판독기에서 570 나노미터의 파장 및 630 내지 690 나노미터의 배경 파장에서 플레이트의 흡광도를 판독한다. 세포 생존율을 계산하려면 각 웰에 대한 특정 신호를 계산하십시오.
그런 다음 빈 웰의 평균값을 계산하고 각 웰에서이 값을 뺍니다. 연구 약물로 처리되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰에서 특정 신호의 평균을 계산합니다. 마지막으로, 처리되지 않은 세포가 있는 웰에 대한 각 웰의 세포 생존율을 계산합니다.
초기 시딩된 세포의 수에 의한 시간 경과에 따른 원발성 결장암 세포 배양으로부터의 스페로이드의 형성이 여기에 표시됩니다. 이 그림에서 생성된 스페로이드의 수는 각 웰에 처음 파종된 세포의 수에 따라 달라진다는 것을 알 수 있습니다. 웰 당 2, 000의 초기 세포 파종으로 배양 10 일 후 원발성 결장암 세포로부터의 스페로이드가 여기에 표시됩니다.
결장암 스페로이드의 장기간 배양에 따라, 그들은 서로 부착되기 시작했고 균질한 배양을 방해하는 스페로이드와 포도 같은 구조의 클러스터를 형성하여 MTT 분석에서 스페로이드의 사용을 금지했습니다. 결장암과 유방암을 포함한 원발성 종양 세포의 스페로이드에 대한 palbociclib, sunitinib 및 이들의 조합의 효과가 여기에 나와 있습니다. 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드에 대해 MTT 분석을 수행했습니다.
MTT 신호는 DMSO 처리된 세포로부터의 값으로 표준화되었다. 이 값은 4번에서 8번까지의 반복실험의 평균을 나타냅니다. 세포 성장에 대한 다양한 처리의 효과는 또한 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드의 치료 0일째와 3일 후에 현미경으로 평가되었습니다.
트라스투주맙과 비노렐빈 및 5 플루오로우라실과 시스플라틴이 시간 경과에 따른 유방암 유래 스페로이드에 미치는 영향이 이 그림에 나와 있습니다. 치료 기간에 따른 0일째에 대한 스페로이드 직경의 변화가 여기에 표시됩니다. 각 처리 그룹은 각 웰에 하나의 스페로이드가 있는 4 내지 6개의 웰을 포함하였다.
평균 변경 사항이 여기에 표시됩니다. 스페로이드는 항암 치료에 대한 반응을 넘어 많은 연구에서 중요한 도구입니다. 이러한 연구는 예를 들어 약물 전달 및 세포-세포 상호 작용과 같은 기본적인 생물학 질문까지 다룹니다.
단일 세포 현탁액으로 스페로이드 생성 공정을 시작하는 것이 중요합니다. 또한 5%basic membrane metrics를 포함하는 매체와 함께 초저 부착 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다.
