עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת קלגרי, במסגרת מענק חוקר חדש הזנק לד&quot;ר Ungrin.

הערה: צלחות microwell זמינות בפורמטים שונים, בהתאם לתוצאות הרצויות. מפרט כמו גם הנחיות משוערת למספרי המינימום ומקסימום של תאים שיש להשתמש בכל תבנית מוצגים בטבלה 1. Microwells הקטן יותר להתחדד לנקודה חדה, ולכן אין מגבלת גודל נמוכה יותר, אם כי שונה בין הספרואידים הופך להיות יותר משמעותי בגדלים קטנים יותר. ייצור שיגרתי של הספרואידים מממוצע קטן כמו 20 תאים כל אחד הוא 8 פשוטים. גודל microwell הגדול אינו מחודד באופן מלא, ולכן מנסה ליצור הספרואידים ממספר קטן של תאים עלולים לגרום להספרואידים קטנים מרובים בכל microwell. בשל הבדלים קלים במאפייני שטח, הכנה עם הפתרון פעילי שטח (שלב 1.2) היא לא אופציונלית בעת שימוש בצלחות AggreWell 400Ex. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש ב400 צלחות AggreWell - לחסרונות פורמטים אחריםלוח ult 1. מספר התאים להיות טעונים בכל טוב נקבע על ידי הכפלת מספר microwells הוא מכיל במספר התאים שהתקבצו לכל אליפטית. לדוגמה, כדי ליצור הספרואידים מ1000 תאים כל אחד, כל אחד גם חייב להיות עמוס (1,200 הספרואידים פעמים 1,000 תאים כל אחד =) 1.2 x 10 6 תאים. צפיפות תאים חייבת להיות מחושבת בהתחשב בכך שיהיו טעונים התאים בנפח של 0.4 מיליליטר. אז עבור הדוגמא של הספרואידים נוצרו מ1000 תאים כל אחד, 1.2 x 10 6 תאים ב0.4 מיליליטר מתרגם את צפיפות של 3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. 1. Microwells הכנה לקבלת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות microwell הן סטרילי, כפי שנקבע, ויש להסירם רק מהאריזה שלהם בסביבת סטרילית, כגון ארון מינרית זרימת בטיחות ביולוגי. עקרות צריכה להישמר לאורך כל הפרוטוקול. צריכים עקרות להיות בסכנה, בארות resterilized באמצעות 70% אתנול במים באמצעותביצוע שלבים אופציונליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של אתנול 70% לכל טוב שאינו בשימוש. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד אדי אתנול צריכים לחדור במהירות כל בועות, אם יש מספרים גדולים זה עשוי להיות רצוי כדי להסיר אותם. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 2,000 x גרם. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות עם המכסה על בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב אתנול. צלחת החברה ניתן לשטוף עם מים סטריליים או PBS לשימוש מיידי, או אוויר יבש לאחסון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח שתאים אינם אינטראקציה עם פני השטח microwell, זה עשוי להיות מוכן באמצעות פעילי שטח. באופן כללי זהמומלץ לבצע שלב זה בתחילה, ולאחר מכן להשוות הספרואידים שנוצרו עם ובלי microwells מצופה פעילי שטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של שטיפת פתרון היטב כל אחד. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של לפחות חצי שעה עם המכסה על בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. צלחות עשויות להיות מאוחסנות בארבע מעלות עם הפתרון פעילי שטח בבארות עד צורך אם אטום כראוי כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחת עם מים סטריליים או PBS לפני מייד לשימוש. אל תאפשר צלחותלהתייבש לאחר ציפוי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת תאים הערה: הפרטים של הכנת תא ישתנו במקצת עם נחקר סוג תא המסוים. עם זאת יש לנו ציינו בתנאים אלה על מנת להיות יעילים עם מגוון רחב של תאים, כוללים הקווים שנדונו כאן, כמו גם בתאי גזע עובריים אנושיים ועכבריים (ESC), תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC), fibroblasts, האנדודרם פרימיטיווי משוער, ותאי סטרומה. קבוצות אחרות יש מועסקים במערכת זו בהצלחה עבור מגוון רחב של יישומים, כולל chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal 9, דור הסטנדרטי של מבשרים עצביים מתאי גזע pluripotent 10, טוקסיקולוגי מנתח בhepatocytes 11 והערכה של התחדשות בחוט השדרה בסלמנדרות 12. הפרוטוקול הספציפי לעבודה עם תאי HT29 מוצג כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם בקבוק T75 של תאי HT29, בתרבית DMEM+ 10% FBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני צמיחה מבקבוק, ולהוסיף 3 מיליליטר של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים למשך 5 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול טריפסין על ידי הוספת 3 מיליליטר של מדיום גידול. קח aliquot לספירת תאים ולהעביר את השארית לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צנטריפוגה היא בהתקדמות, לספור תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין לשאוב / תערובת בינונית ולהחליף עם מדיום גידול טרי, נקבע על פי נפח צפיפות התאים הנדרש כפי שמחושב לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת על מנת להסיר כל גושים. הערה: תנאי קצירה נייד ישתנו מעט בין השורות. אם פרוטוקול דיסוציאציה לדוגמא passaging התאים של עניין זמין, שאמור לשמש כנקודת התחלה. עם שימוש בשורות תאים רגישים של טריפסין עלול לגרום למוות של תאים מופרזים. במקרים אלה יש לנו ציינו תוצאות טובות באמצעות TrypLE כdissociati אלטרנטיביעל מגיב 8. אם התאים הופכים בכבדים במהלך ניתוק ולאבד את יכולת הקיום, תוספת של DNAse לפתרון האנזים עשויה לפתור בעיה זו. צמצום זמני ניתוק והעסקת צעד טחינה דקה כדי לשבור את גושי תא יכול גם להגביר את הכדאיות. </li></ol> 3. כינונה אליפטית הערה: spheroids עלול להיווצר במגוון של ניסוחים בינוניים, צריכים להתבצע ניסויים ראשוניים זאת תוך שימוש במדיום שבו התאים בתרבית, כדי להבדיל את ההשלכות של מעבר למערכת תרבות 3 ממדים מהשלכות של שינוי הרכב בינוני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.4 מיליליטר של מדיום גידול היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו לפני צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.4 מיליליטרהשעיה תא בצפיפות הנדרשת (מחושב לעיל). לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, ללא החדרת בועות אוויר אל תוך microwells. זה חשוב כדי להבטיח שהתאים מתחלקים באופן שווה לאורך כל טוב, על מנת לקבל הספרואידים עקביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. אם הצלחת לא ברמה עצמית במהלך צנטריפוגה, זרמי הסעה עלולים להתעורר תוצאה שבחלוקה לא שווה של תאים על פני microwells. לכן, הצלחת צריכה להיות מאוזנת באופן פנימי, כמו גם על הצלחת אחרת, כך שהמשקל מחולק באופן שווה על שני הצדדים של ספק הצלחת. </li></ol> שים לב: אם ראיות של חלוקת תא אחידה נראית, זה עשוי להיות נחוץ כדי להחיל כמות קטנה של שימון לנקודות הציר בספק צלחת - להתייעץ עם יצרן צנטריפוגות לקבלת הוראות. הערה: ברגע שהתאים כבר centrifuged לmicrowells, הם מתנ סבירtant לכביסה מ תנועות קלות של הצלחת. יש להימנע מתנועות פתאומיות שתגרומנה ניפוצים בינוניים, אבל ההעברה של הצלחת מצנטריפוגות למיקרוסקופ או חממה לא צריכה לגרום לתזוזה של תאים משמעותיים. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ודא כי תאים שהתקבצו בתוך microwells, ושהם מחולקים באופן שווה על פני הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לצפות בתהליך של היווצרות אליפטית. שורות תאים מסוימות יהוו הספרואידים קומפקטיים בתוך 24 שעות, אחרים עשויים להימשך זמן רב יותר. ההתקדמות מאשכול כדי לצבור בתאי HT29 מוצגת באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר הספרואידים מmicrowells ולהעביר לתרבות השעיה בעדינות על ידי jetting אותם עם טפטפת. לחלופין, לשמור הספרואידים באתרו עם החלפה בינונית 8 - משך הזמן תלוי בגודלם הראשוני ושיעור צמיחה, אשר define הזמן עד שהם מתגברים על microwells שבו הם נוצרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להחליף בינוני מבלי לאבד הספרואידים, בינוניים לשאוב בקצה של באר בעזרת פיפטה פסטר. לאט לאט מביא את הקצה למטה עד שהוא מתחיל לצייר נוזל מהמניסקוס, ובצע את המניסקוס למטה כפי שהוא יורד. לאחר מכן להוסיף בינוני טרי על הקיר גם באותו המקום. כמה הספרואידים עלולים ללכת לאיבוד, אך אם מדיום הוא תמיד נשאף, והוחלף באותה התנוחה, את המספר הזה יישאר קטן בהשוואה למספרים הגדולים בבאר. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

ד&quot;ר Ungrin אינטרס כלכלי בטכנולוגיה AggreWell כממציא.

הקמנו מערכת לפי מספר גדול של הספרואידים אחידים עלול להיווצר משורות תאים מרובות ממקורות שונים. יש לנו עדיין להיתקל בשורת תאים חסיד שאינו יוצר spheroids בתנאים אלה. יש לנו שנצפו קודם לכן אובדן תא באוכלוסיות מועדות לanoikis 5,8, עם זאת לתאריך הנפקה זו לא התעוררה עם קווי גידול. המערכת היא באופן שרירותי ניתן להרחבה עם שטח פנים, עם התנהגות עקבית על פני microwells ב24 גם בפורמט 6 היטב, כמו גם ביוריאקטורים אב טיפוס המכילים 50,000 microwells כל כיום בפיתוח. צריך אליפטית אסימטריה להיות דאגה, זמן הדגירה בשלב 4.8 ניתן להעלות את שניים או שלושה ימים. Spheroids יכול להיות גם טופח במשך התקופה שלאחר חילוץ מmicrowells להגדיל את הסימטריה, אך במקרה זה יש להקפיד כדי לשמור על צפיפות התרבות נמוכה מספיק, כהספרואידים במגע עם אחד wi אחרll לעתים קרובות למזג לתוך מבנים גדולים יותר. מסיבה זו, יש לנו לשמור בעבר תרבויות בתוך microwells בי המצרפים נוצרו, עם המגבלה העיקרית להיות בגודל של אליפטית. זה בתורו הוא פונקציה של שיעור צמיחה והן בגודל ההתחלתי 8, ואם התרבות המורחבת בתוך צלחת microwell מתוכננת, זה צריך להיחשב מראש. אפשרויות כדי למנוע צמיחת יתר, אם יתרחשו, כוללות מתחילות גם עם הספרואידים קטנים יותר, או העסקת microwells הגדול יותר של צלחת AggreWell 800. צריכים הספרואידים מצליחים להגדיל בעקביות לאורך זמן, סיבה אחת אפשרית עשויה להיות מוות של תאים. במיוחד באגרגטים גדולים יותר של תאים מאוד פעילים מטבולית, מגבלות תחבורה המוניות באספקת חמצן וחומרים מזינים חיוניים יכולות לגרום לליבת נימקי 2 - כך אליפטית שאינו מגובש עשוי להיות פשוט תוצאה של מות תאים מופרז. לחלופין, מדידות של cohe המכנישיאון של הספרואידים כבר שימש להערכת כוחות המחייבים בין תאית, במערכת יחסים לפוטנציאל גרורתי של קו תא נתון 13. יהיה מעניין לחקור את הקשר בין צורה אליפטית ופוטנציאל גרורתי, אולי באמצעות פרמטרים morphometric כגון עגלגלות והיקפית ליחס אזור. בנוסף חוקר את התכונות מכאניות וmorphometric של הספרואידים, הרכבה במערכת microwell מאפשרת ייצור בקנה מידה גדולה של הספרואידים מעורב הרכב, בהיקף של שילובים של סוגי תאים מרובים ו / או חומרים ביולוגיים 6,7. האינטראקציות של תאים סרטניים עם תאים מסוגים אחרים הן חשובות למודל באופן הדוק יותר את התנהגותם של גידולי in vivo 14, ובכך שהוא עשוי להיות עניין של ליצור הספרואידים מתאי גידול בשילוב עם fibroblasts ותאי האנדותל, למשל. Microparticles של חומרים ביולוגיים שונים עלול גם להיות משולב, והוא יכול להשפיע SPHמאפייני eroid הן ישירות דרך האינטראקציות שלהם עם תאים 7,15, וגם כמאגרים לשחרור המבוקר של גורמי גדילה וציטוקינים לתוך הפנים של 16 אליפטית. אם יש חשש לעקרות, לדוגמא כאשר עובדים עם צלחת microwell שבעבר השתמשו בכמה בארות, שייתכן שבילתה קצת זמן בחממה כחלק מניסוי קודם, הבארות ניתן resterilized עם אתנול 70% במים. ברגע שהספרואידים נוצרו, הם יכולים גם להיות מופרדים מהתאים מאוגדים השיורי על ידי העברת ההשעיה מעל מסננת תא. תאים בודדים יעברו, ואילו הספרואידים יישמרו. אם אליפטית חשודה בשפיכת תאי פוטנציאל גרורתי במהלך התרבות, זה עשוי להיות רצוי לבצע פעולה זו מספר פעמים - תחילה להסרת תאים מאוגדים, ולאחר מכן לבודד purifieאוכלוסיות ד של התאים ניתנו הנחה על ידי הספרואידים.

יש גוף גדל והולך של ראיות לכך שתאי גידול מתנהגים בצורה שונה בשלוש תרבויות ממדים ממה שהם עושים כאשר בתרבית על פלסטיק, וכי סוכנים טיפוליים זוהו על פלטפורמות רקמות תרבות קונבנציונליות עלולים לאבד את היעילות כאשר עברו למערכת יותר מבחינה פיזיולוגית רלוונטית 1. לכן זה רצוי ללמוד את התנהגותם של תאים סרטניים בתנאים אלה, הן להשיג תובנות הביולוגיה הבסיסית שלהם, וגם כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של מעבר סוכנים טיפוליים חדשים ממתקן ההקרנה למרפאת. מערכת מודל שימושית אחד עם היסטוריה ארוכה מעסיקה אשכולות תלת ממדיים של תאים סרטניים המכונים הספרואידים גידול 1,2. באופן אידיאלי, טכניקות להיווצרות אליפטית תאפשר ייצור של מספר הגדול של הספרואידים אחידים בגודל ובהרכב נשלטים על ידי הנסיין. בעוד התלייה שחרר וגם צלחת גישות 3,4 מסוגל למלא את חלק מחדש אלהquirements, תפוקה מוגבלת בדרך כלל, ודור של מספר הגדול של הספרואידים הופכים משימה עתירת עבודה. יש לנו לאחרונה פיתחו מערכת כדי לפתור אתגרים דומים בתחום רפואת רגנרטיבית 5. העסקת צבירת כפייה בסדרה של בארות מיקרון בקנה מידה צפופות (ראה איור 1), גישה זו מאפשרת את הדור של הספרואידים ממספרים שרירותיים של תאים, כוללים תערובות של סוגי תאים מרובים 6, כמו גם שילוב של חומרים ביולוגיים שונים 7. Spheroids נוצרים במספרים גדולים - אלפי למאות אלפים או יותר - ויכול להיות מופק באופן מיידי או נשמר בmicrowells שבו הם נוצרו עם חילופי בינוניים לאחת לפחות 8 שבועיים (תצפית לא פורסם). מערכת זו ולכן גם מתאימה לדור של מספרים גדולים של מדים והספרואידים גידול לשעתק להערכת effectiveness של סוכנים נגד גידולי רומן או חקירות ביולוגיות בסיסיות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

הספרואידים גידול מוכרים יותר ויותר כמודל חשוב במבחנה להתנהגותם של תאים סרטניים בשלושה ממדים. יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תרבויות חסיד גיליון קונבנציונליים, הם בצורה מדויקת יותר לסכם את המורכבות ואת האינטראקציות בהווה בגידולים אמיתיים. כדי לרתום את המודל הזה כדי להעריך את הביולוגיה של גידול, או את היעילות של סוכנים טיפוליים חדשניים טוב יותר, יש צורך להיות מסוגל לייצר הספרואידים reproducibly, באופן מבוקר ובמספרים משמעותיים. מערכת AggreWell מורכבת ממערך צפיפות גבוהה של microwells בצורת הפירמידה, שלתוכו השעיה של תאים בודדים היא centrifuged. מספרם של תאים באשכולות שבתחתית של כל microwell, ואת המספר והיחס בין סוגי תאים שונים המעורבים תלוי רק במאפיינים של ההשעיה הוצגה על ידי הנסיין. לפיכך, אנו מסוגלים לייצר הספרואידים גידול של גודל שרירותי וקומפוזיציה אצלמתוך צורך לשנות את הפלטפורמה טכנולוגית הבסיסית. מאות microwells לסנטימטר רבוע של שטח פן התרבות בתורו להבטיח כי רמות ייצור גבוהות מאוד עשויות להיות מושגת באמצעות תהליך פשוט, nonlabor אינטנסיבי. לכן אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה באופן רחב שימושי לחוקרים בתחום אליפטית הגידול.

Spheroids מהקווים גידול מרובים של מקורות אנטומיים שונים זו עשוי בקלות להיות שנוצר ומופק בתרבות השעיה. איור 3 ממחיש את השליטה העקבית גודל בר השגה באמצעות שיטה זו, עם אוכלוסיות אליפטית אחידות מאוד בכל תנאי. הבדלים בין קו ברורים בהתנהגות הם גם נראים, בתאי סרטן המעי הגס HT29 ותאי סרטן הוושט TE6 להרכיב הספרואידים צפופים עם גבולות ברורים וחדים, ואילו תאי סרטן ערמונית LNCaP הולידו הספרואידים פחות קוהרנטית עם גבולות לא סדירים (ראה דיון לסיבות אפשריות ). הכוחות הפנימיים חזקים באגרגטים קוהרנטית יותר, הביאה גם לקריסת צורה סימטרית יותר אפילו בעודו בmicrowells שבו הם נוצרו, ואילו אגרגטים LNCaP, במיוחד בגודל הגדול יותר, בעליל לשמר את הגיאומטריה מרובעת פירמידה של microwells. הקשר בין מספרי תא קלט והחינוך הגופניים<html> גודל iCal של אליפטית וכתוצאה מכך יהיה תלוי במספר משתנה. כרכים תיאורטי המבוססים על המוצר של הנפח לכל תא ואת מספר התאים המועסקים עשויים להיות מופחתים על ידי אובדן תא, אשר בתורו עשוי לכלול אובדן של תאים בשלב ההשעיה התא בודד, כמו גם הפסד מאגרגטים יתר על המידה קטנים בשל מספרים מספקים של שכנים, ומאגרגטים גדולים יתר על המידה כתוצאה מהובלת מגבלות ונימקו בליבה. גם גודל יהיה מושפע מכל התפשטות שעלולה להתרחש במהלך תהליך הצבירה. כפרמטרים אלה ישתנו משורת תאים לשורת תאים, אם הספרואידים של ממדים פיזיים ספציפיים רצויים המספר הנכון של תאים להציג חייב להיקבע באופן ניסיוני. כקירוב ראשון, קוטר אליפטית צפוי לגדול עם השורש השלישי של מספר התאים המשולבים - למשל עלייה של פי 8 במספר התאים צריכה לגרום להכפלת קוטר אליפטית. <html> _content &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> איור 1. סכמטי של ייצור אליפטית. מערכת microwell מורכבת ממערך של microwells מרובע פירמידה צפופה (625 לכל 2 סנטימטר לגודל מטר 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ), שלתוכו תאים עשויים להיות centrifuged. התאים הם הביאו יחד על ידי הצדדיים המשופעים, ואת גודל אליפטית וכתוצאה מכך הוא נשלט על ידי שינוי הצפיפות של ההשעיה התא המועסק. &quot;Src =&quot; 50665fig2highres.jpg / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. הרכבה של תאים התקבצו להספרואידים. Spheroids נוצרו משבעה מאה HT29 תאים כל אחד. מייד לאחר צנטריפוגה (א &#39;), תאי מקובצים באופן רופף בתחתית כל microwell. שים לב שהאשכולות מקוזזים באופן אחיד לכיוון הימני התחתונה במקרה זה. זה מקובל בתנאי גדלי אשכול יישארו עקביים במערך. אם הבדלי גודל אשכול משמעותי נראים מצד אחד של המערך לצד השני, ראה באור בשלב 3.5. לאחר דגירה ל24 שעות (ב &#39;), כוחות דבקים אינטר גרמו אשכולות כדי לצבור ויוצרים spheroids קוהרנטי, אשר עשוי להיות מופק לאחר מכן (C). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; איור 3. Spheroids שנוצר בצלחות microwell. Spheroids נוצרו משבעה מאה (A, C, E) או אלף וחמישה מאה (B, D, F) תאי סרטן המעי הגס HT29 (A, B), תאי סרטן ערמונית LNCaP (C, D) או תאי TE6 הוושט סרטן (E, F). שים לב לעקביות של הספרואידים בתוך הכנה, וגם הווריאציה בין שורות תאים - בפרט מצרפי LNCaP הרופפים בהשוואה לHT29 הצפוף יותר ותאי TE6. בר סולם מייצג 200 מיקרומטר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> פורמט microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> רוחב microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Microwells לסנטימטר 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Microwells בכל טוב </td><td> 1,200 </td><td> 4,700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> תאי מינימום לmicrowell * </td><td> N / </td><td> N / </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> תאים מקסימלית לmicrowell * </td><td> 2,000 </td><td> 2,000 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> תאים מינימליים לכל טוב * </td><td> N / </td><td> N / </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> תאים מרביים בכל טוב * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9.4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% אתנול (מיליליטר) נפח </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - שטיפת פתרון נפח (מיליליטר) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - preload בינוני נפח (מיליליטר) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - טעינה נייד נפח (מיליליטר) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * מספרים של תאים לכל microwell הם רק קירוב כערך זה ישתנה עם הגודל של התאים הספציפיים המועסקים, וצריך להיקבע באופן אמפירי </td></tr></tbody></table> טבלת 1. AggreWell אפשרויות ושינויים בפרוטוקול.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates at JoVE.com

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

production-large-numbers-size-controlled-tumor-spheroids-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.4K Views.  University of Calgary.  אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי. 

Video: Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

תקנת מזין ידי האכלה רציפה להרחבה בקנה מידה הגדולה של בתאי יונקים ב Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

ייצור כימיקלים לפי<em&gt; קלבסילה דלקת ריאות</em&gt; באמצעות הידרוליזה במבוק כמו זינה

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.