무균 마우스에 인간 배설물 이식을 위한 Bioexclusion IsoPositive 케이지 실험의 준비 및 유지 관리

이 프로토콜은 무균 마우스를 실험용 단일 케이지 아이솔레이터(isocage)로 옮기고 수용하는 동시에 멸균 상태를 유지하기 위한 모범 사례를 설명합니다. 무균 마우스에 대변 이식 방법과 추가 적용을 위해 이러한 장내 "인간화된" 마우스에서 생존 가능한 박테리아를 수집하는 방법에 대해 논의합니다.

무균 마우스는 숙주 건강과 질병에 대한 미생물의 기여도를 이해하기 위한 중요한 조사 도구이며, 숙주 반응에서 개인, 정의 또는 복잡한 미생물 그룹의 특정 역할을 평가할 수 있습니다. 전통적으로 플렉시블 필름 또는 반강성 아이솔레이터에서 사육 및 사육되는 무균 마우스 사육 및 실험적 조작은 비용이 많이 들고 수많은 훈련된 직원과 동물 사육 시설의 넓은 공간 공간이 필요합니다. IsoPositive 케이지 시스템을 사용하면 밀폐된 양압 아이솔레이터 케이지(isocage)에서 무균 마우스를 실험적으로 조작할 수 있어 비용을 절감하고 실험 조작의 유연성을 높일 수 있습니다.

여기에서는 무균 마우스를 번식 절연체에서 동종장으로 옮기고, 이후 인간 기증자 대변에서 쥐로 배설물을 옮겨 향후 연구를 위해 안정적인 장기 장내 "인간화" 마우스를 만들기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 케이지, 소모품, 장비 및 개인 보호 장비를 청소하기 위해 이산화염소 살균제 화학 살균제를 사용하는 것을 포함하여 isocage 시스템을 사용하는 데 필요한 재료 및 준비에 대해 설명합니다. 옮겨진 마우스의 무균 상태를 확인하는 방법과 케이지 시스템의 오염을 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 침구, 식량, 물 공급을 포함한 축산 절차에 대해 더 자세히 논의한다. 인간 배설물 슬러리 준비 및 무균 마우스로 가배주하여 장내 "인간화된" 마우스를 만드는 프로토콜과 함께 이러한 마우스의 미생물 군집 구성을 모니터링하기 위한 대변 채취에 대한 프로토콜이 설명됩니다. 한 실험은 인간 대변 이식 후 2주가 지나면 쥐 숙주에서 기증자 미생물총(microbiota)의 안정적인 집락화가 가능하여 후속 실험적 사용이 가능함을 보여줍니다. 또한, 생존 가능성 보존 배지에서 인간화된 쥐 배설물을 수집하여 추가 기능 실험에 사용할 수 있도록 하는 방법에 대해 설명합니다. 전반적으로 이러한 방법은 추가 조작을 위해 실험용 gnotobiotic 케이지에 인간화 마우스 군집을 안전하고 효과적으로 구축할 수 있습니다.

무균 마우스는 마이크로바이옴 연구자의 레퍼토리에서 필수적인 도구로, 숙주 건강 및 질병 상태에서 미생물총(microbiota)의 기여도를 해부할 수 있습니다. 무균 마우스는 완전히 불임 상태로 태어나 평생 동안 축삭 상태를 유지합니다¹. 특정 박테리아 균주를 가진 무균 마우스의 집락화는 이러한 분류군과 대사, 면역 또는 기타 숙주 기능 간의 원인 연구를 가능하게 합니다 ^2,3,4,5. 특히 유리한 것은 인간 기증자로부터 얻은 배설물을 이식하여 미생물군 수준에서 무균 마우스를 "인간화"할 수 있는 능력이며, 장벽 조건에 수용될 때 쥐 유래 미생물의 오염을 방지할 수 있습니다¹. 이 접근법은 마이크로바이옴 분야에서 많은 중요한 발견을 가능하게 했는데, 예를 들어 인간의 장내 마이크로바이옴이 암 면역요법 반응에 미치는 영향 ^6,7,8.

그러나 인간화 무균 마우스는 마이크로바이옴 분야의 연구 노력에 매우 중요하지만 이 접근 방식의 광범위한 적용을 방해하는 많은 제한 사항이 있습니다. 무균 마우스는 반강성 또는 연성 필름 대형 아이솔레이터에서 사육 및 유지되지만 기능 실험을 위해서는 별도의 미니 아이솔레이터를 설정해야 하며, 하나의 미니 아이솔레이터에 여러 케이지가 있지만 하나의 실험 조건에서만 가능합니다. 이 미니 아이솔레이터 접근 방식은 공간 점유율과 비용을 증가시키는 동시에 실험에서 조사할 수 있는 실험 조건의 수와 병렬로 실행할 수 있는 실험의 수를 심각하게 제한합니다. 유망한 솔루션은 ISOcage P Bioexclusion System(여기서는 isocage 시스템이라고 함)이라고 하는 개별 모듈식 케이지 시스템을 사용하는 것입니다^9,10. isocage system은 밀폐된 양압 아이솔레이터 케이지에서 무균 마우스의 실험적 조작을 가능하게 하여 각 미니 아이솔레이터 사이가 아닌 각 케이지 간에 별도의 실험 조건을 가능하게 합니다. 적절한 무균 기술을 사용하면 동물을 무균 조건에서 최대 12주 동안 동형장에 수용하거나 호환 가능한 모든 실험 접근법에 사용하기 위해 인간 대변 이식을 통해 인간화할 수 있습니다(즉, 무균 조건에서 수행할 수 있음). isocage 시스템을 사용하여 여러 개의 독립적인 실험을 병렬로 실행할 수 있으며, 미니 아이솔레이터에서 여러 실험을 실행하는 것보다 공간 공간과 비용이 크게 적습니다.

연성 필름 육종 아이솔레이터에서 무균 마우스를 육종하는 목적은 축삭 상태를 주의 깊게 보존하는 것입니다¹¹. 무균 상태를 모니터링하는 데 사용되는 기술에는 생쥐 신체 표면과 구강에 대한 일상적인 면봉 채취와 PCR 기반 상용 분석으로 배양 및 검사되는 배설물 샘플의 무균 수집이 포함됩니다. 이러한 샘플에 대한 박테리아, 혈청학 및 진균 검사는 모두 무균 상태를 결정하는 데 필요합니다¹¹. 무균 마우스가 실험적 사용을 위해 번식 절연체에서 이소케이지로 옮겨질 때, 마우스는 이식 시 무균 상태를 검증하기 위해 면봉 및 테스트를 받습니다. 아이소케이지 무균 검사는 배설물 샘플의 무균 채취를 통해 수행된 후 박테리아, 바이러스 및 진균 오염 물질을 검출하기 위해 배양됩니다. 출생부터 실험 프로토콜이 끝날 때까지 이러한 무균 검사 결과를 주의 깊게 수집하고 기록하는 것은 이러한 마우스의 무균 상태를 검증하는 데 필요합니다.

아이소케이지 시스템은 개별 케이지(그림 1), 사육 아이솔레이터 밖으로 운반하기 위한 트랜스퍼 디스크(그림 1) 및 케이지를 수용하는 아이소케이지 랙(그림 2)으로 구성됩니다. 각 아이소케이지에는 공급 공기 흡입구에 설치된 케이지 수준의 고효율 미립자 공기(HEPA) 필터와 닫힐 때 밀폐 밀봉을 만드는 실리콘 개스킷이 포함되어 있어 오염 물질이 공기를 통해 케이지로 유입되지 않도록 합니다(그림 1A). 이 케이지 뚜껑은 멸균된 생물 안전 캐비닛 내에 거꾸로 놓을 때 멸균 작업 표면으로 사용할 수 있습니다(그림 1A). 케이지 안의 와이어 랙에는 음식과 물병이 들어 있습니다(그림 1B). 케이지 내부에 오토클레이브된 집게는 내부 케이지 표면과의 접촉이 필요한 모든 조작에 사용됩니다. 케이지 자체에는 탈착식 케이지 카드 홀더를 위한 노치가 있어 외부에서 동물을 식별하고 아이소케이지 랙에 도킹하는 공기 흡입구 및 내보내기 노즐이 있습니다(그림 1C-E). 안전 폐쇄 클램프와 덮개의 탭 잠금 장치는 랙 시스템에 다시 도킹할 준비가 되었을 때 케이지를 밀봉합니다(그림 1F). 제안된 침구는 알파-드리(Alpha-dri)이며, 오토클레이브 가능한 농축 오두막도 권장됩니다(그림 1F). Transfer Disk는 무균 마우스를 번식 절연체에서 isocage로 이동시키는 데 사용되며 동물을 조작할 수 있도록 삼각형 개구부가 있는 회전 가능한 구획 뚜껑을 포함합니다(그림 1G-H). 디스크는 작은 크기(직경 21.6cm)와 큰 크기(직경 28cm)로 제공되며 둘 다 8개의 마우스를 수용할 수 있습니다. 오토클레이브 테이프는 디스크의 둘레와 공기 구멍에 기밀 밀봉을 만드는 데 사용되며, 이는 멸균제를 담그고 멸균제에 담근 백으로 운송하기 전에 수행됩니다(그림 1I). 랙 시스템 자체에는 시스템에 포함된 모든 기능인 공기 송풍기, 랙 수준 HEPA 필터 상태 및 랙의 비상 배터리 전원을 모니터링할 수 있는 화면이 있습니다(그림 2A). 동봉된 Magnehelic 게이지는 케이지 시스템에 의해 유지되는 양압을 표시하고, 자동 시각적 도킹 표시기는 케이지의 도킹 상태를 표시합니다(노란색 탭 아웃은 도킹된 케이지가 없거나 도킹에 실패했음을 의미함)(그림 2B-D). 또한 isocages의 조작에 필요한 것은 표준 인증 생물 안전 캐비닛입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 무균 상태를 유지하면서 무균 조건에서 번식 아이솔레이터에서 아이소케이지로 무균 마우스를 성공적으로 옮기는 적절한 방법, 인간 기증자 배설물 슬러리로 무균 마우스의 인간화, 무균 상태 확인 또는 추가 기능 연구를 위한 생존력 보존을 위해 아이소케이지에 보관된 마우스의 대변을 수집하는 적절한 방법을 설명합니다. 이 예시에서, 무균 마우스는 폐암에 대한 면역 요법으로 치료된 인간 피험자의 풀링된 대변 표본으로 인간화되고 치료에 대한 반응자 또는 비반응자로 이분화됩니다. 이 경우, 면역요법 반응에 대한 반응 표현형은 장내 미생물군 인간화에 의해 수용 마우스로 전달되었으며, 그 후 투여받은 마우스는 종양 세포를 추가로 접종하고 면역 요법으로 치료할 수 있었습니다. 인간 배설물 슬러리 프로토콜은 인간 기증자 배설물 또는 연구자가 원하는 질병 전임상 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 인간 배설물 기증자의 미생물총(microbiota)을 무균 숙주로 옮길 수 있어 건강과 질병에서 미생물총(microbiota)의 역할에 대한 추가 조사가 가능합니다.

그림 1: 아이소케이지 및 트랜스퍼 디스크의 개략도. (A) 케이지 뚜껑 밑면의 하향식 모습, 내부 케이지 수준 HEPA 필터와 실리콘 개스킷 씰의 위치를 나타내는 라벨. (B) 케이지 내부의 하향식 보기, 와이어 바 뚜껑, 내부 물병 및 스파우트, 오토클레이브 가능한 차우를 담을 수 있는 와이어 랙의 위치를 나타내는 레이블이 있습니다. (C) 케이지 카드 홀더의 노치를 보여주는 케이지의 전면 모습. (D) 뚜껑이 위에 있는 전체 케이지의 하향식 view, HEPA 필터가 공기 흡입구 노즐에 어떻게 설치되어 있는지 보여줍니다. (E). 아이소케이지 랙 시스템에 도킹하는 공기 흡입구 및 내보내기 노즐을 보여주는 케이지의 후면 모습. (F) 뚜껑이 맨 위에 있고 안전 폐쇄 클램프를 나타내는 레이블이 있는 전체 케이지의 측면 모습, 열린 위치에 있는 안전 폐쇄 클램프, 제자리에 고정하는 각 클램프의 흰색 탭. 케이지 내부는 바닥에 겹겹이 쌓인 알파 드리 침구와 침구에 배치 된 강화 오두막을 보여줍니다. (G) 뚜껑이 위에 있는 전송 디스크의 하향식 보기. (H) 전사 디스크 내부의 하향식 모습으로, 동물을 조작할 수 있도록 삼각형 개구부가 있는 회전 가능한 구획 뚜껑을 보여줍니다. (I) 번식 아이솔레이터에서 아이소케이지로 이송하는 동안 기밀 밀봉을 생성하는 오토클레이브 테이프의 배치를 보여주는 완전히 조립된 전사 디스크의 측면 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 아이소케이지 랙 시스템의 개략도. (A) 케이지가 도킹되고 송풍기 상태, HEPA 필터 상태 및 비상 배터리에 대한 모니터링 화면을 나타내는 레이블이 있는 완전한 아이소케이지 랙. 랙의 왼쪽 하단에는 랙 수준 HEPA 필터용 슬롯이 있습니다. (B) 랙에 의해 유지되는 양압을 보여주는 동봉된 Magnehelic 게이지. (C) 노란색 도킹 표시기가 보이지 않는 도킹된 아이소케이지로, 랙과 에어 노즐 사이의 성공적인 연결을 보여줍니다. (D) 랙의 빈 슬롯으로, 랙이 제자리에 있지 않고 에어 노즐과 아이소케이지가 연결되어 있지 않음을 나타내는 가시적인 자동 시각적 도킹 표시기가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모든 동물 실험은 플로리다 대학교(University of Florida, UF)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았으며 UF 동물 보호 시설(IACUC 프로토콜 #IACUC202300000005)에서 수행되었습니다. 무균 야생형 군집(GF WT; C57BL/6) 마우스는 UF Animal Care Services Germ-free Division에 의해 격리체에서 사육 및 유지되었습니다. 혼합 성별 GF WT 마우스는 번식 절연체에서 옮겨져 미생물 조작을 허용하기 위해 ISOcage P Bioexclusion 시스템에 배치되었습니다.

인간 배설물 샘플은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor, ICI) 치료를 받은 환자로부터 종방향 대변 샘플을 수집한 전향적 관찰 연구에서 얻었다¹². Advarra IRB(MCC#18611, Pro00017235)의 연구 승인 후 환자로부터 사전 동의를 얻었습니다. 피험자는 기능 연구를 위해 박테리아 생존력을 보존하기 위한 액체 치과 수송 매체(LDTM) 대변 수집 키트를 받고 완료했습니다. 반응 평가는 n=4 표본을 반응자(R)로, n=6을 비반응자(NR)로 특성화했습니다. 균질화된 LDTM-보존된 환자 샘플을 개별적으로 해동하고, 각각을 90초 이하의 혐기성 챔버에 넣고 반응 표현형(R: n = 4, NR: n = 6)에 따라 풀링했습니다. 그런 다음 풀링된 샘플을 분주하고 이 프로토콜에 사용하기 위해 -80°C에서 동결했습니다. 기증자 대변의 혐기성 집락 형성 단위(CFU) 수를 결정하기 위해 각 피험자의 대변을 1× ^10-5 로 연속적으로 희석하고, 각 희석액 10μL를 혐기성 뇌 심장 주입(BHI) 및 Luria Bertani(LB) 한천 플레이트에 이중으로 도말하고 대변 그램당 CFU 수를 추정했습니다. 각 피험자로부터 동일한 CFU를 쥐에 대한 배당을 위해 분변 접종 샘플로 풀링했습니다.

1. 케이지 및 오토클레이빙의 준비

1. 아이소케이지 준비
   1. ~500mL의 2018SX 다이어트 또는 원하는 강화 오토클레이브 다이어트로 케이지를 미리 채우고 바닥을 ALPHA-dri 침구로 겹겹이 쌓습니다. 오토클레이브 가능한 농축 오두막을 케이지 침대에 놓습니다. 밀봉되지 않은 빈 물병과 노즐, 길고 넓은 끝 집게를 와이어 랙 위에 놓습니다.
   2. 이중 종 생물학적 지표를 오토클레이브 주기당 하나의 케이지 내에서 식품에 배치합니다. 각 케이지 외부에 화학 적분기 스트립을 놓습니다.
   3. 121°C에서 45분 동안 진공 사이클에서 케이지를 고압멸균하고 최소 15PSI에서 30분 건조 시간을 갖습니다. ISO(International Organization for Standardization) 오염 제거 랙을 사용하여 케이지를 살균하여 케이지를 밀봉된 상태로 유지하고 증기가 내부 HEPA 필터를 통과하여 케이지가 열릴 때까지 멸균 환경을 유지할 수 있도록 합니다.
   4. 1L 병에 식수를 채우고 고무 캡으로 밀봉한 다음 병 표면에 화학 적분기 스트립을 놓습니다. 액체용 저속 배기 프로그램을 사용하여 121°C 및 최소 15PSI에서 45분 동안 오토클레이브합니다.
   5. 적절한 오토클레이브 매개변수를 즉시 검증하기 위해 각 케이지에 부착된 화학 적분기를 육안으로 확인하십시오.
      알림: 생물학적 지표는 멸균 상태에서 등가변장을 처음 열 때 제거해야 합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 생물학적 지표를 배양하고 색상 변화를 관찰하십시오. 원래의 파란색/보라색 투명 용액에서 노란색 또는 탁한 액체로의 생생한 색상 변화는 미생물 성장이 존재함을 나타냅니다. 표시기가 깨끗하고 파란색/자주색으로 유지되면 이는 해당 오토클레이브 주기에서 케이지 내부의 완전한 무균 상태를 확인하는 것입니다.

2. 이산화 염소 살균제 준비

주의 : 이산화염소 살균제는 일단 활성화되면 부식성이 매우 강합니다. 활성 이산화 염소 멸균제는 활성제와 염기의 혼합으로부터 24 시간 후에 만료됩니다. 이산화염소 살균제는 연기를 생성하는데, 이는 점막 표면에 자극을 줄 수 있으며 피부와 접촉할 때 자극을 유발할 수 있습니다. 살균제 준비를 위한 방이 싱크대와 적절한 환기에 접근할 수 있는지 확인하십시오. 동물 사육 시설에 필요한 개인 보호 장비(PPE) 외에도 이산화염소 살균제로 작업할 때 보안경, 호흡기 및 화학 물질 방지 장갑을 착용하십시오.

1. 혼합 베이스 및 활성제
   1. 표준 6L 부피의 이산화염소 살균제를 만들려면 먼저 1L 눈금이 매겨진 실린더에서 1L의 이산화염소 살균제 베이스를 측정하고 20L 용량의 덩크 탱크에 붓습니다.
   2. 동일한 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 4L의 수돗물을 측정하여 덩크 탱크에 붓습니다.
   3. 베이스와 물에 사용되는 눈금이 매겨진 실린더를 따로 보관하십시오. 새로운 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 1L의 이산화염소 살균제 활성제를 측정하고 덩크 탱크에 붓습니다.
   4. 활성제가 탱크에 추가되면 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 탱크의 내용물을 혼합합니다.
2. 활성화
   1. 덩크 탱크에 뚜껑을 놓고 활성제가 추가된 날짜와 시간, 이를 준비한 직원의 이름과 함께 이산화염소 살균제라고 라벨을 붙입니다. 원하는 경우, 멸균제를 혼합하는 데 사용되는 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 1L를 스프레이 병으로 옮길 수 있습니다.
   2. 덩크 탱크와 스프레이 병을 아이소케이지 랙과 케이지가 있는 동물 사육실로 옮기세요. 활성 이산화염소 멸균제는 완전한 활성화를 보장하기 위해 사용하기 최소 20분 전에 그대로 두어야 합니다.
      알림: 많은 양의 케이지(>9)를 조작하기 위해 덩크 탱크에서 한 번에 최대 12L를 준비할 수 있습니다. 1 케이지를 조작하거나 비상 사태가 발생하면 1.2 L의 이산화 염소 살균제를 더 작은 용기에 준비한 다음 2 1 L 스프레이 병에 옮길 수 있습니다. 살균제는 무균 마우스의 예상 이식 최소 1시간 전에 준비하는 것이 좋습니다.

3. 살균

1. PPE를 착용하세요
   1. 기본 케이지 매니퓰레이터로 보안경, 인공 호흡기, 내화학성 장갑, 멸균 수술 가운, 불룩한 옷, 소매 커버 및 신발 커버를 착용합니다. 직물이 이산화염소 살균제와 접촉하면 광범위한 얼룩이 생길 수 있으므로 PPE 아래에 스크럽을 착용하십시오.
   2. 기본 케이지 매니퓰레이터의 조수를 사용하는 것이 좋습니다. 보조자가 기본 케이지 매니퓰레이터와 동일한 PPE를 착용하도록 하되, 비멸균 수술 가운을 착용할 수 있습니다.
2. 생물 안전 캐비닛 준비
   1. 물티슈 10개를 이산화염소 살균제 덩크 탱크에 넣고 완전히 젖었는지 확인합니다.
   2. 물에 적신 물티슈를 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 캐비닛의 모든 표면을 평평한 작업 표면, 왼쪽, 후드 뒤쪽, 오른쪽 및 전면 내부 유리의 순서로 뒤에서 앞으로 담그십시오. 생물 안전 작업대의 보호되지 않은 표면을 만지지 않고 물티슈로 꽉 쥐어 비접촉 담그기를 수행합니다.
   3. 한 차례 청소한 후 물티슈를 이산화염소 살균제 덩크 탱크에 다시 넣어 담그십시오.
3. 아이소케이지 준비
   1. 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 최소 100mL의 이산화염소 살균제를 채워 큰 비닐 봉지를 준비하고 내부 표면이 모두 젖도록 봉지를 흔듭니다. 가방을 평평한 표면에 놓으십시오.
   2. 랙에서 단일 아이소케이지를 제거하고 케이지의 모든 표면이 액체와 접촉하도록 이산화염소 살균제 덩크 탱크에 넣습니다. 탱크에 적신 물티슈를 사용하여 케이지 표면을 더 문질러 액체가 완전히 접촉하도록 합니다.
   3. 케이지를 담근 후 조수가 불린 비닐 봉지를 열도록 합니다. 케이지를 가방에 넣고 조수가 즉시 입구를 닫도록 합니다. 스프레이 병을 사용하여 백 입구에 이산화염소 살균제를 스프레이합니다. 사용할 모든 케이지에 대해 이 절차를 따르십시오. 단일 36" 32" 48" 가방에 최대 4개의 케이지를 넣을 수 있습니다.
   4. 멸균된 1L 물병(1케이지 2개당 물)을 이산화염소 살균제 덩크 탱크에 필요한 만큼 담근 다음 다른 불린 비닐 봉지에 넣습니다. 모든 소모품이 가방에 넣으면 가방을 닫고 스프레이 병을 사용하여 가방 입구에 이산화염소 살균제를 뿌립니다.
   5. 모든 케이지와 용품을 포장한 후에는 내화학성 장갑을 이산화염소 살균제에 담그십시오(입구에 닿지 않도록 장갑을 최대한 위로 올리십시오).
4. 20분 살균 기간
   1. 완전한 멸균에는 최소 20분의 액체 접촉 시간이 필요합니다. 마지막 품목이 살균되고 비닐 침지 백이 닫히면 조수가 20분 타이머를 설정하도록 합니다. 타이머가 시작된 후 내화학성 장갑이 이산화염소 살균제로 적시지 않은 표면에 닿지 않도록 하십시오.
   2. 타이머가 20분이 지났다고 표시될 때까지 생물 안전 캐비닛 멸균 프로세스(3.2단계)를 반복적으로 수행합니다.
   3. 조수가 물에 적신 비닐 봉지의 외부 표면을 자주 흔들어 내부의 케이지 및 병 표면과 액체가 일관되게 접촉하도록 합니다.
   4. 20분이 지난 후, 어시스턴트가 물에 적신 비닐봉지를 열어 멸균된 케이지와 물병을 드러내도록 하고, 비닐봉지의 바깥쪽 표면만 만지도록 주의하세요.
   5. 멸균된 내화학성 장갑을 사용하여 각 케이지와 병을 멸균된 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 케이지가 너무 많아 생물 안전 캐비닛에 들어갈 수 없는 경우, 비닐 봉지의 입구가 닫히고 각 구멍 사이에 이산화염소 살균제가 적시는 한 멸균 상태로 유지되므로 나머지 케이지를 비닐 봉지에 그대로 두십시오.

4. 무균 마우스 전송

1. 아이소케이지 준비
   1. 밀폐된 아이소케이지를 열려면 뚜껑 측면에 있는 두 클램프의 흰색 탭을 들어 올린 다음 각 클램프를 옆으로 당겨 빼냅니다. 케이지에서 뚜껑을 들어 올리려면 뚜껑이 케이지 바닥 부분에서 떨어져 있어야 합니다. 케이지 왼쪽에 뚜껑을 거꾸로 놓고 멸균 워크스테이션으로 사용하십시오.
      참고: 케이지 뚜껑 또는 오토클레이브 기구 백 내부를 멸균 작업 표면으로 사용하는 대신 오토클레이브 드레이프를 사용하는 것이 있으며, 이는 더 큰 표면적을 제공하고 오류가 발생했을 때 케이지 뚜껑의 의도하지 않은 오염을 방지합니다.
   2. 철사 랙 상단의 케이지 내부에 있는 멸균 집게를 사용하여 빈 물병을 제거하고 뚜껑 안쪽에 놓습니다. 고무 씰을 제거하여 1L 물병을 열고 물병에 물을 부어 채웁니다. 집게를 사용하여 노즐을 물병에 놓고 단단히 눌러 밀봉합니다.
   3. 멸균 집게를 사용하여 와이어 랙을 들어 올리고 케이지 바닥에 구멍을 뚫을 수 있도록 몇 인치 뒤로 놓습니다. 멸균 집게를 와이어 랙에 놓고 손잡이가 케이지 표면에 닿지 않도록 합니다.
2. 전송 디스크 사용
   알림: 훈련된 무균 직원이 번식 절연체의 관리 및 유지 관리를 담당합니다. 번식 절연체의 개방과 관련된 위험을 감안할 때, 이 직원은 무균 마우스의 전사 디스크 살균, 준비 및 격리기에서 isocages로 이동을 수행합니다. 프로세스를 간략하게 설명하자면, 트랜스퍼 디스크는 멸균이 가능한 오토클레이브 실린더에 준비됩니다. 생물학적 지표는 불임 상태를 확인하는 데 사용됩니다. 트랜스퍼 디스크를 밀봉하기 위한 테이프도 실린더 내부에 고압멸균됩니다. 이러한 물질을 둘러싸고 있는 멸균된 실린더는 트랜스퍼 슬리브를 통해 아이솔레이터에 부착되고 마우스는 케이지에서 디스크로 이동됩니다. 그런 다음 뚜껑을 디스크에 놓고 오토클레이브 테이프를 사용하여 디스크와 공기 구멍 둘레에 기밀 밀봉을 만듭니다. 밀봉된 디스크는 즉시 아이솔레이터의 출구 포트에 배치됩니다. 그런 다음 홈 아이솔레이터의 포트 캡을 닫고 디스크 외부를 멸균제로 철저히 닦고 멸균제에 적신 백에 넣고 완전한 오염 제거를 위해 20분 동안 모니터링합니다. 그런 다음 무균 육종 직원은 이 디스크를 연구 직원에게 전달합니다. 마우스는 전송 디스크가 봉인된 시간으로부터 30분 이상 봉인된 디스크에 보관할 수 없으므로 이 프로토콜의 모든 이전 단계를 전송 디스크가 도착하기 전에 충분한 시간을 두고 완료해야 합니다.
   1. 전송 디스크를 받으면 보조 사용자가 플라스틱 덮개를 잡고 부분적으로 풀어 전송 디스크의 젖은 표면이 노출되지만 보조 사용자가 만지지 않도록 합니다.
   2. 전송 디스크를 받으면 보조 사용자가 플라스틱 덮개를 잡고 부분적으로 풀어 전송 디스크의 젖은 표면이 노출되지만 보조 사용자가 만지지 않도록 합니다.
   3. 이산화염소 살균제에 적신 내화학성 장갑을 착용하고 살균제에 적시지 않은 표면을 만지지 않도록 주의하면서 플라스틱 포장에서 전사 디스크를 제거합니다. 그런 다음 멸균된 생물 안전 캐비닛의 평평한 표면에 전사 디스크를 놓습니다.
   4. 전사 디스크를 열려면 테이프를 떼어내고 디스크 둘레를 밀봉한 다음 생물 안전 캐비닛 외부에 버리십시오. 전사 디스크의 뚜껑을 제거하고 생물 안전 캐비닛 외부에 버리십시오.
   5. 전송 디스크 내부에는 단일 개구부가 있는 회전식 수납부 덮개가 있습니다. 이전에 케이지의 와이어 랙에 있던 멸균 집게를 사용하여 이 구획 덮개를 조작하여 개구부를 전송에 필요한 마우스로 이동합니다.
3. 디스크에서 isocage로 마우스 이송
   1. 집게를 사용하여 플라스틱 디스크 덮개의 구멍을 통해 마우스 꼬리 바닥을 잡고 와이어 랙과 케이지 사이에 이전에 열린 공간을 통해 마우스를 들어 올려 아이소케이지로 옮깁니다. 해당 케이지로 향하는 모든 마우스에 대해 반복합니다.
   2. 모든 마우스가 해당 isocage로 옮겨지면 집게를 사용하여 와이어 랙을 교체합니다. 그런 다음 케이지 뚜껑을 들어 올리고 집게를 사용하여 케이지 위에 다시 놓습니다.
   3. 케이지 뚜껑의 각 클램프를 위로 들어 올리고 케이지 측면을 조심스럽게 내린 다음 흰색 탭을 아래로 눌러 케이지 뚜껑을 밀봉합니다.
   4. 케이지가 밀봉되면 어시스턴트가 케이지 랙에 있는 도킹 사이트의 각 노즐에 이산화염소 살균제를 분사하도록 합니다. 그런 다음 후드에서 케이지를 제거하고 조수에게 전달하면 조수가 케이지를 랙에 도킹할 수 있습니다.
   5. 전송 디스크의 각 마우스에 대해 이 단계를 반복합니다.
4. 생물 안전 작업대 청소
   1. 마우스를 isocage로 모두 옮기는 작업이 완료되면 후드에서 이물질을 비우고 이산화염소 살균제에 적신 물티슈로 완전히 닦아냅니다.
   2. 이소프로필 알코올로 후드를 닦아 잔류 이산화염소 살균제를 제거합니다. 후드의 작업 표면 아래 공간은 멸균 과정에서 많은 양의 살균제를 수집합니다. 마른 물티슈로 흡수를 통해 이것을 제거하고 이소프로필 알코올로 닦으십시오.
   3. 액상 이산화염소 살균제는 활성화 후 24시간 동안 싱크 배수구를 통해 폐기하십시오. 멸균제로 오염된 고체 물질은 일반 쓰레기로 폐기하십시오.
      참고: 동종 상태로 옮겨진 무균 마우스는 개입하기 전에 새로운 환경에 적응하기 위해 1주일 동안 방치됩니다. 이것은 연구 결과를 방해할 수 있는 동물이 경험하는 스트레스를 줄입니다. 이 1주일의 적응 기간이 끝나면 6단계에서 설명한 대로 대변을 수집하여 개입하기 전에 무균 상태를 확인합니다.

5. 무균 마우스로 인간 배설물 슬러리의 구강 가스

1. 오토클레이브 위배양 공급품 준비
   1. 구강 위장 시술 1일 전에 자가 밀봉 멸균 파우치(마우스당 1개)에 구강 위침 바늘을 넣고 자가 밀봉 멸균 파우치(마우스당 1개)에 멸균 1mL 주사기를 넣습니다. 이 비커와 600mL 폴리프로필렌 비커(마우스당 1개) 및 긴 집게 한 쌍을 오토클레이브 안전 백에 넣고 오토클레이브를 통해 멸균합니다.
   2. 오토클레이브에서 백을 제거하는 즉시 포장 테이프로 백을 밀봉하고 다음 날까지 보관하십시오.
2. 인간 배설물 슬러리 준비
   1. 가스 처리 당일, 균질화되어 혐기성 보존 매체(이 경우 Liquid Dental Transport Media)에 저장된 인간 대변을 -80°C 냉동고에서 혐기성 챔버로 이송합니다. 균질화된 분변 물질을 10mL 원추형 튜브에 있는 멸균 혐기성 식염수 용액에 약 1:10으로 희석합니다.
   2. 인간 배설물 슬러리가 들어있는 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 와류로 균질화한 다음 200g에서 5분 동안 원심분리하여 미립자를 가라앉힙니다.
   3. 튜브를 혐기성 챔버에 다시 넣고 상등액을 다른 10mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 인간 배설물 상등액이 들어 있는 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 혐기성 챔버에서 제거한 다음 2차 누출 방지 용기에 넣습니다. 가스 공급품이 담긴 오토클레이브 백과 함께 컨테이너를 동물 사육 위치로 운반합니다.
      참고: 보고 목적으로 gavage를 위한 인간 배설물의 총 CFU/mL를 추정하는 것이 중요합니다. 적절한 집락화를 보장하기 위한 최소 CFU 부하가 얼마인지는 불분명하지만, CFU가 높을수록 공여체 대변의 생착이 더 잘 됩니다¹³. 인간 배설물 물질의 CFU 부하로 인해 생착률이 낮아지면 인간 배설물 표본을 회수하십시오. 생존력 보존 배지를 사용하면 수집된 분변 표본에서 CFU 회수율이 향상됩니다. 기증자 대변의 혐기성/호기성 CFU 수를 측정하려면 샘플을 1 x ^10-5 로 연속적으로 희석하고 호기성 및 혐기성 BHI 및 LB 한천 플레이트에서 각 희석액을 10μL씩 복제합니다. 24시간(유산소 운동) 및 48시간(무산소 운동) 후에는 대변 그램당 CFU를 계산합니다.
3. 아이소케이지 준비
   1. 2단계와 3단계를 반복하되, 이제 유일한 차이점은 이러한 케이지에 쥐가 있다는 것이며, 랙 제거 후 30분 이내에 각 아이소케이지를 멸균된 후드에 넣고 뚜껑을 통풍시켜 마우스로 공기 흐름을 허용하도록 주의를 기울여야 합니다.
   2. 이산화염소 살균제 포화를 통해 5.1단계 및 5.2단계의 오토클레이브 간 물질 백과 인간 배설물 슬러리 튜브를 물병과 유사한 방식으로 살균합니다(즉, 살균제에 담근 다음 살균제에 담근 백에 넣습니다).
   3. 20분의 멸균 기간이 완료된 후 isocages와 구강 위장 공급품을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 내부에 들어 있는 긴 집게에 백을 밀어 오토클레이브 공급 백에 구멍을 낸 다음 용품을 제거하고 후드 밖으로 백을 버립니다.
4. 가바지
   1. 잔류 이산화염소 살균제가 쥐와 접촉하는 것을 방지하기 위해 내화학성 장갑 대신 새 멸균 수술 가운과 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 필요한 경우 이 과정에서 보조자의 도움을 받습니다.
   2. 각 멸균 파우치의 포장을 풀어 개패 바늘을 준비하고 파우치 내부를 건조하고 멸균된 휴지 표면으로 사용합니다. 각 주사기에 개비지 바늘을 연결하고 분변 슬러리 튜브를 연 다음 각 주사기에 200μL의 대변 슬러리를 당겨 넣습니다.
   3. 집게를 사용하여 케이지에 있는 단일 마우스의 꼬리 바닥을 잡고 와이어 랙에 놓습니다. 긁어서 마우스를 부드럽게 제지하고 마우스를 수직으로 세운 상태에서 바늘을 삽입하고 대변 슬러리를 부드럽게 주입한 다음 즉시 바늘을 제거합니다.
   4. 관찰을 위해 멸균된 컵 중 하나에 마우스를 직접 넣습니다. 케이지에 있는 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다. 모든 마우스가 개비지를 받은 후 집게를 사용하여 각 마우스를 케이지 침대로 다시 이동하고 4.3.2-4.3.4 단계에 설명된 대로 케이지를 밀봉합니다.
      참고: 두 개 이상의 개별 배설물 슬러리를 사용하는 경우 생물 안전 캐비닛과 필요한 케이지 및 재료를 완전히 재멸균해야 합니다. 한 그룹의 마우스가 세균이 없는 상태로 남아 있는 경우, 이 마우스는 다른 그룹을 치료하기 전에 대조군 개비지를 받는 것이 좋습니다.
   5. 4.4단계의 절차에 따라 이산화염소 살균제 및 살균제에 적신 물질을 폐기하십시오. 인간 배설물 슬러리로 오염된 모든 물질은 생물의학 폐기물로 처리하고 환경, 보건 및 안전 절차에 따라 폐기하십시오.

6. 생존력 보존을 위한 인간화 마우스의 대변 수집

1. 오토클레이브 소모품 준비
   1. 짧은 와이드 팁 집게를 자체 밀봉 멸균 파우치(마우스당 1개), 600mL 폴리프로필렌 비커(마우스당 1개), 긴 집게 한 쌍을 오토클레이브 안전 백에 넣고 대변 채취 절차 1일 전에 오토클레이브를 통해 멸균합니다.
   2. 오토클레이브에서 백을 제거하는 즉시 포장 테이프로 백을 밀봉하고 다음 날까지 보관하십시오.
2. 보존 매체 튜브 준비
   1. 혐기성 생존도 보존 배지를 선택합니다(여기서는 Cary Blair가 사용됨). 보존 매체 1mL를 생물 안전 캐비닛의 멸균 나사 캡 2mL 튜브에 분배합니다. 최적의 보존을 위해 1:10 대변:매체의 비율이 권장됩니다.
   2. 각 튜브에 영구 마커로 사전 라벨을 부착하되, 이산화염소 살균제에 노출되면 플라스틱 표면에서 영구 마커 라벨이 제거될 수 있습니다. 또 다른 방법은 튜브에 라벨을 붙이지 않은 상태로 두고 냉동 전에 수집 직후 보조 라벨 튜브를 사용하는 것입니다.
   3. 이 튜브를 표준 폴리프로필렌 튜브 랙에 놓으면 튜브를 똑바로 세우서 보관하는 동시에 이산화염소 멸균제와 접촉하여 멸균할 수 있습니다.
3. 멸균 케이지 및 생물 안전 캐비닛
   1. 2단계와 3단계를 반복하여 isocage와 생물 안전 캐비닛을 멸균합니다. 다시 말하지만, 랙을 제거한 후 30분 이내에 각 아이소케이지를 멸균된 후드에 넣고 뚜껑을 환기시켜 마우스로 공기 흐름을 허용하도록 주의하십시오.
   2. 또한 이산화염소 살균제 포화를 통해 준비된 튜브가 들어 있는 오토클레이브 공급 백과 랙을 살균하고 케이지가 들어 있는 불린 비닐 백에 넣습니다. 목표는 각 튜브의 모든 표면 및 랙 자체와 액체가 완전히 접촉하는 것입니다.
4. 배설물 샘플 수집 및 보관
   1. 20분의 멸균 기간이 완료된 후 isocages, 오토클레이브 소모품 및 튜브 랙을 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 내부에 들어 있는 긴 집게에 가방을 밀어 오토클레이브 공급 가방에 구멍을 뚫고 소모품을 제거하고 후드 밖으로 가방을 버립니다.
   2. 잔류 이산화염소 살균제가 쥐와 접촉하는 것을 방지하기 위해 내화학성 장갑 대신 새 멸균 수술 가운과 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 원하는 경우 보조자가 이 프로세스를 지원하도록 합니다.
   3. 파우치의 포장을 풀고 내부 파우치 표면을 멸균 영역으로 사용하여 뭉툭한 팁 집게를 준비합니다. 튜브 랙을 생물 안전 후드 표면에 놓습니다.
   4. 긴 집게를 사용하여 우리에 있는 한 마리의 쥐 꼬리 아랫부분을 잡고 관찰을 위해 살균된 컵 중 하나에 직접 넣습니다. 케이지에 있는 모든 마우스에 대해 이 과정을 반복합니다.
   5. 갓 통과한 배설물 알갱이가 적어도 두 개 이상 생성될 때까지 쥐를 관찰합니다.
      1. 뭉툭한 끝 집게를 사용하여 배설물 알갱이를 집어 튜브에 직접 넣습니다. 즉시 나사 캡 뚜껑을 밀봉하고 조수에게 전달하십시오.
      2. 보조자가 튜브에 라벨을 붙이고 와류를 통해 대변을 즉시 균질화하도록 합니다. 일단 균질해지면 튜브를 액체 질소에 스냅 동결하고 -80 °C에서 장기간 보관합니다.
   6. 케이지에 있는 각 마우스에 대해 대변 수집 과정을 반복합니다. 배설물을 채취한 후 각 마우스를 가정용 케이지에 교체하고 케이지를 랙에 다시 도킹합니다. 4.4단계를 반복하여 후드를 청소하고 폐기물을 처리하십시오.

ICI 반응자 및 비반응자 표현형(이전에 프로토콜에 설명됨)에 의해 풀링된 인간 배설물 샘플을 그룹당 3개의 동종케이지(n = 1-2 마우스/케이지, 반응자의 경우 n =6, 비반응자의 경우 n = 5)에 수용된 혼합 성별 GF-WT 마우스로 조사했습니다. 마우스는 이식 후 1주일 동안 적응하도록 했습니다. 그런 다음 이러한 마우스로부터 배설물 샘플을 수집했습니다(무균 조건). 그런 다음 마우스에 1 × 10⁷ CFU의 반응자 또는 비응답자 풀링된 인간 배설물을 주입했습니다. 그런 다음 대변은 배뇨 후 1주, 2주, 4주 후에 채취했습니다. 배설물 샘플은 무균 마우스에서 오염 물질의 검출률이 100%이므로 배설물 샘플 외에 케이지 침구, 물 등을 테스트할 필요가 없습니다¹⁴. 이식 1주일 후 이 마우스의 무균 상태를 확인하기 위해 인간 대변 이식 전에 각 마우스에서 하나의 대변 펠릿을 수집하고 무게를 측정한 다음 즉시 혐기성 챔버로 옮겼습니다. 각 대변 샘플을 1mL의 멸균 혐기성 인산염 완충 식염수에 재현탁시킨 후 펠렛 페슬 무선 모터 및 멸균 오토클레이브 믹서를 통해 수동 균질화했습니다. 그런 다음 균질화된 대변을 1 × ^10-5 로 연속적으로 희석하고, 각 희석액 10μL를 혐기성 BHI 한천 플레이트에 복제하여 도말하였다. 그런 다음 각 희석액을 혐기성 챔버에서 제거하고 호기성 조건에서 BHI 한천 플레이트에 동일하게 도금했습니다. 혐기성 플레이트는 파라필름으로 밀봉하고 혐기성 챔버에서 37°C에서 48시간 동안 배양한 반면, 호기성 플레이트는 호기성 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 이 마우스에서 무균 상태는 모든 희석과 모든 조건에서 배양 가능한 배설물 박테리아가 전혀 없음에 의해 확인되었습니다. 무균 검체를 배양할 때 단일 집락 형성 단위(CFU)도 허용되지 않으므로 위양성이 의심되는 경우(즉, 희석 계수가 높지만 다른 희석률이 낮은 단일 집락) 마우스의 오염 상태를 확인하기 위해 새 대변 샘플로 이 검사를 반복하는 것이 좋습니다. 오염된 쥐, 케이지 전체 및 공동 수용된 쥐는 연구에서 제거해야 합니다. 바이러스 및 진균 오염 물질에 대한 상용 PCR 분석을 수행하여 무균 상태를 검증할 수도 있습니다.

인간화된 마우스의 시간 경과에 따른 집락화를 평가하기 위해 앞서 설명한 바와 같이 DNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HT (QIAGEN)를 사용하여 DNA에 대해 50-70mg의 쥐 배설물 또는 공동 기증자 대변 접종물을 추출했습니다. 분변 DNA 추출 후, 16S rRNA 유전자 V1-V3 초가변 영역을 범용 Illumina 쌍말 어댑터 염기서열과 함께 바코드 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하고, PCR 산물을 앞서 설명한 대로 정제, 정량화 및 풀링하고 Illumina MiSeq (2 × 300)¹⁵의 단일 실행으로 염기서열분석했습니다. 분석은 앞서 설명한 바와 같이 수행하였다¹⁵. 인간화된 쥐의 배설물 군집 구조는 세 가지 시점 모두에서 반응 표현형에 따라 유의하게 달랐습니다(그림 3A-D). 흥미롭게도, 반응자 대변 집락화된 마우스는 1주와 2주, 그리고 2주와 4주 사이에 미생물 군집 구조에 차이가 없었습니다(그림 3E-G). 비반응자 대변 집락화된 마우스는 1주와 2주 사이에 다른 미생물 군집 구조를 보였지만 2주와 4주 사이에 유사한 군집 구조를 보였습니다(그림 3H-J). 두 군집화 그룹의 미생물 군집 구조가 2주와 4주 사이에 크게 다르지 않았기 때문에 이는 2주 이내에 안정적인 집락화에 도달할 수 있음을 나타냅니다. 원래 반응자 인간 접종물에서 발견된 571개의 앰플리콘 염기서열 변이체(ASV) 중 35%는 배균 후 1주일, 29%는 2주, 26%는 4주에 발견되었습니다. 무반응 인간 접종에서 발견된 648개의 ASV 중 23%는 비반응자 집락화된 마우스에서 1주일 후, 23%는 2주, 21%는 4주에 발견되었습니다. 인간 공여자 접종물은 박테로이데스(Bacteroides), 라크노클로스트리디움(Lachnoclostridium), 마르빈브리안티아(Marvinbryantia) 및 파라박테로이데스(Parabacteroides)의 상대적 풍부함이 증가한 수용 마우스에 비해 박테리아 속 Blautia, Eubacterium, Ruminococcus 및 Streptococcus의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3K).

그림 3: 시간 경과에 따른 무균 마우스와 반응자 또는 비반응자 인간 배설물의 집락화. (A) 집락화 후 1주, 2주 또는 4주 후에 개별 마우스의 배설물 간에 Bray-Curtis로 측정된 베타 다양성의 비유사성을 보여주는 주좌표 분석(PCoA)(R: n = 6; NR: n = 5) 및 R 또는 NR 인간 기증자의 공동 기증자 대변 접종(R 접종: n = 1; NR 접종: n = 1). (B) Bray-Curtis에 의해 측정된 베타 다양성을 보여주는 PCoA는 집락화 1주일 후 개별 쥐 배설물 간의 비유사성(R: n = 6; NR : n = 5) (P = 3.18 × ^10-7). (C) Bray-Curtis에 의해 측정된 베타 다양성을 보여주는 PCoA는 집락화 2주 후 개별 쥐의 배설물 간 비유사성(R: n = 6; NR : n = 5) (P = 8.00 × ^10-8). (D) 집락화 4주 후 개별 쥐 배설물 간의 Bray-Curtis 차이로 측정한 베타 다양성을 보여주는 PCoA(R: n = 6; NR : n = 5) (P = 1.17 × ^10-7). (E) 집락화 후 1주 또는 2주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis로 측정한 베타 다양성을 보여주는 PCoA(R: n = 6) (P = 0.513). (F) 집락화 후 1주 또는 4주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis에 의해 측정된 베타 다양성을 보여주는 PCoA (R: n = 6) (P = 4.87 × ^10-6). (G) 집락화 후 2주 또는 4주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis로 측정한 베타 다양성을 보여주는 PCoA(R: n = 6) (P=0.835). (H) 집락화 후 1주 또는 2주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis에 의해 측정된 베타 다양성을 보여주는 PCoA(NR: n = 5) (P = 4.86 × ^10-4). (I) 집락화 후 1주 또는 4주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis로 측정한 베타 다양성을 보여주는 PCoA(NR: n = 5) (P = 1.35 × ^10-4). (J) 집락화 후 2주 또는 4주 후에 개별 쥐의 배설물 간에 Bray-Curtis로 측정한 베타 다양성을 보여주는 PCoA(NR: n = 5) (P = 0.046). P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. (K) 인간 R과 NR 공여자(human R)와 NR 공여자(NR donor) 사이의 속 수준 앰플리콘 서열 변이체(ASV)의 상대적 풍부도 막대 플롯(R inoculum: n = 1; NR 접종: n = 1) 및 모든 시점에 걸친 수용 마우스(R: n = 18; NR: n = 15)에 주요 분류군이 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에 설명된 프로토콜은 실험용 isocage에 보관된 무균 마우스의 인간화를 위한 재현 가능하고 매우 상세한 방법을 제공합니다. 인간 피험자의 배설물 군집을 쥐 숙주로 독점적으로 이식할 수 있는 능력은 마이크로바이옴 연구에 매우 중요합니다. 생쥐 특이적 공생 미생물총(communensal microbiota)에 의한 오염 없이, 다양한 건강 및 질병 상태에 대한 인간 거주 박테리아의 영향 또는 식단 또는 약물 투여와 같은 중재가 인간 미생물총(human microbiota)에 미치는 영향을 연구할 수 있다 16,17,18. 이러한 연구는 건강 및 질병 상태에서 마이크로바이옴 구성의 인과 관계를 입증하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에는 보존 매체에서 인간화된 쥐 배설물을 수집하는 것도 포함되어 있어 추가 사용을 위해 생존력이 보존된 미생물을 회수할 수 있습니다. 여기에 설명되지 않은 추가 응용 분야는 단일 박테리아 균주와의 단일 연관 또는 Altered Schaedler flora 또는 Mouse Intestinal Bacterial Collection (miBC) ^{13 , 19 , 20} 과 같은 정의 된 박테리아 군집과의 집락화입니다. 이러한 접근 방식은 중재 및 숙주 요인에 대한 반응으로 특정 박테리아 균주의 제어 및 추적성을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 이러한 정의된 컨소시엄 또는 단일 분리물을 사용하는 데에도 매우 적합하며, 유일한 수정 사항은 박테리아를 마우스로 구강 배양하기 전에 사전 배양해야 한다는 것입니다.

여기에 설명된 대표적인 결과는 적절하게 구동되는 실험을 구성하지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 인과 관계를 결정하기 위해, 단일 기증자의 장내 "인간화된" 마우스는 단일 생물학적 복제품(공여자)의 기술적 복제물만을 구성합니다¹⁹. 인과 관계를 적절하게 테스트하려면 완전히 다른 기증자 샘플을 사용하여 이 실험을 최소 두 번 반복해야 하며, 이상적으로는 풀링된 샘플 대신 단일 기증자에서 추출하는 것이 좋습니다. 우리의 대표적인 결과의 경우, 각 시점에서 샘플링된 단일 케이지에 여러 마우스가 있는 것은 유사복제로 간주되며, 이러한 데이터는 인과 추론¹⁹을 만드는 데 사용될 수 없습니다. 대신, 적절하게 설계된 실험은 기증자당 하나의 케이지를 실험의 단일 데이터 포인트로 간주합니다. isocage 시스템의 일반적인 실험을 입증하기 위해 이러한 결과를 제공하지만 조사자는 연구를 시작하기 전에 실험 설계에 적절한 검정력 분석을 적용하는 데 주의를 기울여야 합니다.

본 연구에서 기증자 마이크로바이옴 구성은 수혜자 구성과 유사했지만, 이러한 인간화 마우스는 기증자와 동일하지 않았습니다(그림 3A, K). 이는 기증자 샘플의 준비, 수혜자 마우스의 유전자형 및 식단, 위장의 빈도, 기증자 대변의 CFU 수, 원래 기증자 대변의 보존 방식을 포함하여 많은 요인이 무균 마우스에 대한 분변 미생물군 샘플의 생착 속도에 영향을 미치기 때문에 예상할 수 있습니다^{13,20, 21,22}. 1713명의 인간에서 GF 마우스로의 이식 결과를 조사한 연구는 인간 종의 47%만이 수용 마우스에서 재현되었으며 이식된 분류군의 1/3은 기증자와 상대적 풍부도가 일관되게 달랐다는 것을 발견했습니다²³. 일부 연구에서는 전이율이 더 높고 기증자 구성과 더 유사성이 높지만, 따라서 장내 "인간화"는 완벽하지 않으며, 다양한 생착은 이 절차의 한계로 간주되어야 한다^24,25. 실패한 생착은 수용자 마우스로의 표현형 이식 실패의 원인이 될 수 있으므로 이러한 연구를 수행할 때 이러한 결과를 측정하기 위해 기증자와 수혜자 대변의 염기서열분석이 매우 바람직합니다. 장내 "인간화" 마우스 모델의 결과를 보고할 때 공여자 대변 채취, 준비, 16S rDNA 염기서열분석 정의 조성 및 기타 모든 관련 세부 사항에 대한 자세한 방법을 재현할 수 있도록 주의 깊게 설명해야 합니다.

인간 배설물 기증자에서 마우스로의 분류군 전이율은 100% 미만이지만 이는 독특한 기회를 나타냅니다. 질병 또는 반응 표현형이 장내 인간화 마우스 모델에서 유지되는 경우, 특정 기능에 필요하지 않은 균주를 배제하는 방법으로 마우스로 전달된 분류군을 사용할 수 있으며 대신 마우스로 전달된 분류군에만 집중할 수 있습니다. 생존력이 보존된 인간화 생쥐 배설물은 박테리아 균주를 분리하여 맞춤형 인간 분리 컨소시엄을 만드는 데 사용되거나 기능 연구를 위해 생쥐를 다시 통과할 수 있습니다. 인간 대변 기증자 대변 수량이 제한된 경우, 인간 기증자 대변 대신 생존력이 보존된 마우스 수혜자 대변을 사용하여 마우스에 군체를 형성할 수 있습니다. 또한, 생존력 보존 수혜자 대변은 숙주와 분리된 미생물총(microbiota)을 연구하기 위해 생물반응기 시스템을 접종하는 것과 같은 추가 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

여기에 설명된 개별 아이솔레이터 케이지는 실험적 유연성을 제공하여 많은 그룹과 병렬 실험을 수행하는 데 필요한 비용과 인력을 줄여줍니다 ^9,10. 그러나 실험용 아이솔레이터보다 아이소케이지를 사용할 때 오염 위험이 더 높습니다^26,27. 미니 아이솔레이터에는 음식과 물이 비축되어 있으며 외부 환경으로부터 내용물을 보호하는 포털 입구가 있습니다. 아이소케이지는 생물 안전 캐비닛으로 옮겨서 열어야 하며, 이로 인해 외부 오염 물질이 케이지 표면과 접촉하여 마우스로 옮겨질 가능성이 크게 높아집니다. 따라서 오염 가능성은 생물 안전 캐비닛에서 isocage 시스템이 열리는 횟수와 직접적인 관련이 있으며, 이는 축산 요구 사항으로 인해 최소 2주마다 열립니다. 결과적으로, 생쥐를 12주 이상 아이소케이지에 사육하는 것이 좋다¹⁰. 이것은 아이소케이지의 실험적 접근 방식을 장기 모델을 제외하고 단기 실험으로 제한하지만 장기 집락화 연구는 아이솔레이터 하우징 접근 방식에 더 적합합니다. 아이소케이지 시스템은 예를 들어 종양 생산 및 약물 치료와 관련된 연구를 가능하게 하는 것과 같이 더 빈번한 개입이 필요한 실험적 접근 방식에 특히 적합합니다.

일부 대안적 접근법은 무균 SPF 상태(ex-GF 모델이라고 함) 또는 항생제가 고갈된 마우스로 전환한 후 인간 미생물총(microbiota)을 즉각적이고 반복적으로 집락화하여 원래의 대변 기증자 구성을 부분적으로 재현하는 방법을 사용합니다. 이러한 접근 방식은 장기 연구를 위해 기증자 미생물총(microbiota)이 군집화할 수 있도록 하는 가능성을 보여주었지만, 마우스 특이적 공생 박테리아는 여전히 이러한 모델에 군집화하여 혼합 미생물 군집(인간과 생쥐)을 형성합니다. 이는 다량의 인간 기증자 배설물과 반복적인 집락화(때로는 매일²⁸)를 사용하여 부분적으로 완화할 수 있습니다. isocage 시스템에서 인간 배설물 샘플과 무균 마우스의 집락화는 안정적인 집락화를 위해 단일 배기(gavage)만 필요하므로 이러한 대체 접근법보다 훨씬 적은 기증자 물질이 필요하지만, 추가 배변은 추가 시간과 기증자 배설물 물질을 희생시키면서 생착을 향상시킬 수 있습니다²¹. 이전 실험에서는 인간의 배설물이 무균 마우스로 옮겨지는 전이율이 88%에 달하는 것으로 나타났지만, 앞서 논의한 바와 같이 이 비율은 매우 가변적이며 대변 이식의 성공 여부를 결정하지 않는다²⁴.

생물 안전 캐비닛, isocage 및 모든 재료 및 소모품의 멸균은 프로토콜의 가장 중요한 측면입니다. 기본 케이지 매니퓰레이터는 이산화염소 살균제 세척 단계를 완료할 때 너무 조심해서는 안 됩니다. 생물 안전 캐비닛에 들어가는 모든 것은 멸균제와 표면 액체가 접촉하는 시간이 20분이어야 하며, 작업자 오류가 발생할 경우 모든 재료와 워크스테이션을 완전히 재멸균해야 할 수도 있습니다. 생물 안전 캐비닛을 사용한 후에는 금속 표면의 산화 효과를 줄이기 위해 이산화 염소 살균제와 알코올로 다시 완전히 청소하는 것도 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 무균 사육 및 생물 안전 캐비닛을 갖춘 모든 동물 시설에 널리 적용할 수 있지만, 케이지의 수와 동시에 실행되는 실험에 따라 힘들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 아이소케이지 시스템의 사용률이 높은 시설의 경우 이러한 실험을 수행하는 데 필요한 노력을 크게 줄일 수 있는 노동 집약적인 장비 옵션이 있습니다. 예를 들어, 이러한 목적을 위해 설계된 생물 안전 캐비닛 시스템이 있으며, 여기에는 캐비닛에 부착된 자동 덩크 탱크가 포함되어 있어 각 케이지를 수동으로 청소할 필요가 없습니다. 또한 오토클레이브 이송 챔버를 생물 안전 캐비닛에 부착할 수 있으며, 이를 통해 이산화염소 멸균제에 의한 표면 멸균 없이 오토클레이브 물질을 후드로 직접 이송할 수 있습니다. 이러한 옵션은 비용이 많이 들지만 이러한 실험을 완료하는 데 필요한 시간과 노력을 크게 줄여주며 이 프로토콜의 관련 섹션 내에서 쉽게 대체할 수 있습니다.

이 실험 프로토콜이 실패하는 가장 일반적인 이유는 오염 이벤트입니다. isocages에서 가장 가능성이 높은 오염원은 후드 아래의 이송 및 케이지 교체 공정 중에 발생합니다. 바실러스(Bacillus)와 같은 포자 형성 박테리아와 포도상구균(Staphylococcus) 속의 인간 피부 공생균은 동종케이지(isocages)에 있는 그노토바이오틱스(gnotobiotic) 마우스의 가장 큰 오염 위험이다^26,27. 오염 위험을 제한하기 위해 2주간의 케이지 교체 외에 절대적으로 필요한 경우에만 케이지를 여는 것이 좋습니다. 일부 상황에서는 해당 기간 동안 모든 절차와 개입을 예약할 수 있지만 일부 실험적 접근 방식에서는 반복적인 개방이 필요합니다. 이러한 상황에서는 고도로 숙련된 작업자가 세균이 없는 상태를 성공적으로 유지할 수 있지만, 세균이 없는 상태가 유지되었음을 증명하기 위해 모든 케이지 입구에서 배설물을 수집하고 검사해야 할 수 있습니다. 또한 동물의 건강 비상 사태나 음식이나 물이 부족한 경우 즉시 케이지를 열어야 합니다. 따라서 동물의 건강과 복지, 식품/물 공급 수준을 면밀히 모니터링하여 가능한 한 최소화하는 것이 좋습니다.

반복적인 오염 이벤트가 발생하는 경우, 미생물 성장 영역을 식별하기 위해 생물안전 캐비닛 및 isocages의 표면을 면봉으로 닦는 것이 좋습니다. 작업 표면, 에어 필터, 새시, 측면 및 생물 안전 캐비닛 후드의 개구부, 안전 폐쇄 클램프, HEPA 필터, 통풍구 및 아이소케이지의 내부 표면을 면봉으로 닦습니다. 앞서 설명한 대로 이러한 면봉을 배양하고 미생물이 자라는 부위를 식별합니다. 오염 박테리아 또는 곰팡이는 개별 군체에 대한 Biotyper MALDI-TOF 분석으로 식별할 수 있지만, 그람 염색 또는 분류군에 대한 qPCR도 생쥐의 오염 물질과 환경에서 이러한 오염 물질의 잠재적 원인을 모두 식별할 수 있는 실행 가능한 방법입니다.

이 프로토콜의 함정은 동물이 인간 미생물총(microbiota)에 군집화되어 있는 경우 매우 다양하고 정의되지 않은 미생물군(microbiota)으로 인해 외부 출처의 오염을 감지하는 것이 거의 불가능하다는 것입니다. 오염이 의심되는 경우, 수혜자 마우스 대변에 존재하는 인간 기증자 대변 접종물에 존재하지 않는 분류군을 모니터링하기 위해 여러 시점에 걸쳐 마우스 배설물의 차세대 염기서열분석을 수행하는 것이 좋습니다. 인간 배설물 기증자 대변의 모든 분류군이 수혜 마우스에 서식하는 것은 아니지만, 마우스 배설물에 존재하는 인간 배설물에 존재하지 않는 분류군은 없어야 합니다. 무균 유지 관리 또는 기증자 대변 집락화는 특히 원래 기증자 샘플의 미생물 군집 구성을 알고 있는 경우 범용 16S 프라이머 또는 분류군 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR을 통해 종단적으로 모니터링할 수도 있습니다. 그러나 이 방법은 살아있는 미생물과 죽은 미생물을 구별할 수 없다는 점에서 한계가 있습니다. 거짓 양성 신호를 제거하기 위해 분석을 설계할 때 검증된 무균 대변 대조군을 사용하는 것도 중요합니다.

요약하면, 이 프로토콜은 실험용 격리 케이지에서 무균 마우스의 성공적이고 재현 가능한 장내 미생물총(microbiota) 인간화와 이러한 마우스에서 생존력 보존 인간화 대변 표본의 후속 수집을 가능하게 합니다. 이 접근법은 건강과 질병의 맥락에서 숙주-미생물 상호 작용을 연구하는 데 필수적인 도구이며 isocage 시스템 내에서 추가 실험적 개입을 설계하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 향후 이 모델을 사용하여 인간의 장내 미생물군과 건강 및 질병 간의 많은 연관 연결이 검증될 것으로 예상됩니다.

저자는 이해 상충이 없습니다.

저자들은 그노토바이오틱 축산에 도움을 준 UF Animal Care Services의 무균 서비스 부서, 수의학 및 IACUC 지원을 제공한 Brooke Bloomberg 박사와 Laura Eurell 박사, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 지원한 Josee Gauthier에게 감사를 표합니다. 이 연구는 UF Health Cancer Center Funds(C.J.)와 UF Department of Medicine Gatorade Fund(C.J.)의 일부 지원을 받았습니다. R.Z.G.는 UF Health Cancer Center 기금의 지원을 받았습니다. R.C.N.은 플로리다 대학교(TL1TR001428, UL1TR001427)의 국립보건원(National Institutes of Health) TL1 교육 보조금, 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립암연구소(National Cancer Institute) 팀 기반 학제간 암 연구 교육 프로그램(Interdisciplinary Cancer Research Training Program) 상 T32CA257923 및 UF Health Cancer Center의 지원을 받았습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 UF Health Cancer Center의 지원을 받았으며, Fla. Stat. § 381.915 및 National Institutes of Health의 National Cancer Institute(수상 번호 P30CA247796)에 제공된 주 예산의 일부 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 또는 플로리다 주의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.