הכנה ותחזוקה של ניסוי כלוב איזופוזיטיבי להדרה ביולוגית להשתלת צואה אנושית בעכברים נטולי חיידקים

פרוטוקול זה מתאר את השיטות המומלצות להעברת עכברים ללא חיידקים למבודדים ניסיוניים בכלוב יחיד (איזוקאז'ים) תוך שמירה על תנאים סטריליים. נדונות שיטות להשתלת צואה בעכברים נטולי חיידקים ואיסוף חיידקים ברי קיימא מעכברים "אנושיים" אלה ליישומים נוספים.

עכברים נטולי חיידקים הם כלי מחקר חשוב להבנת תרומתם של מיקרואורגניזמים לבריאות המארח ולמחלות, המאפשר הערכה של התפקיד הספציפי של פרטים, קבוצות מוגדרות או מורכבות של מיקרואורגניזמים בתגובת המארח. גידול עכברים ללא חיידקים ומניפולציה ניסיונית הם יקרים ודורשים צוות מיומן רב וטביעת רגל גדולה במתקני דיור לבעלי חיים. מערכת הכלוב IsoPositive מאפשרת מניפולציה ניסיונית של עכברים נטולי חיידקים בכלובי מבודדים בודדים, אטומים הרמטית, בלחץ חיובי (איזוקאז'ים), מה שמפחית את העלות ומאפשר גמישות רבה יותר במניפולציות ניסיוניות.

כאן, מתואר פרוטוקול להעברת עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים והעברת צואה לאחר מכן מצואה מתורם אנושי לעכברים כדי ליצור עכברים יציבים לטווח ארוך "אנושיים" במעיים למחקרים עתידיים. מתוארים החומרים וההכנות הדרושים לניצול מערכת האיזוקאז', כולל שימוש בחומר מעקר כימי מעקר כלור-דו חמצני לניקוי כלובים, אספקה, ציוד וציוד מגן אישי. נדונות השיטות לאישור הסטטוס נטול החיידקים של עכברים שהועברו וכיצד לקבוע זיהום במערכת הכלוב. נוהל הגידול, כולל מצעים, מזון ואספקת מים, נדון בהמשך. מתוארים הפרוטוקול להכנת תמיסת צואה אנושית והכנסה לעכברים נטולי חיידקים ליצירת עכברים "אנושיים" במעיים, יחד עם איסוף צואה לניטור הרכב הקהילה המיקרוביאלית של עכברים אלה. ניסוי ממחיש כי שבועיים לאחר השתלת צואה אנושית מאפשרת קולוניזציה יציבה של המיקרוביוטה של התורם במארחי העכברים, מה שמאפשר שימוש ניסיוני לאחר מכן. יתר על כן, מתואר איסוף צואת עכברים אנושית באמצעי שימור כדאיות, המאפשר שימוש בניסויים פונקציונליים נוספים. בסך הכל, שיטות אלו מאפשרות הקמה בטוחה ויעילה של קהילות עכברים אנושיות בכלובי גנוטוביוטיקה ניסיוניים למניפולציה נוספת.

עכברים נטולי חיידקים הם כלי חיוני ברפרטואר של חוקרי המיקרוביום, המאפשר לנתח את תרומת המיקרוביוטה במצבי בריאות ומחלות של המארח. עכברים נטולי חיידקים נולדים סטריליים לחלוטין ונשארים אקסניים במשך כל חייהם¹. קולוניזציה של עכברים נטולי חיידקים עם זני חיידקים ספציפיים מאפשרת מחקרים סיבתיים בין טקסונים אלה לבין תפקודים מטבוליים, חיסוניים או פונקציות מארח אחרות 2,3,4,5. יתרון מיוחד הוא היכולת "להאניש" עכברים נטולי חיידקים ברמת המיקרוביוטה על ידי השתלת צואה המתקבלת מתורמים אנושיים, וכאשר הם שוכנים בתנאי מחסום, למנוע זיהום ממיקרואורגניזמים שמקורם במורין. גישה זו אפשרה תגליות חשובות רבות בתחום המיקרוביום, למשל, השפעת המיקרוביום של המעי האנושי על התגובה האימונותרפית לסרטן ^6,7,8.

עם זאת, בעוד שעכברים אנושיים ללא חיידקים הם בעלי ערך רב למאמצי המחקר בתחום המיקרוביום, ישנן מגבלות רבות שעיכבו את ההסתגלות הרחבה יותר של גישה זו. עכברים נטולי חיידקים מגודלים ומתוחזקים במבודדים גדולים קשיחים למחצה או גמישים, אך ניסויים פונקציונליים דורשים התקנה של מיני מבודדים נפרדים, כאשר מיני מבודד אחד מכיל מספר כלובים אך רק בתנאי ניסוי אחד. גישת מיני-מבודד זו מגדילה את טביעת הרגל והעלות של החלל תוך הגבלה חמורה של מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור בניסוי ומספר הניסויים שניתן להריץ במקביל. פתרון מבטיח הוא שימוש במערכת כלוב אינדיבידואלית ומודולרית הנקראת ISOcage P Bioexclusion System (המכונה כאן מערכת איזוקאז')^9,10. מערכת האיזוקאז' מאפשרת מניפולציה ניסיונית של עכברים נטולי חיידקים בכלובי מבודדים בודדים, אטומים הרמטית, בלחץ חיובי, ומאפשרת תנאי ניסוי נפרדים בין כל כלוב ולא בין כל מיני מבודד. עם הטכניקה האספטית המתאימה, ניתן לשכן בעלי חיים באיזוקאז'ים עד 12 שבועות בתנאים נטולי חיידקים או להאניש על ידי השתלת צואה אנושית לשימוש בכל גישה ניסויית תואמת (כלומר, ניתן לבצע בתנאים אספטיים). ניתן להריץ מספר ניסויים עצמאיים במקביל באמצעות מערכת האיזוקאז', וטביעת הרגל והעלות של החלל נמוכות באופן דרמטי מהפעלת ניסויים מרובים על פני מיני-מבודדים.

מטרת גידול עכברים נטולי חיידקים במבודדי גידול סרטים גמישים היא לשמר בזהירות את הסטטוס האקסני¹¹. טכניקות המשמשות לניטור מצב נקי מחיידקים כוללות ספוגיות שגרתיות של משטחי גוף עכברים וחללי הפה, כמו גם איסוף אספטי של דגימות צואה, שגם מתורבות וגם נבדקות על ידי בדיקות מסחריות מבוססות PCR. בדיקות חיידקיות, סרולוגיות ופטרייתיות של דגימות אלה נדרשות כולן כדי לקבוע מצב נקי מחיידקים¹¹. כאשר עכברים נטולי חיידקים מועברים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים לשימוש ניסיוני, העכברים נלקחים ונבדקים כדי לאמת את מצבם ללא חיידקים בעת ההעברה. בדיקות סטריליות איזוקאז' מבוצעות באמצעות איסוף אספטי של דגימות צואה, אשר לאחר מכן מתורבות לאיתור מזהמים חיידקיים, נגיפיים ופטרייתיים. איסוף ורישום קפדני של תוצאות בדיקות הסטריליות הללו מלידה ועד סוף פרוטוקול ניסוי הכרחי כדי לאמת את הסטטוס נטול החיידקים של עכברים אלה.

מערכת האיזוקאז' מורכבת מכלובים בודדים (איור 1), דיסקיות העברה להובלה ממבודדי רבייה (איור 1), ומתלה איזוקאז', שמאכלס את הכלובים (איור 2). כל איזוקאז' מכיל מסנן חלקיקי אוויר עם נצילות גבוהה (HEPA) ברמת הכלוב המותקן על כניסת אוויר האספקה ואטם סיליקון היוצר אטימה אטומה כאשר הוא סגור, ומבטיח שלא יוכלו מזהמים להיכנס לכלוב דרך האוויר (איור 1A). מכסה כלוב זה יכול לשמש כמשטח עבודה סטרילי כאשר הוא מונח הפוך בתוך ארון בטיחות ביולוגית מעוקר (איור 1A). מתלה בתוך הכלוב מכיל את בקבוק המזון והמים (איור 1B). מלקחיים שעברו חיטוי בתוך הכלוב משמשים לכל המניפולציות הדורשות מגע עם משטחי כלוב פנימיים. לכלוב עצמו יש חריצים עבור מחזיק כרטיס כלוב נשלף לזיהוי בעלי חיים מבחוץ וחרירי יניקת אוויר וייצוא העוגנים לתוך מתלה האיזוקאז' (איור 1C-E). סגירה בטוחה clamps ומנעול לשונית על המכסה אוטמים את הכלוב כאשר הוא מוכן לעגינה מחדש על מערכת המתלים (איור 1F). המצע המוצע הוא אלפא-דרי, ומומלץ גם בקתת העשרה ניתנת לחיטוי (איור 1F). דיסקי העברה משמשים להעברת עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה לאיזוקאז'ים, והם מכילים מכסה תא מסתובב עם פתח משולש כדי לאפשר מניפולציה של חיות (איור 1G-H). הדיסקים מגיעים בגדלים קטנים (קוטר 21.6 ס"מ) וגדולים (קוטר 28 ס"מ), שניהם בעלי קיבולת של שמונה עכברים. סרט חיטוי משמש ליצירת אטמים אטומים על ההיקף וחורי האוויר של הדיסק, אשר מבוצעים לפני השרייה בחומר סטרילנטי והובלה בשקית ספוגה בסטרילנט (איור 1I). למערכת ארון התקשורת עצמה יש מסך לניטור מפוחי האוויר, מצב מסנן HEPA ברמת ארון התקשורת וכוח סוללת חירום עבור ארון התקשורת, שהם כולם מאפיינים כלולים של המערכת (איור 2A). מד Magnehelic סגור מציג את הלחץ החיובי שנשמר על ידי מערכת הכלובים, ומחוון עגינה חזותי אוטומטי מראה את מצב העגינה של הכלובים (לשונית צהובה החוצה פירושה שאין כלוב מעוגן, או שהרציף לא הצליח) (איור 2B-D). כמו כן, הכרחי למניפולציה של איזוקאז'ים הוא ארון בטיחות ביולוגית מוסמך סטנדרטי.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השיטות המתאימות להעברה מוצלחת של עכברים נטולי חיידקים ממבודדי רבייה בתנאים אספטיים לאיזוקאז'ים תוך שמירה על סטטוס נקי מחיידקים, האנשה של עכברים נטולי חיידקים עם תרחיץ צואה מתורם אנושי, ואיסוף צואה מעכברים השוכנים באיזוקאז' לאישור מצב נקי מחיידקים או שימור כדאיות למחקרים פונקציונליים נוספים. בדוגמה זו, עכברים נטולי חיידקים עוברים האנשה עם דגימות צואה מאוגדות מנבדקים אנושיים שטופלו באימונותרפיה לסרטן ריאות ודיכוטומיים כמגיבים או לא מגיבים לטיפול. במקרה זה, פנוטיפ התגובה לתגובה האימונותרפית הועבר על ידי האנשה של מיקרוביוטת המעיים לעכברים המקבלים, שלאחר מכן ניתן היה לחסן אותם עוד בתאי גידול ולטפל בהם באימונותרפיה. ניתן להתאים בקלות את פרוטוקול התרחיץ הצואתי האנושי לכל צואה של תורם אנושי או לכל מודל פרה-קליני של מחלה שהחוקר רוצה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להעביר כל מיקרוביוטה של תורם צואה אנושי למארח נטול חיידקים, מה שמאפשר חקירה נוספת של תפקיד המיקרוביוטה בבריאות ובמחלות.

איור 1: דיאגרמה סכמטית של דיסקות איזוקאז' והעברה. (A) מבט מלמעלה למטה של הצד התחתון של מכסה הכלוב, עם תוויות המציינות את המיקום של מסנן HEPA הפנימי ברמת הכלוב ואטם אטם הסיליקון. (ב) מבט מלמעלה למטה על פנים הכלוב, עם תוויות המציינות את מכסה מוט התיל, בקבוק המים הפנימי והזרבובית, ואת המיקום במתלה להחזקת חמין הניתן לחיטוי. (ג) מבט קדמי של הכלוב המציג חריצים למחזיק כרטיס הכלוב. (ד) מלמעלה למטה view של כלוב מלא עם המכסה למעלה, המראה כיצד מסנן HEPA מותקן על פיית כניסת האוויר. (ה). מבט אחורי של הכלוב המציג חרירי יניקת וייצוא אוויר העוגנים למערכת מתלה האיזוקאז'. (F) מבט רוחבי של כלוב מלא עם מכסה למעלה, עם תוויות המציינות את מהדקי הסגירה הבטוחים במצב פתוח, עם לשוניות לבנות על כל מהדק שנועלות אותם במקומם. פנים הכלוב מראה תשתית אלפא-דרי בשכבות בתחתית, ובקתת העשרה מוצעת שהונחה בתשתית. (G) מבט מלמעלה למטה על דיסקי העברה עם מכסה למעלה. (H) מבט מלמעלה למטה על החלק הפנימי של דיסק ההעברה, שמראה את מכסה התא המסתובב עם פתח משולש שמאפשר מניפולציה של חיות. (I) מבט רוחבי של דיסק העברה מורכב במלואו המראה מיקום של סרט אוטוקלאב, היוצר אטימה אטומה במהלך ההעברה ממבודד רבייה לאיזוקאז'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דיאגרמה סכמטית של מערכת ארונות התקשורת של איזוקאז'. (A) ארון תקשורת שלם עם כלובים מעוגנים ותווית המציינת את מסך הניטור עבור מצב מפוח אוויר, מצב מסנן HEPA וסוללת חירום. בצד השמאלי התחתון של המתלה נמצא החריץ למסנן HEPA ברמת המתלה. (ב) מד מגנהלי מצורף המראה את הלחץ החיובי הנשמר על ידי המתלה. (ג) איזוקאז' מעוגן ללא מחוון עגינה צהוב נראה לעין, המדגים חיבור מוצלח בין המתלה לחרירי האוויר. (ד) חריץ ריק בארון התקשורת, עם מחוון עגינה חזותי אוטומטי גלוי לעין המציין שאין מתלה במקומו ואין חיבור של חרירי האוויר לאיזוקאז'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת פלורידה (UF) ובוצעו במתקני טיפול בבעלי חיים של UF (פרוטוקול IACUC #IACUC202300000005). מושבות מסוג בר נטול חיידקים (GF WT; עכברי C57BL/6) גודלו והוחזקו במבודדים על ידי החטיבה ללא חיידקים של UF Animal Care Services. עכברי GF WT מעורבים הועברו ממבודדי רבייה והוכנסו למערכת ISOcage P Bioexclusion כדי לאפשר מניפולציה מיקרוביאלית.

דגימות צואה אנושיות התקבלו ממחקר תצפיתי פרוספקטיבי שאסף דגימות צואה אורכיות מחולים שקיבלו טיפול במעכב מחסום חיסוני (ICI)¹². הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים לאחר אישור המחקר על ידי Advarra IRB (MCC#18611, Pro00017235). הנבדקים קיבלו והשלימו ערכת איסוף צואה של מדיום הובלה דנטלי נוזלי (LDTM) שנועדה לשמר את כדאיות החיידקים למחקרים פונקציונליים. הערכת התגובה אפיינה n=4 דגימות כמגיבים (R) ו-n=6 כלא מגיבים (NR). דגימות המטופלים ההומוגניות שהשתמרו ב-LDTM הופשרו בנפרד, כל אחת הוכנסה לתא אנאירובי למשך לא יותר מ-90 שניות ונאספה על ידי פנוטיפ תגובה (R: n = 4, NR: n = 6). הדגימות שנאספו לאחר מכן הוקפאו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש בפרוטוקול זה. כדי לקבוע את ספירת היחידות היוצרות מושבה אנאירובית (CFU) של צואת התורם, הצואה של כל נבדק דוללה באופן סדרתי ל-1 × ^10-5, ו-10 מיקרוליטר מכל דילול צופו בשכפול על צלחות אגר של עירוי לב מוח אנאירובי (BHI) ו-Luria Bertani (LB) וספירת CFU לגרם צואה מוערכת. CFU שווה מכל נבדק נאסף לדגימות חיסון צואה עבור גבאז' לעכברים.

1. הכנת כלובים וחיטוי

1. הכנת איזוקאז'
   1. מלאו מראש כלובים עם ~500 מ"ל של דיאטת 2018SX או כל דיאטה מועשרת רצויה לחיטוי ושכבו את החלק התחתון במצעי ALPHA-dri. הניחו בקתת העשרה הניתנת לחיטוי לתוך מיטת הכלוב. הנח בקבוק מים וזרבובית ריקים ולא אטומים ומלקחיים ארוכים בעלי קצה רחב על גבי מתלה החוט.
   2. הנח אינדיקטור ביולוגי דו-מיני לתוך המזון בתוך כלוב אחד בכל מחזור חיטוי. הנח רצועת אינטגרטור כימי על החלק החיצוני של כל כלוב.
   3. חיטוי הכלובים במחזור ואקום למשך 45 דקות ב-121 מעלות צלזיוס ומינימום של 15 PSI ואחריו זמן ייבוש של 30 דקות. עקרו את הכלובים באמצעות מתלה טיהור של ארגון התקינה הבינלאומי (ISO) המאפשר לכלובים להישאר אטומים ולעבור קיטור דרך מסנן HEPA הפנימי, השומר על הסביבה הסטרילית עד לפתיחת הכלוב.
   4. מלאו בקבוקי 1 ליטר במי שתייה, אטמו במכסי גומי והניחו פס אינטגרטור כימי על פני הבקבוק. חיטוי ב-121 מעלות צלזיוס ומינימום של 15 PSI למשך 45 דקות, תוך שימוש בתוכנית הפליטה האיטית של נוזלים.
   5. בדוק ויזואלית את האינטגרטורים הכימיים המוצמדים לכל כלוב לאימות מיידי של פרמטרי החיטוי המתאימים.
      הערה: יש להסיר את האינדיקטור הביולוגי עם הפתיחה הראשונה של האיזוקאז' בתנאים סטריליים. דגרו את האינדיקטור הביולוגי למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והתבוננו בשינויי צבע. שינוי צבע חי מהתמיסה השקופה המקורית בכחול/סגול לנוזל צהוב או עכור מצביע על צמיחה מיקרוביאלית. אם המחוון נשאר ברור ובצבע כחול/סגול, זהו אישור לסטריליות המלאה של פנים הכלובים באותו מחזור חיטוי.

2. תכשיר מעקר כלור-דו חמצני

זהירות: חומר מעקר כלור-דו חמצני הוא מאכל ביותר לאחר הפעלתו. מעקר כלור-דו חמצני מופעל פג 24 שעות מערבוב המפעיל עם הבסיס. חומר מעקר כלור-דו חמצני מייצר אדים, שעלולים לגרות את הריריות ויגרמו לגירוי במגע עם העור. ודא שלחדר להכנת חיטוי יש גישה לכיור ואוורור מתאים. לבש משקפי מגן, מכונת הנשמה וכפפות עמידות בפני כימיקלים בעת עבודה עם חומר מעקר כלור-דו חמצני בנוסף לציוד המגן האישי הנדרש (PPE) למתקן הדיור לבעלי חיים.

1. בסיס ערבוב ומפעיל
   1. כדי ליצור נפח סטנדרטי של 6 ליטר של מעקר כלור-דו חמצני, יש למדוד תחילה 1 ליטר של בסיס מעקר כלור-דו חמצני בצילינדר מדורג של 1 ליטר ולשפוך למיכל טבילה בנפח 20 ליטר.
   2. בעזרת אותו גליל מדורג, מודדים ושופכים 4 ליטר מי ברז למיכל הטבילה.
   3. הניחו בצד את הגליל המדורג המשמש לבסיס ולמים. השתמש בצילינדר מדורג חדש כדי למדוד 1 ליטר של מפעיל מעקר כלור-דו חמצני ולשפוך אותו למיכל הטבילה.
   4. לאחר הוספת המפעיל למיכל, השתמש בצילינדר המדורג כדי לערבב את תכולת המיכל.
2. ההפעלה
   1. הנח את המכסה על מיכל הטבילה ותייג אותו כמעקר כלור-דו חמצני עם התאריך והשעה שבהם נוסף המפעיל ושם הצוות שהכין אותו. אם תרצה, ניתן להשתמש בגליל המדורג המשמש לערבוב הסטרילנט להעברת 1 ליטר לבקבוק ריסוס.
   2. העבר את מיכל הטבילה ובקבוקי הריסוס לחדר המגורים לבעלי חיים, שם נמצאים מתלה ה-Isocage והכלובים. החומר המעקר כלור-דו חמצני המופעל חייב לשבת לפחות 20 דקות לפני השימוש על מנת להבטיח הפעלה מלאה.
      הערה: למניפולציה של כמויות גדולות של כלובים (>9), ניתן להכין עד 12 ליטר בבת אחת במיכל הטבילה. למניפולציה של כלוב אחד או במקרה חירום, ניתן להכין 1.2 ליטר של חומר מעקר כלור-דו חמצני במיכל קטן יותר ולאחר מכן להעביר לבקבוקי ריסוס של 2 1 ליטר. מומלץ להכין את הסטרילנט לפחות שעה אחת לפני ההעברה הצפויה של עכברים נטולי חיידקים.

3. עיקור

1. דון PPE
   1. כמניפולטור הכלוב העיקרי, חבשו משקפי מגן, מכונת הנשמה, כפפות עמידות לכימיקלים, חלוק כירורגי סטרילי, בופנט, כיסויי שרוולים וכיסויי נעליים. ללבוש קרצוף מתחת ל-PPE מכיוון שכל מגע של בד עם חומר מעקר כלור-דו חמצני יגרום להכתמה נרחבת.
   2. מומלץ עוזר למניפולטור הכלוב הראשי. בקש מהעוזר ללבוש את אותו PPE כמו המניפולטור הראשי בכלוב, אם כי הוא עשוי ללבוש חלוק כירורגי לא סטרילי.
2. הכנת ארון הבטיחות הביולוגית
   1. מניחים 10 מגבונים לתוך מיכל הטבילה המעקר כלור-דו חמצני ומוודאים שהם ספוגים לחלוטין.
   2. העבירו את המגבונים הספוגים לארון הבטיחות הביולוגית והשרו את כל משטחי הארון בסדר הבא מאחור לחזית: משטח עבודה שטוח, צד שמאל, גב מכסה המנוע, צד ימין וזכוכית פנימית קדמית. בצע השרייה ללא מגע של המשטחים הלא מוגנים של ארון הבטיחות הביולוגית על ידי סחיטת המגבונים על משטחים אלה מבלי לגעת בהם.
   3. לאחר סבב ניקוי אחד, החזירו את המגבונים למיכל הטבילה הסטרילנטי כלור-דו חמצני להשרות.
3. הכנת האיזוקאג'ים
   1. הכן שקית ניילון גדולה על ידי מילויה בלפחות 100 מ"ל של חומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות גליל מדורג ונער את השקית כדי להבטיח שכל המשטחים הפנימיים ספוגים. הנח את השקית על כל משטח ישר.
   2. הסר איזוקאז' בודד מהמתלה והנח אותו במיכל הטבילה המעקר כלור-דו חמצני כך שכל משטח בכלוב יבוא במגע עם הנוזל. השתמש במגבונים הספוגים במיכל כדי לשפשף עוד יותר את משטחי הכלוב כדי להבטיח מגע מלא עם נוזלים.
   3. לאחר השריית הכלוב, בקש מהעוזר לפתוח את שקית הניילון הספוגה. הכניסו את הכלוב לתיק, ובקשו מהעוזר לסגור מיד את הפתח. רססו את פתח השקית בחומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות בקבוק הריסוס. בצע הליך זה עבור כל כלוב שיש להשתמש בו; עד ארבעה כלובים יכולים להיכנס לתיק יחיד בגודל 36 אינץ' 32 אינץ' 48 אינץ'.
   4. טבלו כמה בקבוקי מים מעוקרים בנפח 1 ליטר לפי הצורך (1 ליטר מים ל-2 כלובים) במיכל הטבילה הסטרילנטי כלור-דו חמצני, ולאחר מכן הניחו אותם בשקית ניילון ספוגה נוספת. לאחר שכל האספקה הוכנסה לשקית, סגור את השקית ורסס את פתח השקית בחומר מעקר כלור-דו חמצני באמצעות בקבוק הריסוס.
   5. לאחר שכל הכלובים והאספקה ארוזים, טבלו את הכפפות העמידות לכימיקלים בחומר חיטוי כלור-דו חמצני (כמה שיותר רחוק מהכפפות מבלי להגיע לפתח).
4. תקופת עיקור של 20 דקות
   1. עיקור מלא דורש מינימום של 20 דקות של זמן מגע עם נוזלים. ברגע שהפריט האחרון עוקר ושקית ההשריה מפלסטיק נסגרת, בקש מהעוזר להגדיר טיימר של 20 דקות. ודא שלאחר הפעלת הטיימר, הכפפות העמידות לכימיקלים אינן נוגעות בשום משטח שאינו ספוג במעקר כלור-דו חמצני.
   2. בצע את תהליך העיקור של ארון הבטיחות הביולוגית (שלב 3.2) שוב ושוב עד שהטיימר מציין שחלפו 20 דקות.
   3. בקש מהעוזר לנער לעתים קרובות את המשטחים החיצוניים של שקית הניילון הספוגה כדי להבטיח מגע נוזלי עקבי עם משטחי הכלוב והבקבוק שבתוכה.
   4. לאחר פרק הזמן של 20 דקות, בקש מהעוזר לפתוח את שקית הניילון הספוגה כדי לחשוף את הכלובים ובקבוקי המים המעוקרים, תוך הקפדה לגעת רק במשטחים החיצוניים של השקית.
   5. בעזרת הכפפות המעוקרות העמידות לכימיקלים, העבירו כל כלוב ובקבוק לארון הבטיחות הביולוגית המעוקר. אם יש יותר מדי כלובים מכדי להיכנס לארון הבטיחות הביולוגית, השאירו את הכלובים הנותרים בשקיות הניילון מכיוון שהם יישארו סטריליים כל עוד פתח שקית הניילון סגור וספוג בחומר מעקר כלור-דו חמצני בין כל פתח.

4. העברת עכבר ללא חיידקים

1. הכנת האיזוקאג'ים
   1. כדי לפתוח את האיזוקאז' האטום הרמטית, הרם את הלשוניות הלבנות בשני המהדקים בצידי המכסה ולאחר מכן משוך החוצה כל מהדק הצידה. המכסה חייב להיות נקי מהחלק התחתון של הכלוב על מנת להרים את המכסה מהכלוב. הנח את המכסה הפוך משמאל לכלוב והשתמש בו כתחנת עבודה סטרילית.
      הערה: חלופה לשימוש במכסי כלוב או בחלק הפנימי של שקיות מכשירים חיטוי כמשטח עבודה סטרילי היא שימוש בווילונות חיטוי, המספקים שטח פנים גדול יותר ומונעים זיהום לא מכוון של מכסה הכלוב אם נעשית שגיאה.
   2. בעזרת המלקחיים הסטריליים שנמצאים בתוך הכלוב על גבי מתלה החוט, הסר את בקבוק המים הריק והנח אותו בחלק הפנימי של המכסה. פתח את בקבוק המים בנפח 1 ליטר על ידי הסרת אטם הגומי, ושפך את המים לבקבוק המים כדי למלא אותו. הנח את הזרבובית על בקבוק המים באמצעות המלקחיים ולחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לאטום.
   3. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להרים את מתלה החוט ולהחזיר אותו כמה סנטימטרים לאחור כדי לאפשר פתח לתחתית הכלוב. הנח את המלקחיים הסטריליים על מתלה החוט, וודא שהידיות לא יבואו במגע עם משטחי הכלוב.
2. שימוש בדיסק העברה
   הערה: צוות מיומן ללא חיידקים אחראי על הטיפול והתחזוקה של מבודדי הרבייה. בהתחשב בסיכונים הכרוכים בפתיחת מבודדי רבייה, צוות זה מבצע את עיקור דיסק ההעברה, הכנה והעברה של עכברים נטולי חיידקים ממבודדים לאיזוקאז'ים. כדי לתאר בקצרה את התהליך, מכינים דיסקי העברה בצילינדר הניתן לחיטוי כדי לאפשר עיקור. אינדיקטורים ביולוגיים משמשים לאימות עקרותם. סרט לאיטום דיסקי ההעברה עובר חיטוי גם בתוך הגליל. הגליל המעוקר התוחם את החומרים הללו מחובר דרך שרוול העברה למבודד, ועכברים מועברים מהכלובים לדיסק. לאחר מכן מניחים את המכסה על הדיסק, ומשתמשים בסרט חיטוי ליצירת אטימה אטומה על היקף הדיסק וחורי האוויר. הדיסק האטום ממוקם מיד ביציאת היציאה של המבודד. לאחר מכן סוגרים את מכסה היציאה של המבודד הביתי, והחלק החיצוני של הדיסק נסגר ביסודיות בחומר סטרילנטי ומכניס אותו לשקית ספוגה בסטרילנט, מנוטרת במשך 20 דקות כדי להבטיח טיהור מלא. צוות גידול ללא חיידקים מעביר את הדיסקים הללו לצוות המחקר. לא ניתן לשמור עכברים בדיסק האטום יותר מ-30 דקות מרגע איטום דיסק ההעברה, ולכן חיוני שכל השלבים הקודמים בפרוטוקול זה הושלמו מספיק זמן לפני הגעת דיסק ההעברה.
   1. עם קבלת דיסק ההעברה, בקש מהעוזר להחזיק ולפרוק חלקית את מכסה הפלסטיק כך שהמשטח הספוג של דיסק ההעברה ייחשף אך לא ייגע בו.
   2. עם קבלת דיסק ההעברה, בקש מהעוזר להחזיק ולפרוק חלקית את מכסה הפלסטיק כך שהמשטח הספוג של דיסק ההעברה ייחשף אך לא ייגע בו.
   3. לבישת הכפפות העמידות לכימיקלים הספוגות בסטרילנט כלור-דו חמצני, הסר את דיסק ההעברה מעטיפת הפלסטיק, הקפד לא לגעת בשום משטח שאינו ספוג בסטרילנט. לאחר מכן, הנח את דיסק ההעברה על המשטח השטוח של ארון הבטיחות הביולוגית המעוקר.
   4. כדי לפתוח את דיסק ההעברה, קלף את הסרט, אטום את היקף הדיסק והשליך אותו מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית. הסר את המכסה של דיסק ההעברה והשליך אותו מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית.
   5. בתוך דיסק ההעברה יש מכסה תא מסתובב עם פתח יחיד. השתמש במלקחיים הסטריליים שהונחו קודם לכן על מתלה התיל של הכלוב כדי לתפעל את מכסה התא הזה כדי להזיז את הפתח לעכבר הדרוש להעברה.
3. העברת עכברים מדיסק לאיזוקאז'
   1. בעזרת המלקחיים, אחוז בבסיס זנב העכבר דרך הפתח במכסה הדיסק מפלסטיק, והרם והעביר את העכבר לתוך האיזוקאז' דרך החלל שנפתח קודם לכן בין מתלה התיל לכלוב. חזור על הפעולה עבור כל העכברים המיועדים לכלוב זה.
   2. לאחר שכל העכברים הועברו לאותו איזוקאז', החלף את מתלה החוט באמצעות המלקחיים. לאחר מכן, הרם את מכסה הכלוב והנח אותו בחזרה על גבי הכלוב באמצעות המלקחיים.
   3. הרם כל מהדק של מכסה הכלוב כלפי מעלה והורד בזהירות מעל דפנות הכלוב, ולאחר מכן דחף כלפי מטה את הלשוניות הלבנות כדי לאטום את מכסה הכלוב.
   4. לאחר איטום הכלוב, בקש מהעוזר לרסס כל זרבובית של אתר העגינה על מתלה הכלוב בחומר חיטוי כלור דו חמצני. לאחר מכן, הסר את הכלוב ממכסה המנוע והעביר אותו לעוזר, שיוכל לעגן את הכלוב על המתלה.
   5. חזור על שלבים אלה עבור כל עכבר בדיסק ההעברה.
4. ניקוי ארון הבטיחות הביולוגית
   1. עם השלמת כל העברות העכבר לאיזוקאז', רוקנו את מכסה המנוע מכל פסולת ונגבו לחלוטין עם מגבונים ספוגים בסטרילנט כלור דו חמצני.
   2. נגב את מכסה המנוע באלכוהול איזופרופיל כדי להסיר שאריות של כלור-דו חמצני. החלל שמתחת למשטח העבודה של מכסה המנוע אוסף נפח גדול של חומר עיקור מתהליך העיקור. הסר זאת באמצעות ספיגה עם מגבונים יבשים ונגב באלכוהול איזופרופיל.
   3. השלך חומר מעקר כלור-דו חמצני נוזלי דרך ניקוז הכיור 24 שעות לאחר ההפעלה. השלך חומרים מוצקים מזוהמים בסטרילנט כפסולת רגילה.
      הערה: עכברים נטולי חיידקים המועברים לתנאי איזוקאז' נותרים למשך שבוע להתאקלם בסביבתם החדשה לפני כל התערבות. זה מפחית את הלחץ שחווים בעלי החיים, מה שעלול להפריע לתוצאות המחקר. בתום תקופת ההסתגלות הזו של שבוע אחד, אספו צואה כמתואר בשלב 6 כדי לאשר את הסטטוס נקי מחיידקים לפני כל התערבות.

5. החדרה אוראלית של תמיסת צואה אנושית לעכברים נטולי חיידקים

1. הכנת ציוד חיטוי
   1. הנח מחטי גבאז' דרך הפה בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר) ומזרקים סטריליים של 1 מ"ל בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר) יום אחד לפני הליך העיקור דרך הפה. הכניסו את כוסות הפוליפרופילן הללו ו-600 מ"ל (1 לכל עכבר) וזוג מלקחיים ארוכים לתוך שקית בטוחה לחיטוי ועיקרו באמצעות חיטוי.
   2. מיד עם הוצאת השקית מהחיטוי, אטמו את השקית בנייר דבק ואחסנו אותה עד למחרת.
2. הכנת תרחיץ צואה אנושי
   1. ביום הגוואג', העבירו צואה אנושית הומוגנית ומאוחסנת באמצעי שימור אנאירוביים (במקרה זה, אמצעי הובלה דנטלי נוזלי) מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס לתא האנאירובי. לדלל חומר צואה הומוגני כ-1:10 בתמיסת מלח סטרילית ואנאירובית בצינור חרוטי של 10 מ"ל.
   2. אטום את הצינור המכיל את תרחיץ הצואה האנושי עם פרפילם, הומוגניזציה על ידי מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-200 גרם למשך 5 דקות כדי ליישב חלקיקים.
   3. החזר את הצינור לתא האנאירובי והעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי נוסף של 10 מ"ל. אטמו את הצינור המכיל את הסופרנטנט הצואתי האנושי עם פרפילם, הוציאו אותו מהתא האנאירובי והניחו אותו במיכל משני חסין דליפות. העבירו את המכולה יחד עם שקית החיטוי של ציוד הגאווג' למקום המגורים לבעלי החיים.
      הערה: חיוני להעריך את סך ה-CFU/מ"ל של הצואה האנושית המיועדת לגזע למטרות דיווח. לא ברור מהו עומס ה-CFU המינימלי כדי להבטיח קולוניזציה מספקת, אך CFU גבוה יותר מוביל להשתלה טובה יותר של צואה^{תורם 13}. אם עומס ה-CFU של חומר צואה אנושי מביא לשיעורי חריטה נמוכים, זכור דגימות צואה אנושיות. השימוש באמצעי שימור כדאיות ישפר את התאוששות ה-CFU מדגימות צואה שנאספו. כדי לקבוע את ספירת ה-CFU האנאירובית/אירובית של צואת התורם, יש לדלל את הדגימה באופן סדרתי ^{ל-1 x 10-5} ולצלחת 10 מיקרוליטר מכל דילול בשכפול על צלחות אגר BHI ו-LB אירוביות ואנאירוביות. לאחר 24 שעות (אירובי) ו-48 שעות (אנאירובי), ספרו את ה-CFU לגרם צואה.
3. הכנת האיזוקאג'ים
   1. חזור על שלבים 2 ו-3, כאשר ההבדל היחיד כעת הוא שיש עכברים השוכנים בכלובים אלה, ויש להקפיד שתוך 30 דקות מהסרת המתלה, כל איזוקאז' יוכנס למכסה המנוע המעוקר והמכסה מאוורר כדי לאפשר זרימת אוויר לעכברים.
   2. עקר את שקית חומר הגאווג' החיטוי ואת צינור התרחיץ הצואתי האנושי משלבים 5.1 ו-5.2 באמצעות רוויה מעקרת כלור-דו חמצני באופן דומה לבקבוקי המים (כלומר, טבלו אותם בחומר סטרילנטי ולאחר מכן הניחו אותם בשקית ספוגה בסטרילנט).
   3. העבירו את האיזוקאז'ים ואספקת הגוואג' דרך הפה לארון הבטיחות הביולוגית לאחר השלמת תקופת העיקור של 20 דקות. נקב את שקית האספקה שעברה חיטוי על ידי דחיפת השקית כנגד המלקחיים הארוכים הכלולים בפנים, ולאחר מכן הסר את האספקה והשליך את השקית מחוץ למכסה המנוע.
4. גבאג'
   1. לבשו חלוק כירורגי סטרילי חדש וכפפות כירורגיות סטריליות במקום הכפפות העמידות לכימיקלים על מנת למנוע מגע של שאריות כלור-דו חמצני עם עכברים. בקש מהעוזר לעזור בתהליך זה במידת הצורך.
   2. הכן את מחטי הגוואג' על ידי פתיחת כל שקית עיקור והשתמש בחלק הפנימי של השקית כמשטח מנוחה יבש וסטרילי. חבר את מחט הגאווג' לכל מזרק, פתח את צינור התרחיץ הצואתי ומשוך 200 מיקרוליטר של תרחיץ צואה לכל מזרק.
   3. בעזרת מלקחיים, אחוז בבסיס הזנב של עכבר בודד בכלוב והנח אותו על מתלה החוט. רסנו בעדינות את העכבר על ידי שפשוף, ותוך כדי החזקת העכבר במצב אנכי זקוף, הכניסו את המחט והזריקו בעדינות את תרחיץ הצואה, ולאחר מכן הסרה מיידית של המחט.
   4. הנח את העכבר ישירות לתוך אחת הכוסות המעוקרות להשגחה. חזור על התהליך עבור כל עכבר בכלוב. לאחר שכל העכברים קיבלו את הגוואג', השתמשו במלקחיים כדי להזיז כל עכבר בחזרה למיטת הכלוב ולאטום את הכלוב כמתואר בשלבים 4.3.2-4.3.4.
      הערה: במקרים בהם נעשה שימוש בשתי תמיסות צואה נפרדות או יותר, נדרש עיקור מחדש מלא של ארון הבטיחות הביולוגית והכלובים והחומרים הנדרשים. במקרים בהם קבוצת עכברים נשארת נקייה מחיידקים, מומלץ שעכברים אלה יקבלו את הביקורת שלהם לפני כל קבוצה אחרת.
   5. בצע את ההליך בשלב 4.4 כדי להיפטר מחומרים מעקרים ומעקרים כלור-דו חמצני. התייחס לכל החומרים המזוהמים בתמיסת צואה אנושית כפסולת ביו-רפואית והשליך אותם בהתאם לנהלי הבריאות והבטיחות הסביבתיים.

6. איסוף צואה מעכברים מואנשים לשימור כדאיות

1. הכנת ציוד חיטוי
   1. יש להניח מלקחיים קצרים בעלי קצה רחב בשקיות עיקור אטומות עצמיות (1 לכל עכבר), כוסות פוליפרופילן בנפח 600 מ"ל (1 לכל עכבר) וזוג מלקחיים ארוכים לתוך שקית בטוחה לחיטוי ולעקר באמצעות חיטוי יום אחד לפני הליך איסוף הצואה.
   2. מיד עם הוצאת השקית מהחיטוי, אטמו את השקית בנייר דבק ואחסנו אותה עד למחרת.
2. הכנת צינור מדיה לשימור
   1. בחר אמצעי שימור כדאיות אנאירובית (כאן נעשה שימוש בקארי בלייר). יש להכניס 1 מ"ל של אמצעי שימור לצינורות סטריליים עם מכסה בורג של 2 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית. יחס של 1:10 צואה:מדיה מומלץ לשימור אופטימלי.
   2. סמן מראש כל צינור בטוש קבוע, אך שים לב שחשיפה למעקר כלור-דו חמצני עלולה להסיר תוויות סמן קבועות ממשטחי פלסטיק. שיטה נוספת היא להשאיר את הצינורות ללא תווית ולבקש מהעוזר לתייג שפופרות מיד לאחר האיסוף לפני ההקפאה.
   3. הנח את הצינורות הללו במתלה צינור פוליפרופילן רגיל כדי לאפשר לאחסן את הצינורות זקופים תוך מתן אפשרות לעיקור על ידי מגע עם מעקר כלור-דו חמצני.
3. כלובי עיקור וארון בטיחות ביולוגית
   1. חזור על שלבים 2 ו-3 כדי לעקר איזוקאג'ים וארון הבטיחות הביולוגית. שוב, הקפד לוודא שתוך 30 דקות מהסרת המתלה, כל איזוקאז' מונח לתוך מכסה המנוע המעוקר, והמכסה מאוורר כדי לאפשר זרימת אוויר לעכברים.
   2. בנוסף, יש לעקר את שקית האספקה והמתלה המכילים צינורות מוכנים באמצעות רוויה מעקרת כלור-דו חמצני ולהניח אותם בשקית הניילון הספוגה המכילה את הכלובים. המטרה היא מגע נוזלי מלא עם כל המשטחים של כל צינור והמתלה עצמו.
4. איסוף ואחסון דגימות צואה
   1. העבר את האיזוקאז'ים, האספקה החיטוי ומתלה הצינורות לארון הבטיחות הביולוגית לאחר השלמת תקופת העיקור של 20 דקות. נקב את שקית האספקה שעברה חיטוי על ידי דחיפת השקית כנגד המלקחיים הארוכים הכלולים בפנים, הסר את החומרים המתכלים והשליך את השקית מחוץ למכסה המנוע.
   2. לבשו חלוק כירורגי סטרילי חדש וכפפות כירורגיות סטריליות במקום הכפפות העמידות לכימיקלים על מנת למנוע מגע של שאריות כלור-דו חמצני עם עכברים. בקש מהעוזר לסייע בתהליך זה אם תרצה.
   3. הכן את מלקחיים עם קצה קהה על ידי פתיחת השקיות ושימוש במשטח השקית הפנימי כאזור סטרילי. הנח את מתלה הצינור על פני מכסה המנוע.
   4. בעזרת מלקחיים ארוכים, תפסו את בסיס הזנב של עכבר בודד בכלוב והניחו אותם ישירות לתוך אחת הכוסות המעוקרות לתצפית. חזור על תהליך זה עבור כל עכבר בכלוב.
   5. התבונן בעכברים עד שנוצרו לפחות שני כדורי צואה טריים.
      1. בעזרת מלקחיים עם קצה קהה, הרם את כדורי הצואה והנח אותם ישירות לתוך הצינור. אטום מיד את מכסה מכסה הבורג והעביר אותו לעוזר.
      2. בקש מהעוזר לתייג את הצינור ומיד להומוגניזציה של הצואה באמצעות מערבולת. לאחר ההומוגניות, הקפיאו את הצינור בחנקן נוזלי ואחסנו לטווח ארוך בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   6. חזור על תהליך איסוף הצואה עבור כל עכבר בכלוב. החלף כל עכבר בכלוב הביתי לאחר איסוף הצואה, ועגן מחדש את הכלובים על המתלה שלהם. חזור על שלב 4.4 כדי לנקות את מכסה המנוע ולהשליך פסולת.

דגימות צואה אנושיות, שנאספו על ידי פנוטיפ מגיב ICI ופנוטיפ שאינו מגיב (שתואר קודם לכן בפרוטוקול), חולקו לעכברי GF-WT מעורבים ששוכנו ב-3 איזוקאז'ים לקבוצה (n = 1-2 עכברים לכלוב, n = 6 למגיב ו-n = 5 ללא-מגיבים). עכברים הורשו להתאקלם במשך שבוע לאחר ההעברה. לאחר מכן נאספו דגימות צואה מהעכברים האלה (תנאים נטולי חיידקים). לאחר מכן עכברים נלקחו עם 1 × 10⁷ CFU של צואה אנושית מגיבים או לא מגיבים. לאחר מכן הצואה נאספה 1, 2 ו-4 שבועות לאחר הגאווג'. לדגימות צואה יש שיעור זיהוי של 100% של מזהמים בעכברים נטולי חיידקים, ולכן אין צורך לבדוק את מצעי הכלוב, המים וכו', בנוסף לדגימות הצואה¹⁴. כדי לאשר את הסטטוס נקי מחיידקים של עכברים אלה שבוע לאחר ההעברה, לפני השתלת צואה אנושית, כדור צואה אחד מכל עכבר נאסף, נשקל ולאחר מכן הועבר מיד לתא אנאירובי. כל דגימת צואה הושעתה מחדש ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים ואנאירוביים עם פוספט, ואחריו הומוגניזציה ידנית באמצעות מנוע אלחוטי Pellet Pestle ומיקסרים סטריליים ואוטומטיים. לאחר מכן הצואה ההומוגנית דוללה באופן סדרתי ל-1 ×-^10-5, ו-10 מיקרוליטר מכל דילול צופו בשכפול על צלחות אגר BHI אנאירוביות. לאחר מכן כל דילול הוסר מהתא האנאירובי וצופה באופן זהה על לוחות אגר BHI בתנאים אירוביים. לוחות אנאירוביים נאטמו בפרפילם והודגרו ב-37 מעלות צלזיוס בתא האנאירובי למשך 48 שעות, בעוד שפלטות אירוביות הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור אירובי למשך 24 שעות. מעמד נקי מחיידקים אושר בעכברים אלה על ידי היעדר מוחלט של חיידקי צואה הניתנים לתרבית בכל דילול ובכל תנאי. אפילו יחידה יוצרת מושבה בודדת (CFU) אינה מקובלת בעת גידול דגימות ללא חיידקים, ולכן מומלץ לחזור על בדיקה זו עם דגימות צואה חדשות אם יש חשד לתוצאות חיוביות כוזבות (כלומר, מושבה בודדת במקדם דילול גבוה אך ללא דילולים נמוכים אחרים) כדי לאשר את מצב הזיהום של העכברים. יש להוציא מהמחקר עכבר מזוהם, את הכלוב כולו וכל עכברים ששוכנים במשותף. ניתן לבצע בדיקות PCR מסחריות למזהמים נגיפיים ופטרייתיים כדי לאמת מצב נקי מחיידקים.

כדי להעריך את הקולוניזציה לאורך זמן של עכברים אנושיים, 50-70 מ"ג צואת עכברים או חיסון צואה מתורם מאוחד חולצו ל-DNA באמצעות DNeasy 96 PowerSoil Pro QIAcube HT (QIAGEN) כפי שתואר קודם לכן. לאחר מיצוי DNA צואתי, האזור ההיפר-משתנה V1-V3 של הגן 16S rRNA הוגבר באמצעות זוגות פריימר מקודדים עם רצפי מתאם קצה מזווג אוניברסלי של Illumina ומוצרי PCR טוהרו, כומתו ואוגדו כמתואר קודם לכן ורצפו בריצה אחת של Illumina MiSeq (2 × 300)¹⁵. הניתוח נערך כמתואר קודם לכן¹⁵. מבנה קהילת הצואה של עכברים אנושיים היה שונה באופן משמעותי בין פנוטיפים של תגובה בכל שלוש נקודות הזמן (איור 3A-D). באופן מעניין, עכברים שעברו צואה מגיבים לא הראו הבדל במבנה הקהילה המיקרוביאלית בין שבועות 1 ו-2 ושבועות 2 ו-4 (איור 3E-G). העכברים שעברו צואה שלא הגיבו הראו מבנה קהילתי מיקרוביאלי שונה בין שבועות 1 לשבוע 2, אולם הראו מבנה קהילתי דומה בין שבועות 2 לשבוע 4 (איור 3H-J). מאחר שמבנה הקהילה המיקרוביאלית של שתי קבוצות ההתיישבות לא היה שונה באופן משמעותי בין שבועות 2 ל-4, זה מצביע על כך שניתן להגיע לקולוניזציה יציבה כבר שבועיים. מתוך 571 גרסאות רצף אמפליקון (ASVs) שנמצאו במקור בחיסון האנושי המגיב, 35% נמצאו בעכברים שעברו מושבה שבוע לאחר הגאווג', 29% לאחר שבועיים ו-26% לאחר 4 שבועות. מתוך 648 ASV שנמצאו בחיסון האנושי שלא הגיב, 23% נמצאו בעכברים שלא הגיבו שבוע לאחר הגאווג', 23% לאחר שבועיים ו-21% לאחר 4 שבועות. החיסונים מתורמים אנושיים הראו ייצוג מוגבר של סוגי חיידקים Blautia, Eubacterium, Ruminococcus ו-Streptococcus בהשוואה לעכברים המקבלים שלהם, שהגדילו את השפע היחסי של Bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia ו-Parabacteroides (איור 3K).

איור 3: קולוניזציה של עכברים נטולי חיידקים עם צואה אנושית מגיבים או לא מגיבים לאורך זמן. (A) ניתוח קואורדינטות עיקריות (PCoA) המראה מגוון בטא שנמדד על ידי חוסר דמיון של Bray-Curtis בין צואת עכברים בודדים 1, 2 או 4 שבועות לאחר הקולוניזציה (R: n = 6; NR: n = 5) וחיסוני צואה מאוגמים מתורמים אנושיים R או NR (חיסון R: n = 1; חיסון NR: n = 1). (B) PCoA שמראה מגוון בטא שנמדד על ידי Bray-Curtis חוסר דמיון בין צואת עכברים בודדים שבוע אחד לאחר הקולוניזציה (R: n = 6; NR: n = 5) (P = 3.18 × ^10-7). (C) PCoA שמראה מגוון בטא שנמדד על ידי הבדל של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים שבועיים לאחר הקולוניזציה (R: n = 6; NR: n = 5) (P = 8.00 ^{× 10-8}). (D) PCoA שמראה מגוון בטא שנמדד על ידי הבדל של Bray-Curtis בין צואת עכברים בודדים 4 שבועות לאחר הקולוניזציה (R: n = 6; NR: n = 5) (P = 1.17 × ^10-7). (E) PCoA המראה מגוון בטא שנמדד על ידי חוסר דמיון של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים שבוע או שבועיים לאחר הקולוניזציה (R: n = 6) (P = 0.513). (F) PCoA המראה מגוון בטא שנמדד על ידי הבדל של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים שבוע או ארבעה שבועות לאחר הקולוניזציה (R: n = 6) (P = 4.87 × ^10-6). (G) PCoA מראה מגוון בטא שנמדד על ידי הבדל של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים 2 או 4 שבועות לאחר הקולוניזציה (R: n = 6) (P = 0.835). (H) PCoA שמראה מגוון בטא שנמדד על ידי חוסר דמיון של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים שבוע או שבועיים לאחר הקולוניזציה (NR: n = 5) (P = 4.86 ^{× 10-4}). (I) PCoA המראה מגוון בטא שנמדד על ידי חוסר דמיון של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים 1 או 4 שבועות לאחר הקולוניזציה (NR: n = 5) (P = 1.35 × ^10-4). (J) PCoA המראה מגוון בטא שנמדד על ידי הבדל של בריי-קרטיס בין צואת עכברים בודדים 2 או 4 שבועות לאחר הקולוניזציה (NR: n = 5) (P = 0.046). P < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית. (K) תרשים סרגל שפע יחסי של וריאנטים של רצף אמפליקונים ברמת הסוג (ASVs) בין תורמי R ו-NR אנושיים (חיסון R: n = 1; חיסון NR: n = 1) ועכברים נמענים בכל נקודות הזמן (R: n = 18; NR: n = 15) עם טקסונים עיקריים מסומנים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה ניתנת לשחזור ומפורטת ביותר להאנשה של עכברים נטולי חיידקים השוכנים באיזוקאז'ים ניסיוניים. היכולת להשתיל באופן בלעדי קהילות צואה מנבדקים אנושיים למארחי עכברים היא בעלת ערך רב לחקר המיקרוביום. ללא זיהום ממיקרוביוטה קומנסלית ספציפית לעכבר, ניתן לחקור את ההשפעה של חיידקים תושבי אדם על מגוון מצבי בריאות וחולי או את ההשפעה של התערבויות כגון תזונה או מתן תרופות על המיקרוביוטה האנושית 16,17,18. מחקרים כאלה חיוניים כדי להדגים את הסיבתיות של הרכב המיקרוביום במצבי בריאות וחולי. פרוטוקול זה כולל גם איסוף צואת עכברים אנושית באמצעי שימור, המאפשר התאוששות של חיידקים שהשתמרו כדאיות לשימוש נוסף. יישום נוסף שאינו מתואר כאן הוא מונו-אסוציאציה עם זני חיידקים בודדים או קולוניזציה עם קהילות חיידקים מוגדרות כגון פלורת שאדלר המשתנה או אוסף חיידקי מעי העכבר (miBC)13,19,20. גישות אלו מאפשרות שליטה ועקיבות של זני חיידקים ספציפיים בתגובה להתערבויות ולגורמים מארחים. פרוטוקול זה מותאם מאוד לשימוש בקונסורציום מוגדרים אלה או בבידוד בודד גם כן, כאשר השינוי היחיד הוא שיהיה צורך לתרבית מראש את החיידקים לפני העברתם דרך הפה לעכברים.

חשוב לציין שהתוצאות המייצגות המתוארות כאן אינן מהוות ניסוי בעל עוצמה מתאימה. כדי לקבוע סיבתיות, עכברי מעיים "אנושיים" מתורם יחיד מהווים רק שכפולים טכניים של שכפול ביולוגי יחיד (התורם)¹⁹. כדי לבחון כראוי את הסיבתיות, יהיה צורך לחזור על ניסוי זה לפחות פעמיים באמצעות דגימות תורם שונות לחלוטין, באופן אידיאלי מתורם יחיד במקום מדגם מאוחד. במקרה של התוצאות המייצגות שלנו, דגימת מספר עכברים בכלוב יחיד בכל נקודת זמן נחשבת לפסאודו-שכפול, ולא ניתן היה להשתמש בנתונים אלה כדי להגיע למסקנה סיבתית¹⁹. במקום זאת, ניסוי שתוכנן כראוי יתייחס לכלוב אחד לכל תורם כנקודת נתונים אחת בניסוי. למרות שאנו מספקים תוצאות אלה כדי להדגים ניסוי טיפוסי במערכת האיזוקאז', על החוקרים לדאוג ליישם את ניתוחי הכוח המתאימים לתכנון הניסוי שלהם לפני תחילת מחקריהם.

אף על פי שהרכב המיקרוביום של התורם היה דומה להרכב הנמענים במחקר שלנו, העכברים המואנשים האלה לא היו זהים לתורמים שלהם (איור 3A,K). זה צפוי מכיוון שגורמים רבים משפיעים על שיעורי ההשתלה של דגימות מיקרוביוטה צואתיות בעכברים נטולי חיידקים, כולל הכנת דגימות התורם, הגנוטיפ והתזונה של העכברים המקבלים, תדירות הגאוואז', ספירת ה-CFU של צואת התורם ואופן השימור של צואת התורם^{המקורית 13,20, 21,22}. מחקר שבדק את התוצאות של 1713 העברות מאדם לעכברים GF מצא שרק 47% מהמינים האנושיים סוכמו בעכברים המקבלים וכי שליש מהטקסונים שהועברו היו שונים באופן עקבי בשפע היחסי מתורמים²³. בעוד שמחקרים מסוימים מראים שיעורי העברה גבוהים יותר ודמיון רב יותר להרכב התורם, לכן "האנשה" של המעיים אינה מושלמת, ויש להתייחס לחריטה משתנה כמגבלה להליך זה^24,25. השתלה לא מוצלחת יכולה להיות סיבה להעברת פנוטיפ לא מוצלחת לעכברים מקבלים, ולכן רצף של צואת התורם והמקבל כדי למדוד תוצאה זו רצוי מאוד בעת ביצוע מחקרים אלה. כאשר מדווחים על תוצאות של מודל עכבר "אנושי" במעיים, יש לתאר בקפידה שיטות מפורטות לגבי איסוף צואה מתורם, הכנה, הרכב מוגדר של ריצוף 16S rDNA וכל שאר הפרטים הרלוונטיים כדי לאפשר שחזור.

למרות ששיעור העברת הטקסונים מתורם צואה אנושי לעכבר הוא פחות מ-100%, זה מייצג הזדמנות ייחודית. אם נשמר פנוטיפ של מחלה או תגובה במודל העכבר המואנש של המעיים, ניתן להשתמש בטקסונים המועברים לעכבר כדרך לשלול זנים שאינם נדרשים לתפקוד ספציפי ובמקום זאת ניתן להתמקד רק באותם טקסונים המועברים לעכברים. צואת עכברים אנושית שמורה בכדאיות יכולה לשמש לבידוד של זני חיידקים ליצירת קונסורציום מבודד אנושי מוגדר בהתאמה אישית, או שניתן להעביר אותה שוב דרך עכברים למחקרים פונקציונליים. במקרים בהם כמות הצואה של תורם צואה אנושית מוגבלת, ניתן להשתמש במלאי של צואה מושתלת עכברים שנשמרה כדאיות במקום צואה מתורם אנושי כדי ליישב עכברים. יתר על כן, צואה נמענת שמורה כדאיות יכולה לשמש גם ביישומים נוספים, כגון חיסון מערכת ביו-ריאקטור לחקר המיקרוביוטה בבידוד מהמארח.

כלובי המבודדים הבודדים המתוארים כאן מספקים גמישות ניסויית, ומפחיתים את העלות והצוות הדרושים לביצוע ניסויים מקבילים עם קבוצות רבות ^9,10. עם זאת, הסיכון לזיהום גבוה יותר בעת שימוש באיזוקאז'ים מאשר במבודדים ניסיוניים^26,27. מיני-מבודדים מצוידים במזון ומים ויש להם כניסת פורטל המגנה על התכולה מהסביבה החיצונית. יש להעביר את האיזוקאז' ולפתוח אותו בארון בטיחות ביולוגית, מה שמגדיל מאוד את הסיכוי שמזהמים חיצוניים יבואו במגע עם משטחי הכלוב ויועברו לעכברים. סיכויי הזיהום קשורים אפוא ישירות למספר הפעמים שמערכת האיזוקאז' נפתחת בארון הבטיחות הביולוגית, שהוא לכל הפחות כל שבועיים עקב דרישות גידול. כתוצאה מכך, מומלץ לשכן עכברים באיזוקאז'ים לא יותר מ 12 שבועות¹⁰. זה אכן מגביל את הגישות הניסיוניות באיזוקאז'ים לניסויים קצרי טווח, למעט מודלים ארוכי טווח, אך מחקרי קולוניזציה ארוכי טווח מתאימים יותר לגישת דיור מבודד. מערכת האיזוקאז' מתאימה באופן ייחודי לגישות ניסיוניות הדורשות התערבויות תכופות יותר, למשל, המאפשרת מחקרים הכוללים ייצור גידול וטיפול תרופתי.

כמה גישות חלופיות משתמשות בהעברה של מצבים נטולי חיידקים לתנאי SPF (המכונים מודלים של GF לשעבר) או עכברים מדוללי אנטיביוטיקה ואחריהם קולוניזציה מיידית וחוזרת של המיקרוביוטה האנושית כדי לסכם חלקית את הרכב התורם הצואתי המקורי. בעוד שגישות אלה הראו הבטחה בכך שאפשרו למיקרוביוטה של תורם להתיישב למחקרים ארוכי טווח, חיידקים קומנסליים ספציפיים לעכבר עדיין מתיישבים במודלים אלה, מה שמוביל לקהילה מיקרוביאלית מעורבת (אדם ועכבר). ניתן להפחית זאת חלקית על ידי שימוש בכמויות גדולות של צואת תורם אנושי וקולוניזציה חוזרת, לפעמים^{מדי יום}. קולוניזציה של עכברים נטולי חיידקים עם דגימות צואה אנושיות במערכת האיזוקאז' דורשת רק גבאז' יחיד להתיישבות יציבה, ולכן דורשת הרבה פחות חומר תורם מאשר גישות חלופיות אלה, אם כי גבאז'ים נוספים יכולים לשפר את ההשתלה על חשבון זמן נוסף וחומר צואה של תורם²¹. שיעורי העברה גבוהים של עד 88% מהעברת צואה אנושית לעכברים נטולי חיידקים הושגו בניסויים קודמים, אך כפי שצוין, שיעור זה משתנה מאוד ואינו קובע את הצלחת השתלת הצואה²⁴.

העיקור של ארון הבטיחות הביולוגית, האיזוקאז'ים וכל החומרים והאספקה הוא ההיבט החשוב ביותר של הפרוטוקול. מניפולטור הכלוב הראשי לא יכול להיות זהיר מדי בעת השלמת שלבי הניקוי הסטרילנטיים של כלור-דו חמצני. כל מה שנכנס לארון הבטיחות הביולוגית חייב להיות בעל זמן מגע נוזלי פני השטח של 20 דקות עם סטרילנט, ובמקרה של שגיאת מפעיל, ייתכן שיהיה צורך לעקר מחדש לחלוטין את כל החומרים ואת תחנת העבודה. לאחר השימוש בארון הבטיחות הביולוגית, חשוב גם לנקות אותו לחלוטין שוב עם חומר מעקר כלור-דו חמצני ואחריו אלכוהול כדי להפחית את אפקט החמצון על משטחי מתכת. הפרוטוקול המתואר כאן ישים באופן נרחב לכל מתקן לבעלי חיים המצויד בגידול נטול חיידקים וארון בטיחות ביולוגית, אך הוא מייגע ויכול לגזול זמן בהתאם למספר הכלובים והניסויים המתבצעים במקביל. עבור מתקנים עם שימוש גבוה במערכת האיזוקאז', ישנן אפשרויות ציוד פחות עתירות עבודה המפחיתות מאוד את המאמץ הדרוש לביצוע ניסויים אלה. למשל, ישנן מערכות ארונות בטיחות ביולוגיות המיועדות לכך, הכוללות מיכל טבילה אוטומטי המחובר לארון, ומונע את הצורך בניקוי ידני של כל כלוב. בנוסף, תאי העברת חיטוי זמינים לחיבור לארון הבטיחות הביולוגית, המאפשר העברה ישירה של חומרים חיטוי למכסה המנוע ללא צורך בעיקור פני השטח על ידי סטרילנט כלור-דו חמצני. למרות שמדובר בהשקעה יקרה, אפשרויות אלו מפחיתות מאוד את הזמן והמאמץ הנדרשים להשלמת ניסויים אלה וניתן להחליף אותן בקלות בסעיפים הרלוונטיים של פרוטוקול זה.

הסיבה השכיחה ביותר לכישלון פרוטוקול ניסיוני זה היא אירוע זיהום. מקור הזיהום הסביר ביותר באיזוקאז'ים הוא במהלך תהליכי ההעברה והחלפת הכלוב מתחת למכסה המנוע. חיידקים יוצרי נבגים, כמו Bacillus, וקומנסלים של עור אנושי מהסוג Staphylococcus הם הסיכון הגדול ביותר לזיהום עבור עכברים גנוטוביוטיים באיזוקאז'ים^26,27. על מנת להגביל את הסיכון לזיהום, מומלץ לפתוח את הכלובים רק כאשר יש צורך מוחלט מחוץ להחלפת הכלוב למשך שבועיים. במצבים מסוימים, ניתן לתזמן את כל ההליכים וההתערבויות למסגרת זמן זו, אך חלק מהגישות הניסיוניות מחייבות פתיחה חוזרת. במצבים אלה, מפעיל מנוסה מאוד עשוי להיות מסוגל לשמור בהצלחה על תנאים נקיים מחיידקים, אך ייתכן שיהיה צורך באיסוף ובדיקת צואה בכל פתח כלוב כדי להוכיח שנשמרו תנאים נקיים מחיידקים. בנוסף, מצב חירום בריאותי של בעלי חיים או שנגמר המזון או המים ידרשו פתיחה מיידית של הכלוב. כתוצאה מכך, מומלץ לעקוב מקרוב אחר בריאות ורווחת בעלי החיים ורמת אספקת המזון/מים כדי להבטיח למזער זאת ככל האפשר.

אם מתרחשים אירועי זיהום חוזרים ונשנים, מומלץ לספוג משטחים של ארון הבטיחות הביולוגית והאיזוקאז'ים כדי לזהות אזורים של גידול מיקרוביאלי. ספוג את משטח העבודה, מסנן האוויר, האבנט, הדפנות והפתח של מכסה המנוע של ארון הבטיחות הביולוגית, כמו גם את מהדקי הסגירה הבטוחים, מסנן HEPA, פתחי האוורור והמשטחים הפנימיים של האיזוקאז'ים. תרב את המטושים הללו כפי שתואר קודם לכן וזהה באילו אזורים יש גידול מיקרוביאלי. ניתן לזהות את החיידקים או הפטריות המזהמים על ידי ניתוח Biotyper MALDI-TOF של מושבות בודדות, אך צביעת גרם או qPCR לטקסונים הן גם שיטות ברות קיימא לזיהוי הן המזהמים של העכברים והן המקור הפוטנציאלי למזהמים אלה בסביבה.

מלכודת של פרוטוקול זה היא שבמקרים שבהם בעלי חיים מיושבים במיקרוביוטה אנושית, כמעט בלתי אפשרי לזהות זיהום ממקורות חיצוניים בשל המיקרוביוטה המגוונת והלא מוגדרת. אם יש חשד לזיהום, מומלץ לבצע ריצוף של הדור הבא של צואת עכברים על פני נקודות זמן רבות כדי לנטר טקסונים שאינם קיימים בחיסון הצואה של התורם האנושי הנמצאים בצואה של העכבר המקבל. לא כל הטקסונים מהצואה האנושית של תורם הצואה יאכלסו את העכברים המקבלים, אולם לא אמורים להיות טקסונים שאינם נוכחים בצואה האנושית שנמצאת בצואת העכברים. ניתן גם לנטר תחזוקה נטולת חיידקים או קולוניזציה של צואת תורם לאורך באמצעות qPCR, באמצעות פריימרים אוניברסליים 16S או פריימרים ספציפיים לטקסון, במיוחד אם הרכב הקהילה המיקרוביאלית של דגימת התורם המקורית ידוע. עם זאת, שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה יכולה להבחין בין מיקרואורגניזמים חיים למתים. חשוב גם להשתמש בבקרות צואה מאומתות ללא חיידקים בעת תכנון הבדיקה כדי למנוע אותות חיוביים כוזבים.

לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר האנשה מוצלחת וניתנת לשחזור של מיקרוביוטת המעיים של עכברים נטולי חיידקים בכלובי מבודדים ניסיוניים ואיסוף לאחר מכן של דגימות צואה אנושיות שנשמרו על ידי כדאיות מעכברים אלה. גישה זו היא כלי חיוני לחקר האינטראקציות בין הפונדקאי למיקרוביאלי בהקשר של בריאות וחולי ומספקת את המסגרת לתכנון התערבויות ניסיוניות נוספות בתוך מערכת האיזוקאז'. צפוי כי קשרים אסוציאטיביים רבים בין מיקרוביוטת המעי האנושית לבריאות ומחלות יאומתו באמצעות מודל זה בעתיד.

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

המחברים אסירי תודה לחטיבת השירותים ללא חיידקים של שירותי הטיפול בבעלי חיים של UF על הסיוע בגידול גנוטוביוטים, לד"ר ברוק בלומברג וד"ר לורה יורל על הסיוע הווטרינרי וה-IACUC, ולג'וזי גוטייה על הסיוע בריצוף הגנים 16S rRNA. מחקר זה נתמך, בין השאר, על ידי קרנות מרכז הסרטן של UF Health (C.J.) וקרן Gatorade של המחלקה לרפואה של UF (C.J). R.Z.G. נתמך על ידי קרנות מרכז הסרטן של UF Health. R.C.N. נתמך על ידי מענק ההכשרה TL1 של המכונים הלאומיים לבריאות באוניברסיטת פלורידה (TL1TR001428, UL1TR001427), המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות פרס תוכנית ההכשרה הבין-תחומית לחקר הסרטן המבוססת על צוות T32CA257923 ומרכז הסרטן של UF Health. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי מרכז הסרטן של UF Health, נתמך בחלקו על ידי הקצאות המדינה הניתנות ב-Fla. Stat. § 381.915 והמכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר P30CA247796. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות או מדינת פלורידה. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.