Human CD59/Intermedilysin Cell Ablation Tool을 사용한 신장 대식세포의 급격한 고갈

human CD59/intermedilysin cell ablation 도구를 사용하여 신장 대식세포의 재생을 연구하기 위한 신장 대식세포의 선택적 절제에 대한 프로토콜이 여기에 보고되어 있습니다. 이 방법은 신장, 간 및 지방 조직에 있는 다른 세포 집단의 기능 및 재생을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.

신장 대식세포(RM)는 신장 건강, 면역 감시, 조직 항상성 및 부상에 대한 반응을 조율하는 데 필수적입니다. 이전에 우리는 human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) 세포 절제 도구를 사용하여 골수 또는 배아 기원의 RM의 뚜렷한 운명, 역학 및 틈새를 연구했다고 보고했습니다. RM은 난황낭 유래 대식세포, 태아 간 단핵구, 골수 유래 단핵구에서 유래하며, 순환 단핵구의 국소 증식 및 모집을 통해 성인이 되어서도 유지됩니다. 여기에서는 1) 마우스 RM에서 hCD59의 Cre-inducible 발현의 생성 및 특성화, 2) ILY의 정제 및 ILY 활성의 특성화, 3) 복합 마우스에서 RM의 hCD59 발현 유도, 4) ILY 매개 RM 절제 후 재생의 특성화를 포함하여 RM의 재생을 연구하기 위한 선택적 절제에 대한 자세한 프로토콜을 보고합니다. ILY는 복합 마우스에서 RM을 특이적이고 빠르게 고갈시키며, ILY 투여 후 1일 이내에 효율적인 대식세포 절제를 실시합니다. 신장 대식세포 재생은 절제 후 3일째에 시작되어 7일째까지 ~88%의 회복율을 보였습니다. 이 모델은 대식세포 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하며 신장, 간 및 지방 조직의 다른 세포 집단을 선택적으로 절제하여 이들의 기능과 재생을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

신장 대식세포(RM)는 신장의 항상성을 유지하고, 면역 반응을 조절하며, 손상 후 조직 복구를 촉진하는 필수 면역 세포입니다. 그들은 phagocytosis, 항원 제시, 염증 및 항염증 반응의 오케스트레이션을 포함한 다양한 기능을 수행합니다 ^1,2,3. 지역 환경에 따라 RM은 전염증성(M1) 또는 항염증성(M2) 표현형으로 분극화될 수 있으며, 이는 부상을 악화시키거나 치유를 촉진할 수 있습니다 ^4,5,6. RM의 조절 장애는 급성 신장 손상(AKI) 및 만성 신장 질환(CKD)의 발병 및 진행과 관련이 있어 신장 건강 및 병리학에 중요한 역할을 합니다 ^7,8. RM은 배발생 시 난황낭 유래 대식세포, 태아 간 단핵구, 성인기 골수 유래 단핵구를 포함한 다양한 출처에서 발생합니다. RM은 출생 후 신장 성장과 병행하여 확장 및 성숙하며, 주로 출생 전 태아 간 단핵구에서 유래하며, 성인이 될 때까지 자가 유지는 말초 단핵구에 의해 보충됩니다⁹. 성인의 경우, 순환하는 단핵구는 항상성 또는 부상 신호에 의해 신장으로 모집되며, 국소 미세환경적 영향에 따라 대식세포로 분화됩니다. RM 유지는 국소 증식과 순환 단핵구 ^9,10,11,12의 주기적인 보충을 통해 유지됩니다.

우리는 이전에 골수 또는 배아 기원에서 유래한 RM의 뚜렷한 운명, 역학 및 미세환경적 틈새를 조사하기 위한 도구^13,14로 human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) 세포 절제 시스템의 사용을 입증했습니다⁹. ILY는 표적 세포막에 공극을 형성하여 몇 초 내에 인간 세포를 선택적으로 용해시킵니다¹⁵. 이러한 특이성은 인간 CD59 (hCD59)에 대한 ILY의 독점적인 결합 친화력에서 발생하며, 이 수용체가 결핍된 다른 종의 세포에는 상호 작용이나 용해 효과가 없습니다¹⁵. 이 개념을 기반으로 우리는 인터메디신(ILY)¹⁴의 적용을 통해 형질전환 마우스 모델에서 인간 CD59 발현 세포의 빠르고 조건적이며 표적화된 절제를 가능하게 하는 도구를 설계했습니다. 이 도구의 사용을 용이하게 하기 위해 인간 CD59의 발현이 Cre 매개 재조합¹³ 후에만 발생하는 플록스된 STOP-CD59 노킨 마우스(ihCD59)를 생성하여 조건부 및 표적 세포 절제 모델을 개발했습니다. 이전에는 신장 대식세포로 정의되는 CD11bintF480hi에서만 발현되는 CX3CR1cre-EFP 유전자가 발견되었습니다⁹. 따라서 신장 대식세포에서 hCD59를 발현하기 위해 CX3CR1CreER2^+/+ lines를 사용하여 ihCD59 마우스와 교차했습니다. 유전자형 ihCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/-9(+/-, +/+ 및 -/-는 각각 동형접합체, 반접합체 및 비캐리어 형질전환 마우스를 나타냄)를 가진 복합 마우스를 성공적으로 생성했습니다. hCD59^+/-/CX3CR1CreER^+/- 화합물 마우스에 타목시펜 투여 hCD59 발현에 의해 조건부로 표지 및 표시된 RM⁹. ILY 치료를 통해 RM 틈새가 고갈된 후, 말초 단핵구는 즉시 골수 유래 RM으로 분화되어 앞서⁹에서 설명한 바와 같이 틈새를 효과적으로 다시 채웠습니다. 이 재생은 CX3CR1/CX3CL1 신호축에 결정적으로 의존했으며, 이는 RM 개체군의 유지 및 복원⁹ 모두에 필수적인 역할을 강조했습니다. 또한, 배아 유래 RM은 뚜렷한 해당작용 능력으로 인해 골수 유래 RM보다 면역 복합체를 제거하는 능력이 더 높고 면역 공격에 더 민감하다는 것을 보여줍니다⁹.

ILY 투여 후 Cre-inducible hCD59(ihCD59) 매개 신속 세포 절제를 사용하여 RM의 재생을 조사하기 위해 RM의 선택적 절제에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. ILY 주입은 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- compound 마우스에서 hCD59를 조건부 및 특이적으로 발현하는 RM의 표적 절제를 유발했습니다. 절제 후 유세포분석을 사용하여 대식세포 역학 변화를 모니터링한 결과 대식세포가 급격히 고갈된 후 RM이 재생되는 것을 발견했습니다. 재조합 ILY는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 발현되었으며 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되었습니다. 재조합 ILY의 순도와 기능성은 SDS-PAGE, 분광광도법 및 용혈 분석에 의해 확인되어 특징적인 콜레스테롤 의존성 사이토리신 활성을 입증했습니다. ILY를 사용하여 마우스의 RM을 고갈시켜 ILY 투여 후 1일 이내에 효율적인 대식세포 절제를 달성했습니다. 신장 대식세포 재생은 절제 후 3일째에 시작되어 7일째까지 ~85%의 회복율을 보였습니다. 데이터는 재생이 주로 단핵구 모집에 의해 주도된다는 것을 시사합니다. 이 모델은 대식세포 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하며 신장 질환에서 대식세포 개체군의 표적 조작을 위한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. ihCD59/ILY 세포 절제 도구는 신장, 간, 지방 조직 및 기타 장기의 세포 기능 및 재생을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

동물 연구 프로토콜은 Tulane University School of Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호 1482). 생후 10-12주, 체중 25-30g의 실험용 마우스 Cx3cr1CreER^+/+ 및 ihCD59+^/+는 대학의 동물 시설에서 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 사육되었습니다. 신장 격리와 관련된 모든 절차는 무균 환경에서 진행되었으며, 연구원들은 오염을 방지하기 위해 장갑과 안면 마스크를 착용했습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.

1. 동물 준비

1. 잭슨 연구소에서 CX3CR1CreER^+/+마우스를 구합니다. Tulane University School of Medicine(SOM)의 특정 SPF(Riskogen-Free) 시설에 생쥐를 수용합니다. 통제된 환경 조건에서 12시간의 명암 주기로 동물을 유지하십시오.
2. 번식을 위해 C57BL/6 유전적 배경을 가진 이전에 생성된 ihCD59+/+ 마우스를 사용합니다. 동형접합 CX3CR1CreER^+/+ 마우스(CX3CR1 발현 부족)와 ihCD59^+/- 마우스를 교배하여 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-및 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-의 자손 유전자형을 생성합니다.
3. Anti-CX3CR1 항체⁹를 사용한 유세포 분석을 통해 이형접합 CX3CR1CreER+/- 마우스는 기능적 CX3CR1 발현을 유지하는 반면, 동형접합 CX3CR1CreER^+/+ 마우스는 CX3CR1이 결핍되어 있는지 확인합니다.

2. ILY 생산 (^14,15에서 파생)

1. 0일차
   1. -80°C에서 보관된 pTrcHis-A 플라스미드 (보충 그림 1) 에서 His-tagged ILY 염기서열을 운반하는 ILY 박테리아 균주 BL21-DE3-RIPL의 동결 스톡을 회수합니다. 10μL의 박테리아 스톡을 1μg/mL 농도의 암피실린을 함유한 40μL의 루리아 브로스(LB) 배지에 접종합니다.
   2. 접종된 혼합물을 암피실린(1μg/mL)이 보충된 LB 한천 플레이트에 펴 바릅니다. 박테리아 인큐베이터에서 37 °C의 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.
2. 1일차
   1. LB 한천 플레이트에서 6개의 개별 콜로니를 선택합니다. 각 콜로니를 암피실린을 함유한 3.5mL의 LB 배지에 접종합니다. 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
3. 2일차
   1. 각 3.5mL 스타터 배양액을 암피실린이 보충된 250mL의 LB 배지로 옮깁니다. 박테리아가 성장할 수 있도록 230 x g 에서 흔들면서 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
   2. 3시간 후 1M 원액(-20°C에서 보관)의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 1:1000 희석으로 첨가하여 최종 농도 1mM를 달성합니다. 단백질 발현을 유도하기 위해 추가로 4시간 동안 배양을 계속합니다.
   3. 빈 원심분리기 병의 무게를 측정하고 무게를 기록합니다. 약 250mL의 유도 배양액을 원심분리기 병에 옮깁니다.
   4. 10,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상등액을 버리고 펠릿이 들어있는 병의 무게를 잰다. 원심분리 후 총 중량에서 빈 병 중량을 빼서 펠릿 중량을 계산합니다.
   5. ILY의 후속 추출 및 정제를 위해 박테리아 펠릿을 -20°C에서 보관하십시오.
4. Day 3 : ILY 추출 및 정제
   1. 50mL 원심분리 튜브에 30mL의 Bug Buster Protein Extraction 시약과 30μL의 benzonase nuclease(1200 Kunitz 단위) 및 0.9μL의 lysozyme(10,000 단위의 효소 활성)을 결합하여 용해 완충액을 준비합니다.
   2. 용해 완충액이 균질하도록 용액을 부드럽게 혼합합니다. 준비된 용해 완충액을 박테리아 펠릿(2-5g)에 추가합니다. 박테리아 세포를 완전히 재현 탁시키기 위해 30-60 초 동안 혼합물을 철저히 소용돌이칩니다.
   3. 재현탁액을 두 개의 50mL 원심분리 튜브 간에 균등하게 나눕니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 30-90분 동안 배양합니다. 배양 중에는 오비탈 셰이커를 사용하여 튜브를 부드럽게 흔들고 10-15초 동안 5-10분마다 짧게 와류를 사용하여 세포 용해를 향상시킵니다.
   4. 배양 후 4,900 x g 에서 4°C에서 30분 동안 용해물을 원심분리합니다.
   5. 1mL 피펫 팁을 사용하여 수돗물로 컬럼을 철저히 세척하여 이전에 사용한 잔여 레진을 제거합니다.
   6. 컬럼을 70% 에탄올로 헹구어 소독합니다. 컬럼 2x-3x를 차가운 ddH₂O로 세척하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 홀더에 기둥을 놓습니다.
   7. 6-10mL의 차가운 ddH₂O를 첨가하여 정제를 위해 컬럼을 추가로 세척하고 평형을 이룹니다. 컬럼에 약 3mL의 수지 비드를 추가합니다. 컬럼을 30의 속도로 설정된 연동 펌프에 연결합니다.
   8. 10mL의 차가운 ddH₂O를 첨가하여 수지를 완전히 현탁시키고 단백질 결합을 준비합니다. 15mL의 1x 충전 버퍼로 수지 비드를 세척하여 단백질 결합을 위해 수지를 준비합니다.
   9. 새 튜브에서 원심분리 후 박테리아 용해물 상등액을 수집하여 펠릿이 폐기되도록 합니다. 주사기가 있는 0.45μm 필터를 사용하여 상층액을 여과하여 남아 있는 세포 파편을 제거합니다.
   10. 여과된 박테리아 용해물 20-25mL를 3회에 걸쳐 컬럼에 통과시킵니다. 각 통과 후 20μL의 플로우 스루를 수집하고 나중에 광학 밀도(OD) 측정을 위해 P.E.로 표시합니다.
   11. 20-30mL의 결합 완충액으로 컬럼을 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다. 20-30mL의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다. OD 측정을 위해 세척 분획 20μL를 수집합니다.
   12. 10-20mL의 용리 완충액을 추가하여 결합된 단백질을 용리합니다. 3-4분 후에 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하여 용리액 수집을 시작합니다. 튜브당 약 1mL를 수집하여 15-17개의 튜브를 채웁니다.
   13. 분광 광도계를 사용하여 A280에서 각 용출 분획의 흡광도를 측정합니다. A280 판독 중에 용리 버퍼를 블랭크로 사용합니다. A280에서 흡수도가 크게 증가한 튜브를 수집하는데, 이는 일반적으로 튜브 13 주위의 분획에서 발견되는 His-tagged ILY 단백질을 포함하고 있기 때문입니다.
   14. ILY 단백질을 함유한 용출 분획(또는 튜브)을 4°C에서 보관하십시오. 최적의 단백질 안정성을 보장하기 위해 다음 날 이내에 추가 단계를 진행하십시오.
       참고: 단백질 무결성을 유지하기 위해 가능한 경우 얼음 위 또는 4°C에서 모든 단계를 수행하십시오.
5. 4일차: 용출액에서 내독소 제거
   1. 내독소 제거 수지 컬럼을 6-10mL의 초순수로 헹굽니다. 흐름을 조절하기 위해 컬럼을 부드럽게 누릅니다.
   2. 1% 소듐 데옥시콜레이트 용액 10mL(갓 만들었거나 1개월 이내)로 컬럼을 헹구어 결합된 내독소를 제거합니다. 6-10mL의 초순수로 컬럼을 다시 헹구어 잔여 세제를 제거합니다.
   3. 준비된 단백질 샘플을 수지 컬럼에 적용합니다. 최적의 내독소 결합을 위해 실온(RT)에서 1시간 동안 컬럼의 샘플을 배양합니다.
   4. 초기 플로우 스루 비율을 수집합니다. 추가 용리를 위해 컬럼에 ddH₂O를 추가하고 약 10개의 튜브(튜브당 1mL)에서 용출된 분획을 수집합니다.
   5. 나중에 사용할 수 있도록 수지 컬럼을 4°C의 25% 에탄올에 보관하십시오. 용리된 단백질 샘플의 광학 밀도(O.D.)를 측정하여 수율을 정량화합니다. 첫 번째 용리 배치에서 총 단백질의 약 50%-70%를 회수할 것으로 예상됩니다.
6. 5-6일차: 투석
   1. 1600mL의 증류된 탈이온수(ddH₂O)를 고압증기멸균하여 2L의 투석 완충액을 준비합니다. 오토클레이브 물에 10x PBS 200mL, 글리세롤 200mL, MES(2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산) 3.5115g을 추가합니다.
   2. 모든 시약이 완전히 용해될 때까지 마그네틱 교반 막대로 혼합물을 저어줍니다. 생성된 버퍼를 4°C에서 보관합니다.
   3. 보관된 용출 분획을 투석 키트에 추가한 다음 바늘로 투석 키트에서 공기를 제거합니다. 투석 키트를 사용하여 교반 속도를 약 2로 설정하고 4°C에서 24시간 동안 단백질 용액을 투석합니다.
   4. 투석 키트가 버퍼에 완전히 잠기도록 구성합니다. 다음날 투석 키트의 투석 버퍼를 2L 용기의 새 투석 버퍼로 교체하십시오. 추가로 24시간 동안 투석을 계속합니다.
   5. 흰색 침전물을 포함한 전체 용액을 멸균 튜브로 조심스럽게 옮겨 응집될 수 있는 ILY 단백질을 보존합니다. 원심 분리 제조업체에 대한 제조업체의 지침에 따라 원심 필터 장치를 사용하여 ILY 단백질을 농축합니다.
   6. 농축된 ILY 단백질을 멸균 튜브에서 200μL 부분으로 분취합니다. 각 튜브에 날짜와 이름을 표시하십시오. 나중에 겔 전기영동 및 용혈 분석에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 부분 표본을 보관하십시오.

3. SDS-PAGE 전기영동에 의한 ILY 특성화

1. 러닝 버퍼(20x)를 ddH₂O로 희석하여 MOPS SDS 러닝 버퍼(1x)를 준비합니다.
2. 90μL의 6x 로딩 버퍼와 10μL의 β-메르캅토에탄올(β-ME)을 혼합하여 흄 후드에서 샘플 버퍼를 준비합니다. 완전한 균질화를 보장하기 위해 용액을 철저히 혼합하십시오.
3. 준비된 샘플을 로딩 버퍼와 결합하여 30μL의 최종 부피를 달성합니다. 샘플을 해동하고 격렬하게 와류로 둘러싸서 완전한 혼합을 보장합니다.
4. 단백질을 변성시키기 위해 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 4%-20% SDS-PAGE 젤에 로드합니다. 80V의 일정한 볼륨에서 전기영동을 90분 동안 실행합니다.
5. 젤 카세트를 조심스럽게 열고 젤을 ddH_2O에 5분 동안 담그십시오. 셰이커를 사용하여 세척 단계를 2회 반복합니다.
6. 실온(RT)에서 Coomassie Brilliant Blue로 젤을 1시간 동안 염색합니다. ddH₂O에서 30분 동안 젤을 세척합니다. 물을 새 ddH₂O로 교체하고 완전한 탈색을 위해 하룻밤에서 3일까지 셰이커에서 젤을 배양합니다.
7. 카메라를 사용하여 염색된 젤의 이미지를 캡처합니다(그림 1A). 정량적 및 정성적 평가를 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 겔을 분석합니다.

4. ILY 활성에 대한 용혈 분석

1. 보관된 ILILY(Intermedilysin) 샘플을 실온에서 완전히 해동합니다. 균질성을 보장하기 위해 해동된 샘플을 철저히 소용돌이치며, ILY는 해동 시 응집될 수 있습니다.
2. 연속 희석을 위해 96웰 플레이트를 설정합니다. 첫 번째 웰에 160μL의 ILY 원액(26.7ng/μL)을 추가합니다. 80μL의 1x PBS를 동일한 행 또는 열의 각 후속 웰에 추가합니다.
3. 80μL의 ILY 용액을 첫 번째 웰에서 두 번째 웰로 옮깁니다. 용액이 균질한지 확인하기 위해 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 두 번째 웰에서 세 번째 웰로 80μL를 옮기고 철저히 혼합합니다.
4. 원하는 수의 희석액이 준비될 때까지 이전 웰에서 다음 웰로 80μL를 이동시켜 각 웰에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 80 μL를 마지막 well로 옮긴 후 해당 well에서 80 μL를 폐기하여 플레이트 전체에 걸쳐 일정한 부피를 보장합니다.

5. 인간 적혈구(RBC)의 준비

1. EDTA와 같은 항응고제가 들어 있는 튜브에 1-2mL의 신선한 인간 혈액을 뽑습니다. 혈액을 실온에서 3,000 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다.
2. 상층액을 버리고 상층액이 투명해질 때까지 PBS 2x-3x로 인간 적혈구 펠릿을 세척합니다. 세척된 인간 적혈구를 900μL의 1x PBS에 10μL의 적혈구를 첨가하여 1:100 희석을 달성합니다.
3. 희석된 인간 적혈구 10μL를 각 웰에 추가합니다. 희석 플레이트에서 연속으로 희석된 ILY 용액 30μL를 각 웰에 추가합니다. 160μL의 1x PBS를 추가하여 최종 부피를 웰당 200μL로 만듭니다(시작 농도: 4ng/μL).
4. 희석된 인간 적혈구 10μL를 대조군 웰에 추가합니다. 네거티브 컨트롤을 위해 190μL의 물 또는 1x PBS를 대조군 웰에 추가합니다. 접시를 부드럽게 두드려 섞습니다.
5. 용혈이 일어날 수 있도록 37°C에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 플레이트를 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 손상되지 않은 인간 적혈구를 펠릿화합니다.
6. 각 웰에서 100μL의 상층액을 바닥이 평평한 새 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 상층액의 흡광도를 측정합니다.
7. 샘플의 흡광도 값을 대조군¹⁶과 비교하여 ILY의 용혈 활성을 계산합니다.

6. 타목시펜 처리, RM 고갈 및 재생

1. 옥수수 기름을 42 °C로 예열합니다. 예열된 옥수수 기름 5mL에 타목시펜 100mg을 용해시켜 20mg/mL 농도의 원액을 준비합니다.
2. 10-12주 된 수컷 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 마우스에게 체중 100μg/g의 용량으로 타목시펜을 복강내(i.p.)로 투여합니다. 타목시펜 주사를 3일 연속으로 반복합니다.
3. Crea 매개 hCD59 발현이 가능하도록 최종 타목시펜 주사 후 15일 동안 기다립니다.
4. CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 마우스 및 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/- 리터메이트 대조군에 120ng/g 체중의 용량으로 인터메디신(ILY)을 1회 정맥 주사합니다.
5. ILY 투여 후 1일, 3일, 7일에 유세포분석을 수행하여 RM 절제 및 후속 재생을 모니터링하고 확인합니다¹⁷.

7. 쥐 안락사

1. 동물을 적절한 챔버에 넣고 IACUC 프로토콜에 따라 이소플루란에 노출시킵니다. 페달 철수 반사와 같은 반사 신경이 없는지 확인하여 마취를 확인하십시오.
2. 마우스가 완전히 마취되고 반응이 없으면 안락사를 보장하기 위해 경추 탈구를 수행합니다. 페달 철수 반사와 같은 반사 신경이 없는지 확인하여 안락사를 확인하십시오.
3. 멸균 메스를 사용하여 복부를 약 2cm 정도 절개하고 피부를 부드럽게 수축시켜 흉강을 노출시킵니다. 끝이 뭉툭한 수술용 가위를 사용하여 흉골을 따라 흉곽을 열어 심장을 노출시킵니다.
4. 21G-23G 바늘을 좌심실에 삽입합니다. 10-20mL의 차가운 PBS로 관류를 시작하여 혈액을 씻어냅니다.
5. 혈액이 순환에서 배출될 수 있도록 오른쪽 심방을 엽니다. 신장이 창백해 보일 때까지 계속 관류하여 효과적인 혈액 정화를 나타냅니다.
6. 신장을 등쪽 몸벽에 대고 위치시킵니다. 집게와 가위를 사용하여 신장을 주변 조직과 부드럽게 분리합니다. 신장 캡슐을 절제하고 즉시 신장을 차가운 PBS에 넣어 분해를 방지하십시오.

8. 신장 소화

1. HBSS(Ca/Mg free) 9mL, 콜라겐분해효소 IV(5mg/mL) 1mL, DNase I(10mg/mL) 20μL를 혼합하여 소화 효소 칵테일을 준비합니다. 효소 용액을 신선하게 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
2. HBSS 5mL가 들어 있는 페트리 접시에 멸균 가위를 넣어 신장을 작은 조각(이상적으로는 1mm ≤)으로 다집니다. 신장 조직 조각을 10mL의 준비된 효소 용액이 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다.
3. 37°C에서 30분 동안 부드러운 교반으로 튜브를 배양하여 조직을 해리합니다. 피펫 또는 주사기 플런저를 사용하여 조직을 부드럽게 분쇄하여 세포 덩어리를 추가로 해리합니다.
4. 40μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 통과시켜 조직 파편을 제거합니다. 18°C에서 10분 동안 650 x g 에서 세포 현탁액을 원심분리합니다.
5. 원심분리 후 완충액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 펠릿을 5mL의 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구를 용해시킵니다.
6. PBS로 세포를 세척하여 용해 완충액을 제거합니다. 생성된 단일 세포 현탁액을 더 사용할 때까지 얼음 위에서 유지하십시오.

9. 밀도 구배 원심 분리

1. 조혈 세포를 풍부하게 하려면 이전 세척의 세포 펠릿을 10mL의 30% 밀도 구배 용액에 재현탁합니다. 원심분리기 튜브에 3mL의 70% 밀도 구배 용액 위에 용액을 조심스럽게 층을 이룹니다.
2. 브레이크를 밟지 않고 500 x g 에서 30분 동안 그래디언트를 원심분리합니다. 원심 분리 다음, 30%와 70% 용액 사이의 계면층을 조심스럽게 수집합니다. 이 층에는 농축된 단일 세포가 포함되어 있습니다.
3. 매번 10분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 수집된 세포를 10mL의 PBS로 2x 세척합니다. 1.5mL 튜브에서 1mL의 FACS 완충액(2% FBS가 포함된 1x PBS)에 최종 세포 펠릿을 재현탁합니다.
4. 명시야 현미경에서 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 세포 농도를 2 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.

10. 유세포 분석 염색, 획득

1. 유세포 분석을 위해 마우스 신장 조직에서 준비된 단일 세포 현탁액의 세포 농도를 2-3 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.
2. 650 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 1.5mL 튜브의 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠렛을 1mL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
3. 1:200 희석으로 항-CD16/32 항체를 첨가하여 비특이적 Fc 수용체 결합을 차단합니다. 실온에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
4. Aqua Live/Dead 염료를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하십시오.
5. CD45-e450, CD11b-PE-Cy7, hCD59-PE 및 F4/80-BV605를 포함한 사전 접합 항체로 세포를 1:100 희석으로 염색합니다. 세포 현탁액에 항체 칵테일을 추가합니다.
6. 광표백으로부터 형광단을 보호하기 위해 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 650 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 FACS 완충액(2% 소 태아 혈청이 함유된 PBS)으로 염색된 세포를 2x 세척합니다.
7. 얼음 위에서 1% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 30분 동안 고정합니다. 고정 셀을 FACS 버퍼로 2회 세척하여 잔류 PFA를 제거합니다.
8. 유세포 분석기를 사용하여 염색 및 고정 세포를 획득합니다. 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다.
9. ⁹에 설명된 바와 같이 마커 CD45, CD11b 및 F4/80을 사용하여 신장 및 기타 조직 상주 대식세포 및 미세아교세포를 식별합니다.
10. 초기 게이팅을 수행하여 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 프로파일을 기반으로 살아 있는 세포를 선택합니다. 전방 산란 영역(FSC-A) 대 전방 산란 높이(FSC-H)에 대한 게이팅을 통해 이중선을 제거합니다. LIVE/DEAD 생존도 염료를 사용하여 죽은 세포를 제외합니다.
11. CD45+ 집단에 게이팅을 통해 면역 세포를 강화합니다. 게이팅 전략에서 볼 수 있듯이 CD45+ 집단 내에서 CD11b+F4/80++ 세포로 신장 상주 대식세포를 정의합니다(그림 2A).
12. 미세아교세포 집단을 CD11b+CD45ⁱⁿt 세포로 정의합니다(그림 2B). 유세포분석기에서 데이터 수집을 수행합니다. 소프트웨어를 사용하여 최종 분석을 수행하여 유세포 분석 연구를 완료합니다.

His-Tag 재조합 ILY의 정제는^{앞서 14}에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따랐습니다. ILY는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 성공적으로 발현되었으며, Streptococcus intermedius의 ILY 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질전환되었습니다. IPTG를 유도한 결과, 표적 단백질의 과발현이 명백했습니다. 발현 후, ILY는 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 특정 결합을 위해 C-말단 His-tag를 활용했습니다. ILY(~54kDa)의 순도 및 분자량은 SDS-PAGE 분석으로 확인되었습니다(그림 1A). 단백질 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밀도 측정으로 정량화되었으며, 단백질 농도는 분광 광도계 분석으로 추가로 검증되어 최종 농도는 1.27mg/mL였습니다. 정제된 ILY의 생물학적 활성은 콜레스테롤 의존성 사이토리신을 평가하기 위한 표준 분석법인 인간 적혈구(RBC)를 사용한 용혈 분석을 사용하여 평가되었습니다. 이 분석은 용량 의존적 용혈 활성을 입증하여 재조합 단백질의 기능적 무결성을 확인했습니다. 완전한 용혈은 양성 대조군(물)으로 이루어졌지만, 음성 대조군(BPS 완충액)에서는 용혈이 발생하지 않았습니다. 정제된 ILY는 7.24ng/mL의 농도에서 hRBC의 50% 용해가 관찰되고 650ng/mL에서 거의 완전한 용혈(99.62%)이 관찰되는 등 강력한 용혈 활성을 나타냈습니다(그림 1B). 이러한 발견은 재조합 ILY가 콜레스테롤 의존성 사이톨리신의 특성과 일치하는 특징적인 기공 형성 활성을 유지한다는 것을 확인합니다. ILY의 성공적인 발현 및 정제는 매우 순수한 재조합 단백질을 생성했으며, 용혈 활성은 기능적 세포 분해 특성의 적절한 접힘 및 보존을 확인했습니다.

RM은 병리학적 상태에 매우 취약하며 치료 전략을 발전시키는 데 핵심이 될 수 있으므로 틈새 고갈 후 RM이 어떻게 보충되는지에 대한 철저한 이해가 중요합니다¹⁸. 신장 대식세포 틈새를 고갈시키고 조작하기 위해 ILY와 인간 CD59(hCD59) 간의 특이적 상호작용을 표적으로 삼았으며, 이는 마우스에서 hCD59 발현 세포의 선택적 절제를 촉진합니다¹³. 다양한 Cre-driver line과 교차된 유도성 hCD59 발현 마우스에 ILY를 투여하면 off-target effect 없이 면역 및 상피 세포를 빠르고 정확하게 절제할 수 있습니다.¹³. RMs의 선택적인 고갈을 달성하기 위하여는, 우리는 타목시펜 감응작용 후에 ILI 15 일 안으로 투여했다 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 마우스. 이 시점은 두 가지 중요한 이유 때문에 선택되었습니다. 첫째, 15일째까지 이 마우스의 뇌와 신장에 있는 거의 모든 CX3CR1+ 세포는 hCD59를 계속 발현하는 반면, 혈액, 비장, 폐, 골수 및 간에서는 hCD59 발현이 최소화되거나 아예 없습니다. 둘째, ILY(54kDa)의 크기가 크기 때문에 혈액뇌장벽을 통과할 수 없어 hCD59 발현 미세아교세포가 영향을 받지 않습니다⁹. 이를 검증하기 위해 타목시펜 치료 15일 후 여러 장기에 걸쳐 hCD59 표지 CD11b+CX3CR1+ 대식세포를 정량화했습니다. 신장과 뇌에서 hCD59+ 대식세포의 안정적인 유지(~90%)가 관찰된 반면, 다른 조직에서는 발현이 5%≤ 관찰되었습니다. ILY 투여 후, 우리는 미세아교세포의 고갈을 감지할 수 없이 신장 대식세포의 완전하고 선택적으로 고갈을 달성했으며, ILY가 혈액-뇌 장벽을 관통하지 않음을 확인했습니다(보충 그림 2A - B). CD59 발현의 안정성과 신장 상주 대식세포(KRM) 재증식의 역학을 확인하기 위해 타목시펜 유도 후 15일 및 30일에 KRM에서 hCD59 발현을 평가했습니다. 유세포 분석 결과 hCD59 발현이 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되는 것으로 확인되었습니다(보충 그림 2C). 또한 잠재적인 Cre-independent leakness를 평가하기 위해 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 모델, 우리는 차량 처리(옥수수 기름) 마우스에서 hCD59 발현을 평가했습니다. 이 마우스는 무시할 수 있는 CD11bintF480hihCD59+(0.93%) CD11b+CX3CR1+hCD59+ 개체군(1.8%)을 보였으며, 대조적으로, 타목시펜을 투여한 마우스는 두 개체군 모두에서 현저한 증가(각각 87% 및 81%)를 보였으며, 최소한의 기저 누출(보충 그림 2D). 이러한 결과는 유도 가능한 시스템의 특이성을 검증하고 향후 연구에서 차량 처리 제어의 사용을 뒷받침합니다. (보충 그림 2D). 에 표시된 바와 같이 그림 2A - 비, RM 고갈은 ILY 투여 후 하루 이내에 효율적으로 달성되었습니다. CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 대조군 마우스에서는 고갈이 발생하지 않았지만 (CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^-/-). 주사 3일 후, RM 개체군이 회복되기 시작하여 원래 수준의 약 50%에 도달했습니다. 7일째에는 거의 88%(그림 2B - 씨). 다음으로, 단핵구에서 유래할 수 있는 재생된 RM의 기원을 조사했습니다, in situ 잔류 대식세포의 증식 또는 조합. 새로 생성된 RM의 ~5%만이 hCD59를 발현했으며, 이는 다음을 시사합니다. in situ 증식은 재개체군에 최소한의 역할을 하며 대다수는 단핵구 모집(그림 2D). 이러한 결과는 이전 관찰 결과와 일치합니다⁹ RM 재생의 기저에 있는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 대식세포 틈새 고갈 후 단핵구 유래 보충의 우세를 강조합니다. 이 연구에서 제시된 대표적인 데이터는 이전에 보고된 결과와 일치합니다⁹ .

그림 1: 재조합 ILY 단백질의 SDS-PAGE 및 용혈 분석. (A) SDS-PAGE 겔 이미지는 정제된 재조합 인터메디신(ILY) 단백질을 보여줍니다. 54kDa의 예상 분자량에서 단일 띠를 볼 수 있어 ILY의 성공적인 발현 및 정제를 확인할 수 있습니다. 단백질의 순도는 명백하며, 주요 오염 띠는 관찰되지 않았습니다. 분자량 마커(ladder)가 참조용으로 포함되어 있으며, 이는 알려진 분자량에 대한 ILY 단백질의 올바른 위치를 보여줍니다. (B) 이 그래프는 hRBC에서 정제된 ILY의 용량 의존적 용혈 활성을 나타냅니다. 세포 용해 비율은 ILY 농도 증가에 대해 표시되며, IC50 또는 세포의 50%를 용해하는 데 필요한 농도는 7.224ng/mL로 측정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: ILY 주입 후 신장 상주 대식세포(RM)의 절제 및 재생. (A) 신장 조직의 단세포 현탁액에서 CD11b+F4/80^high cell로 정의되는 신장 대식세포(RM)를 식별하는 데 사용되는 게이팅 전략. 초기 게이팅은 파편, 이중선 및 사체 세포를 제외한 다음 CD11b+ 및 F4/80high 세포를 선택했습니다. (B) 기준선(0일차)과 1일차, 3일차, 7일차에 ILY 주입 후 RM(CD11b+F4/80^hi) 집단의 비율을 보여주는 유세포 분석 점도표 분석. (C) ILY(체중 120ng/g)의 정맥 투여(i.v.) 후 다양한 시점(0일, 1일, 3일, 7일)에서 신장당 RM 세포의 비율. Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^+/- 와 Cx3cr1CreER^+/-/ihCD59^-/- 마우스 간의 비교(n=3, 2개의 독립 실험, 양방향 ANOVA). (D) ILY 주사 후 0일째에 대조군에서 대조군에서, 7일째에 재생된 RM에서 신장 상주 대식세포에서 인간 CD59(hCD59)의 발현. 유세포 분석 결과 기존 RM 집단에 비해 재생된 RM에서 hCD59 발현이 감소한 것으로 나타났습니다(n = 3, 2개의 독립적인 실험, 쌍을 이루지 않은 t-검정). 데이터는 각 시점에서 그룹당 n=3 마우스로 진행한 두 개의 독립적인 실험을 나타냅니다. 결과는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되며 *p < 0.05는 통계적 유의성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: pTrcHis-A 박테리아 발현 벡터의 ILY 서열. 벡터에서 ILY의 5' 및 3' 경계 영역 시퀀스는 노란색으로 강조 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 서로 다른 조직에 걸친 CD11b + CX3CR1 + 세포의 타목시펜 유도 hCD59 발현 및 안정성 및 Cre 매개 재조합 효율의 검증. (A) 타목시펜 유도 후 15일 후 여러 장기에 걸친 hCD59 표지 CD11b+CX3CR1+ 대식세포의 유세포 분석 분석에서 신장 및 뇌에서 hCD59+ 대식세포의 안정적인 유지(~90%)를 보인 반면, 다른 조직에서는 발현이 5%≤. (B) 1일째 ILY 투여 후 미세아교세포는 영향을 받지 않았으며, ILY가 혈액뇌장벽을 통과하지 않음을 확인했다. (C) 타목시펜 유도 후 15일 및 30일에서 신장 상주 대식세포(KRM)에서 hCD59 발현의 안정성, 유세포 분석으로 평가. (D) CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- 마우스의 CRE 독립적 누출 평가. 비히클 처리(VC = 옥수수 오일) 마우스는 무시할 수 있는 CD11bintF480hihCD59+(0.93%) CD11b+CX3CR1+hCD59+ 개체군(1.8%)을 보인 반면, 타목시펜 처리한 마우스는 87%와 81%의 현저한 증가를 보였으며, 이는 타목시펜에 의해 유도된 효율적인 Cre 매개 재조합을 확인했다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

본 연구에서 His-tagged 재조합 ILY의 성공적인 발현, 정제 및 기능적 검증은 잘 확립된 프로토콜¹⁵을 따랐다. 그러나 이 과정에는 높은 단백질 수율, 순도 및 생물학적 활성을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되었습니다. E. coli BL21(DE3) 세포의 IPTG 유도는 봉입체 형성을 최소화하면서 단백질 발현 수준의 균형을 맞추기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 견고함에도 불구하고 수율과 기능을 극대화하기 위해 특정 수정 및 문제 해결 단계가 필요했습니다. 한 가지 주요 수정 사항은 IPTG 농도 및 유도 온도를 최적화하는 것인데, 이는 더 높은 온도에서 과도한 발현으로 인해 불용성 응집체가 생성되었기 때문입니다. 37°C에서 IPTG가 0.2mM에서 0.5mM로 단계적으로 증가하면 용해도가 크게 향상되었습니다. 또한, 정제 과정에서 세척 완충액의 이미다졸 농도를 신중하게 조정하여 비특이적 단백질 결합을 최소화하면서 효율적인 용리를 유지했습니다.

이 원고에서는 ILY-hCD59 시스템을 사용하여 신장 대식세포(RM)의 선택적 절제 및 후속 재생을 위한 매우 구체적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 접근법은 대식세포 생물학 및 재생을 연구하는 데 있어 특이성이 부족하거나 표적을 벗어난 효과를 유발하는 기존 절제 기법에 비해 고유한 이점을 제공합니다. 이 연구는 신장 항상성, 면역 조절 및 조직 복구에서 RM의 역할을 해부하기 위한 정확한 방법의 중요성을 강조합니다. RM은 신장 기능을 유지하고 면역 반응, 조직 복구 및 섬유증에 영향을 미치는 데 중요한 역할을 합니다. RM 조절 장애는 만성 염증 및 재생 장애를 포함한 여러 신장 병리학과 관련이 있습니다 11,17,18. 클로드로네이트 리포좀(clodronate liposome), 디프테리아 독소 수용체(diphtheria toxin receptor, DTR) 시스템 또는 유전자 녹아웃(genetic knockout)과 같은 대식세포 고갈에 대한 현재의 접근법은 특이성 부족, off-target 효과 또는 느린 세포사멸 유도와 같은 한계로 어려움을 겪는 경우가 많습니다¹⁹. 이러한 한계는 대식세포 재생 역학을 연구하는 능력을 복잡하게 만듭니다. 이와 대조적으로, ILY-hCD59 시스템은 hCD59 발현 CX3CR1+ RM의 빠르고 매우 특이적인 절제를 제공하여 신장 내 대식세포 틈새 재생을 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 중요한 것은 이전 연구에서 ILY-hCD59 상호 작용이 hCD59 발현이 결핍된 조직에서 off-target 효과를 생성하지 않는다는 것을 입증하여 이 프로토콜의 특이성과 재현성을 보장한다는 것입니다^13,14. 주목할 만한 것은, 건강한 쥐 신장에 대한 이전 연구에서는 RM의 두 가지 주요 하위 집합, 즉 Ccr2+RM과 Cd63+RM²⁰의 두 가지 주요 하위 집합이 있음을 보여주었습니다. 향후 연구에서 타목시펜 처리된 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/-에서 ILI가 이 두 집단을 어떻게 효율적으로 제거하는지 결정하는 것은 흥미로울 것입니다.

대식세포 고갈을 넘어, 이 시스템은 대식세포와 다른 신장 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하기 위한 다재다능한 도구를 제공합니다. 예를 들어, 세뇨관 상피 세포(TEX)는 손상 후 생존과 복구를 위해 대식세포 유래 신호에 의존합니다²¹. RM을 고갈시키고 재생하는 능력은 대식세포-TEC 크로스토크가 TEC 증식, 복구 및 전반적인 신장 기능에 어떤 영향을 미치는지 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다²². 또한, 이 프로토콜은 섬유증 조절에서 RM의 역할을 탐구하는 데 사용할 수 있으며, 여기서 전염증성 대식세포는 섬유형성에 기여하고 회복성 대식세포는 섬유증 해결을 지원합니다²³. 이러한 연구에서 얻은 통찰력은 만성 신장 질환에서 섬유증을 조절하는 것을 목표로 하는 대식세포 표적 치료법의 개발을 안내할 수 있습니다. 이 방법의 의미는 대식세포 생물학을 넘어 내피 세포 및 주피 세포를 포함한 다른 신장 세포 유형과의 RM 상호 작용 조사를 용이하게 하기 때문에 확장됩니다. 이 세포는 혈관 무결성을 유지하고 염증을 조절하는 데 중요합니다²⁴. ILY-hCD59 시스템은 RM 고갈과 재생이 신장 혈관 건강과 전반적인 신장 기능에 어떤 영향을 미치는지 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하여 신장 질환에서 대식세포 활성의 광범위한 영향을 엿볼 수 있는 창을 제공합니다.

ILY 기반 공핍 기술은 높은 특이성을 제공하지만 고유한 한계가 있습니다. 이 방법은 hCD59 발현에 의존하여 인간화 CD59를 발현하는 형질전환 모델에 대한 적용을 제한하고 비형질전환 마우스에 대한 일반화 가능성을 제한합니다. 또한, 입증된 바와 같이, ILY는 CX3CR1CreER^+/-/ihCD59^+/- (보충 그림 1B)에서 미세아교세포를 고갈시키지 않으며, ILY/hCD59 절제 도구는 미세아교세포 집단의 특정 조작에 사용할 수 없습니다. 또한, ILY는 hCD59+ 대식세포를 선택적으로 고갈시키지만, 신장 내의 뚜렷한 대식세포 하위 집합을 구별하지 않습니다.

ILY-hCD59 플랫폼은 신장에서의 유용성 외에도 다른 세포 유형의 재생 능력을 연구하는 데 광범위하게 적용할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 예를 들어, 이 시스템은 담관 세포를 제거하는 데 사용되어 담관 재생에 대한 조사를 가능하게 하고, 지방 세포를 표적으로 하며, 지방 세포 매개 간 손상에 대한 연구를 촉진합니다^25,26. 또한, 신장 삽입된 세포를 절제하는 데 사용되어 삽입된 세포 재생에 대한 연구를 촉진합니다²⁷. 이러한 응용 분야는 여러 장기 시스템에 걸쳐 세포 재생 및 조직 복구에 대한 이해를 발전시키는 데 있어 ILY-hCD59 시스템의 다양성을 강조합니다. 요약하면, ILY-hCD59 시스템은 대식세포 절제 프로토콜의 상당한 발전을 나타냅니다. 특이성, off-target 효과의 부재 및 RM 재생에 대한 자세한 연구를 용이하게 하는 능력은 신장 건강 및 질병에서 대식세포 생물학을 연구하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜에서 얻은 통찰력은 대식세포 기능에 대한 이해를 증진시킬 뿐만 아니라 신장 질환, 섬유증 및 다양한 조직 유형에서 세포 복구의 역학에 대한 치료 전략을 알려줄 것입니다.

저자들은 이 원고에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다. 재정적, 비재무적, 전문적 또는 개인적 제휴를 포함한 어떠한 이해 상충도 연구의 설계, 수행, 해석 또는 발표에 영향을 미치지 않았습니다.

우리는 이 연구에 사용된 프로토콜의 개발 및 개선에 기여한 Qin Lab의 전현직 구성원 모두에게 감사를 표합니다. 또한 이 연구에 중요한 역할을 한 재조합 ILY 플라스미드를 아낌없이 제공한 오클라호마 대학 보건 과학 센터의 R. K. Tweten 박사 그룹에도 감사드립니다. 이 연구는 NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881(X.Q.) 및 R21OD024931(X.Q.) 보조금을 통해 미국 국립보건원(NIH)의 지원을 받았습니다.